一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法

摘要

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法，所述引物探针组包括检测ALDH2*2的引物、野生型探针和突变型探针；所述试剂盒，包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照；所述扩增反应试剂包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

说明书

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，具体为一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法。

背景技术

人乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是乙醛脱氢酶的1个亚类，可催化乙醛氧化为乙酸。ALDH2与亚洲人群最为密切的是ALDH2*2突变(rs671，1510G>A)，突变率高达30％～50％。携带ALDH2*2突变基因的个体ALDH2酶活性下降，其中ALDH2*1/*2个体的酶活性仅为ALDH2*1/*1个体的10％，而ALDH2*2/*2个体的酶活性完全缺失。

ALDH2基因与酒精在人体内的分解代谢有关，还参与硝酸甘油的代谢。研究显示ALDH2基因型可影响饮酒者对乙醇的敏感性和耐受性，突变型基因ALDH2*2能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌症等疾病之间存在深刻的联系。还有研究发现，ALDH2是催化硝酸甘油代谢成有扩血管作用的一氧化氮(NO)的关键酶，如果患者基因携带ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2，则硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，难以发挥药物作用，必须调整治疗方案。因此，根据ALDH2基因型制定患者的个体化治疗方案具有重要意义。

迄今为止，已报道的ALDH2基因多态性位点检测的方法有多种，包括PCR产物限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、荧光定量PCR、DNA直接测序、高分辨率溶解曲线(HRM)和基因芯片技术等，但这些方法步骤多、耗时长、要求高，难以用于临床常规检测。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Mediated Amplification,RMA)技术是一种核酸等温扩增技术，主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶。RMA反应可以在37～42℃进行，整个过程在30min内即可达到检测水平。锁核酸(LockedNucleic Acid，LNA)探针是选择性地将探针中的一些碱基修饰成LNA碱基，大大提高了探针与目的序列的亲和力，提高了探针的Tm值。LNA探针比传统的DNA探针有更高的灵敏度、稳定性和特异性，是一种更为可靠的检测基因分型的方法。

本发明采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)进行ALDH2基因多态性检测，更加快速、简便，能够提高单碱基突变检测的特异性和灵敏度。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本申请提供了一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及检测方法，本申请是通过下述方案实现的：

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的引物探针组，包括检测ALDH2*2的引物、野生型探针和突变型探针，其中，

上游引物：5’-ATTACAGGGTCAACTGCTATGATGTGTTTGGA-3’；

下游引物：5’-GTCTTTACCCTCTCTTGTCACTTCTCAGGCTTA-3’；

野生型探针：

突变型探针：

优选的，所述探针的修饰基团有荧光基团和淬灭基团，所述淬灭基团修饰在THF3’端的T碱基上，荧光基团修饰在SNP位点的5’端T碱基上或SNP位点互补碱基的5’端T碱基上。

优选的，所述荧光基团用FAM或ROX修饰，所述淬灭基团用BHQ修饰。

优选的，所述探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。

优选的，所述探针覆盖SNP位点，在探针的SNP位点上做锁核酸(LNA)修饰。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，包括含有扩增反应试剂的检测管、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照。

所述扩增反应试剂包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

优选的，所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL。

优选的，所述阳性对照为ALDH2*2野生型质粒和突变型质粒。

优选的，所述阴性对照为无菌双蒸水。

优选的，所述试剂盒可用于检测的样品为人全血、外周血样本。

一种基于锁核酸修饰的RMA法检测ALDH2基因多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA作为模板；

(2)设计用于ALDH2*2基因多态性检测的引物对及探针；

(3)以提取的待测样本DNA作为模板，加入上述试剂盒中的反应试剂进行RMA扩增反应。扩增反应条件为在实时恒温荧光检测器中39℃下扩增20分钟；

(4)检测结果判定：

对于野生纯合型样本，只有野生型探针产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；对于突变纯合型样本，只有突变型探针产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；对于突变杂合型样本，突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。

有益效果：(1)本发明能够快速的检测ALDH2*2基因位点的多态性，具有极高的灵敏度和特异性；(2)采用锁核酸修饰的重组酶介导的等温扩增法(LNA-RMA法)，反应可以在37～42℃进行，对仪器设备的要求不高，操作简单，在30min内即可得到结果；(3)整个反应过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能；(4)扩增反应试剂采用冻干工艺，提高试剂稳定性，降低运输成本；(5)用锁核酸修饰探针能够提高单碱基突变的检测特异性，比传统的DNA探针有更高的灵敏度，适用于基因分型检测。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1 ALDH2*2野生纯合型样本检测结果；

图2 ALDH2*2突变纯合型样本检测结果；

图3 ALDH2*2突变杂合型样本检测结果。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

1、引物和探针的设计

基于ALDH2*2基因突变序列或其互补序列设计的LNA-RMA检测引物和探针如下表1所示：

表1 ALDH2*2基因引物与探针序列

注：LNA修饰的突变位点碱基用斜体加粗加下划线表示；ALDH2*2的野生型探针的荧光基团用FAM修饰；ALDH2*2的突变型探针的荧光基团用ROX修饰；ALDH2*2的野生型探针和突变型探针的淬灭基团都用BHQ修饰。

2、样本的提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA作为模板；

3、RMA反应体系的建立

将42.5μL缓冲液和5μL提取的待测样本DNA加入到含有扩增反应试剂的检测管中并混匀，最后向管中加入2.5μL的280mM醋酸镁溶液并混匀，在39℃下在实时恒温荧光检测器中扩增20分钟；

其中，所述扩增反应试剂包括ALDH2*2上下游引物、ALDH2*2野生型和突变型探针、大肠杆菌RecA蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚环氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸；

所述引物对及检测探针组在扩增体系中的终浓度分别为10μM；所述聚环氧乙烷的终浓度为10％w/v；所述海藻糖的终浓度为2mM；所述甘露醇的终浓度为2.5mM；所述ATP的终浓度为10mM；所述dNTPs的终浓度为2mM；所述肌酸激酶的终浓度为1000ng/mL；所述磷酸肌酸的终浓度为25mM；所述大肠杆菌RecA蛋白的终浓度为100ng/μL；所述UvsY蛋白的终浓度为40ng/μL；所述单链结合蛋白GP32的终浓度为800ng/μL；所述Bst聚合酶的终浓度为60ng/μL；所述核酸外切酶III的终浓度为80ng/μL；

所述阳性对照为ALDH2*2野生型质粒和突变型质粒；

所述阴性对照为无菌双蒸水；

4、检测结果判定：

通过实时恒温荧光检测器上显示的荧光信号判断所检测的ALDH2*2基因多态性位点。图1显示该样本为ALDH2*2 GG野生纯合型样本，仅野生型探针产生荧光信号，突变型探针无荧光信号；图2显示该样本为ALDH2*2 AA突变纯合型样本，仅突变型探针产生荧光信号，野生型探针无荧光信号；图3显示该样本为ALDH2*2 GA突变杂合型样本，野生型探针和突变型探针都产生荧光信号。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

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