用于检测ST11型Hv-CRKp的试剂盒、核酸试剂及系统

摘要

本公开涉及用于检测分子标志物的试剂在制备用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒中的用途、用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒、核酸试剂及系统，其中，所述分子标志物包括plt‑1基因，所述plt‑1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本公开将plt‑1基因作为ST11型Hv‑CRKp检测的特异性新型高毒力基因，将其作为ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌高毒力检测的分子标志物，通过识别ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中是否存在plt‑1基因，能够准确区分ST11型Hv‑CRKp与传统的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌。

说明书

技术领域

本公开涉及生物医药技术领域，具体地，涉及用于检测分子标志物的试剂在制备用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒中的用途、用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒、核酸试剂及系统。

背景技术

ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(ST11型Hv-CRKp)是ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的变种菌株，具体地，其是由传统的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌获得一个约170kb的pLVPK-like毒力质粒后形成，可导致高致病率和高死亡率。然而，现有技术中，尚缺少能够快速、准确地区分ST11型Hv-CRKp与传统的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的方法。

发明内容

本公开的目的是提供用于检测分子标志物的试剂在制备用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒中的用途、用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒、核酸试剂及系统。

为了实现上述目的，本公开提供用于检测分子标志物的试剂在制备用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标志物包括plt-1基因，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，所述用于检测分子标志物的试剂包括能够特异性扩增所述plt-1基因的引物，和/或能够与所述plt-1基因特异性杂交的探针。

可选地，所述引物包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本公开还提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中，该试剂盒中含有用于检测分子标志物的试剂，所述分子标志物包括plt-1基因，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，所述用于检测分子标志物的试剂包括能够特异性扩增所述plt-1基因的引物，和/或能够与所述plt-1基因特异性杂交的探针。

可选地，所述引物包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本公开还提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的核酸试剂，其中，该核酸试剂包括用于检测plt-1基因的引物，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述引物包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本公开还提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的系统，其中，该系统包括测序装置、计算装置和输出装置；

所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；

所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：

若所述总核酸序列中含有plt-1基因序列，则判定所述待测样本中存在ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，其中，所述plt-1基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。

可选地，所述系统还包括核酸提取装置，所述核酸提取装置用于对所述待测样本进行核酸提取，得到所述待测样本的总核酸；

优选地，所述核酸提取装置包括核酸提取仪和/或核酸提取试剂盒。

可选地，所述测序装置包括Sanger测序平台、Illumina Novaseq、HiSeq Xten、HiSeq 2500/2000/4000测序平台中的至少一种。

通过上述技术方案，本公开将plt-1基因作为ST11型Hv-CRKp检测的特异性新型高毒力基因，将其作为ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌高毒力检测的分子标志物，通过检测ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中是否存在plt-1基因，能够准确识别出ST11型Hv-CRKp。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是本公开实施例中9株ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的二代测序结果图；

图2是本公开实施例中plt-1阳性组菌株、plt-1阴性组菌株和对照组菌株处理的大蜡螟幼虫存活率随时间变化的折线图。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供用于检测分子标志物的试剂在制备用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒中的用途，其中，所述分子标志物包括plt-1基因，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本公开的发明人发现，plt-1阳性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌较之plt-1阴性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌具有更高的毒力，因此，可以将plt-1基因作为ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌具备高毒力的分子标志物，也即plt-1基因是ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(Hv-CRKp)所特有的新型高毒力基因，因此，针对ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌进行plt-1基因的识别检测，能够准确识别出ST11型Hv-CRKp。

其中，plt-1基因的序列为：

atgattcaaaaagcaaatcagcaaaaacttgtttttgcgtggggtgtggtgcttttggtggtgagaaccaccaacctgttgagcctttttgtggagtgggttaaattatttacggataaagtcaccagaggtggaaaaatgaaaaaatggatgttagcaatctgcctgatgtttataaatgggatctgcgaagccgccgattgctttgatcttgcaggtcgggattacaaaatagacccggatttactgagagcgatatcatggaaagaatcccgttaccgggttaatgccatcggtattaatccggtaacgggatatggcagcggactgatgcaggtagattcccagcattttaacgaactggcccgctatggaattaagccggaacatctgacaacagatccctgtatgaacatttataccggtgcttattatctggcaatagcctttaaaaaatggggcgtctcctgggaggccgttggtgcatacaatgccggattcaggaagaccgaacgccagaaccagagacgtcttgcctacgcatcagaggtttaccggatttatacctggataaagagcagtaaaggcatccgggttccgaccacgaagaaatcactttcccaaattaacagtgtgcagaaaaattaa。

根据本公开，所述用于检测分子标志物的试剂可以在一定的范围内选择，能够用于plt-1基因检测的试剂均可用于本公开。示例性地，所述用于检测分子标志物的试剂可以包括能够特异性扩增所述plt-1基因的引物，和/或能够与所述plt-1基因特异性杂交的探针。在本公开的一个优选实施例中，所述引物例如可以包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

其中，SEQ ID NO.2所示的引物序列可以为：GGCGGCCCTAATATATCCAA；SEQ ID NO.3所示的引物序列可以为：AAATATTGTGCCCGCGAAAA。

本公开第二方面提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的试剂盒，其中，该试剂盒中含有用于检测分子标志物的试剂，所述分子标志物包括plt-1基因，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

可选地，所述用于检测分子标志物的试剂可以包括能够特异性扩增所述plt-1基因的引物，和/或能够与所述plt-1基因特异性杂交的探针。

可选地，所述引物可以包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

在本公开中，具体地，所述试剂盒中还可以含有反应体系缓冲液、空白对照品、阴性对照品、阳性对照品和水等成分中的至少一种，其中，上述各成分可以单独存放在所述试剂盒中，也可以以混合物的形式存放在所述试剂盒中。上述试剂盒可以具有多种不同的规格，例如，上述试剂盒可以为针对单份待测样品的试剂盒，也可以为针对多份待测样品的试剂盒。

本公开第三方面提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的核酸试剂，其中，该核酸试剂可以包括用于检测plt-1基因的引物，所述plt-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物例如可以包括如SEQ ID NO.2～3所示的引物对。

本公开第四方面提供用于检测ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的系统，其中，该系统包括测序装置、计算装置和输出装置；所述测序装置用于对待测样本的总核酸进行核酸序列测序，得到总核酸序列；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：若所述总核酸序列中含有plt-1基因序列，则判定所述待测样本中存在ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，其中，所述plt-1基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述输出装置用于输出所述计算装置的判定结果。

可选地，所述系统还可以包括核酸提取装置，所述核酸提取装置用于对所述待测样本进行核酸提取，得到所述待测样本的总核酸；优选地，所述核酸提取装置可以包括核酸提取仪和/或核酸提取试剂盒。

可选地，所述测序装置例如可以是二代测序装置，例如，所述测序装置可以包括Sanger测序平台、Illumina Novaseq、HiSeq Xten、HiSeq2500/2000/4000测序平台中的至少一种。

下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。

实施例1

本实施例用于说明plt-1基因存在于ST11型Hv-CRKp中。

共收集9株ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，然后分别利用这些菌株进行大蜡螟幼虫感染实验，根据实验结果，将这些菌株分为ST11型高毒力碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(Hv-CRKp)和传统ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKp)。

大蜡螟幼虫感染实验按照如下操作进行：

利用各菌株，制备得到浓度为1×10

根据大蜡螟幼虫感染实验结果，将菌株分为两组，其中，组一包含8株ST11型Hv-CRKp，组二包含1株传统ST11型CRKp。

利用DNA提取试剂盒对上述两组菌株进行DNA提取，得到各菌株所对应的总DNA。对各菌株的总DNA进行二代Hiseq测序，测序结果如图1所示。

测序结果显示：组一中的各菌株的总DNA测序结果中均存在如SEQ ID NO.1所示的序列，组二中的各菌株的总DNA测序结果中不存在如SEQ ID NO.1所示的序列。

由此可知，plt-1基因存在于ST11型Hv-CRKp中，plt-1基因能够作为ST11型Hv-CRKp的高毒力基因，将其作为检测ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌是否具备高毒力的分子标志物，能够有效提升鉴别ST11型Hv-CRKp和传统ST11型CRKp的准确性。

实施例2

本实施例用于验证plt-1阳性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌较之plt-1阴性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌具有更高的毒力。

收集60株ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，利用DNA提取试剂盒对各菌株进行DNA提取，得到各菌株所对应的总DNA，然后利用SEQ ID NO.2～3所示的引物对分别对各菌株的总DNA进行扩增，并对扩增结果进行凝胶电泳检测，得到各菌株对应的凝胶电泳图。对各菌株的凝胶电泳图进行识别，当凝胶电泳图中存在900bp附近的条带时，判定对应菌株中存在plt-1基因。根据菌株中是否存在plt-1基因，将菌株分为plt-1阳性组和plt-1阴性组。本实施例中，plt-1阳性组的菌株数量为43株，plt-1阴性组的菌株数量为17株。

分别对plt-1阳性组菌株和plt-1阴性组菌株的总DNA进行二代测序，并对测序结果进行筛查，进一步确定各菌株中是否存在plt-1基因。测序结果显示，plt-1阳性组的所有菌株中均存在plt-1基因，plt-1阴性组的所有菌株中均不存在plt-1基因，这说明SEQ IDNO.2～3所示的引物对能够特异性扩增plt-1基因。

选取高毒力肺炎克雷伯菌K2044作为对照组菌株，然后分别利用上述plt-1阳性组菌株、plt-1阴性组菌株和对照组菌株进行大蜡螟幼虫感染实验，记录各组菌株处理的大蜡螟幼虫的存活率随时间变化的情况。

其中，大蜡螟幼虫感染实验的操作方法与实施例1相同，各组菌株处理的大蜡螟幼虫存活率随时间变化的情况如图2所示。

由图2可以看出，plt-1阳性组菌株处理的大蜡螟幼虫的存活率明显低于plt-1阴性组菌株，而且随着实验的进行，plt-1阳性组菌株处理的大蜡螟幼虫的存活率逐渐与对照组菌株相同，这说明plt-1阳性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌较之plt-1阴性的ST11型碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌具有更高的毒力，而且其毒力与高毒力肺炎克雷伯菌K2044的毒力相当。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 用于检测ST11型Hv-CRKp的试剂盒、核酸试剂及系统

<130> 17949PUMC

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgattcaaa aagcaaatca gcaaaaactt gtttttgcgt ggggtgtggt gcttttggtg 60

gtgagaacca ccaacctgtt gagccttttt gtggagtggg ttaaattatt tacggataaa 120

gtcaccagag gtggaaaaat gaaaaaatgg atgttagcaa tctgcctgat gtttataaat 180

gggatctgcg aagccgccga ttgctttgat cttgcaggtc gggattacaa aatagacccg 240

gatttactga gagcgatatc atggaaagaa tcccgttacc gggttaatgc catcggtatt 300

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ctggcccgct atggaattaa gccggaacat ctgacaacag atccctgtat gaacatttat 420

accggtgctt attatctggc aatagccttt aaaaaatggg gcgtctcctg ggaggccgtt 480

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gcatcagagg tttaccggat ttatacctgg ataaagagca gtaaaggcat ccgggttccg 600

accacgaaga aatcactttc ccaaattaac agtgtgcaga aaaattaa 648

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcggcccta atatatccaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaatattgtg cccgcgaaaa 20