一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法

摘要

本发明一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法，先用QuEChERS前处理方法得到提取液，再在超高效液相色谱‑四极杆静电场轨道离子阱质谱进行测定11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征断裂片段，同时获得对应标准物的色谱峰、全扫描质荷比、二级特征断裂片段和断裂途径，将呈正态分布的色谱峰与色谱峰对比，再得到每个色谱峰对应物质的分子式，用每个待检测物的色谱峰峰面积与相应物质的色谱峰峰面积比值乘相应物质的标准溶液浓度，得到提取液中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，最后得到羊肉中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，完成对羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及药物及其代谢产物检测技术领域，具体为一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法。

背景技术

随着人们饮食中肉制品的增加，羊肉因具有高蛋白、低脂肪、维生素及微量元素含量丰富的特点，在市场上深受广大消费者的喜爱。肉制品工业链各个环节间联系密切，包含饲料培养、羊的养殖、肉制品加工、终端销售的多个环节，农药残留污染是影响肉制品品质的重要因素。氯化烟碱类药物及其代谢产物均含有硝基亚甲基杂环结构，具有显著的杀虫活性，选择性强等特点，被广泛用于动物饲料的培养种植中，氯化烟碱类药物及其代谢产物最终通过食物链传递及生态富集作用传递到羊肉中。

用于动物源性食品中氯化烟碱类药物的检测方法主要有液相色谱(LC)法、液相色谱－串联质谱(LC-MS)法、气相色谱－串联质谱(GC-MS)法等。目前应用液相色谱－串联质谱技术可以实现动物源性食品中氯化烟碱类药物的准确定量，但无法实现其代谢物的高通量定性定量分析。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法，高选择性、高通量定性定量分析、扫描速度快、检测灵敏度高、简便，为氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测提供了新的方法。

本发明具体技术方案如下：

一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：

步骤1，将羊肉形成的匀浆后用乙腈的乙酸溶液进行涡旋，得到混合体系A，在混合体系A中加入无水硫酸镁、乙酸钠涡旋后振荡提取，得到提取液，将提取液离心后得到混合体系B；

步骤2，在混合体系B中加入乙二胺-N-丙基硅胶、十八烷基三氯硅烷和MgSO

步骤3，将提取液用乙酸铵溶液稀释后过滤，过滤后的溶液在超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱中进行测定，得到羊肉中11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征断裂片段，11种氯化烟碱类药物及其代谢产物分别为吡虫啉、吡虫啉尿素、五羟基吡虫啉、烟碱吡虫啉、啶虫脒、啶虫脒-代谢物-IM-1-4、啶虫脒-代谢物-IM-1-2、啶虫脒-代谢物-6-氟烟酸、啶虫脒-代谢物-IM-2-1、呋虫胺和呋虫胺-代谢物-UF；

将11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准溶液用乙酸铵溶液稀释后，得到对应的稀释液，所有的稀释液分别在超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱中进行测定，获得对应物质的色谱峰、全扫描质荷比、二级特征断裂片段和断裂途径，所有物质的色谱峰、全扫描质荷比、二级特征断裂片段形成标准物质数据库；

步骤4，将步骤3得到的色谱峰一一进行提取，得到对应的呈正态分布的色谱峰，将每个呈正态分布的色谱峰与标准物质数据库中的色谱峰进行对比，得到每个所述色谱峰对应的物质的类别，再通过步骤3得到的色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征断裂片段与标准物质数据库中色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征断裂片段，以及断裂途径进行比对，得到每个所述色谱峰对应的物质的分子式，完成对步骤3中色谱峰与对应氯化烟碱类药物及其代谢产物的一一对应；

步骤5，用每个待检测物质对应的色谱峰的峰面积与相应物质的色谱峰的峰面积比值乘以相应物质的标准溶液浓度，得到提取液中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，最后用如下公式得到羊肉中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，完成对羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测；

c

优选的，步骤1中羊肉、无水硫酸镁和乙酸钠的质量比为(5～10):(5～6):(2～3)；步骤2中乙二胺-N-丙基硅胶、十八烷基三氯硅烷、MgSO

优选的，步骤1中所述的乙腈的乙酸溶液中乙腈与乙酸的体积比为1％，乙腈的乙酸溶液与羊肉的比例为(5～20)mL:(5～10)g。

优选的，步骤3中超高效液相色谱选取Accucore aQ，具体条件如下所示，超高效液相色谱的柱温为50～55℃，喷雾电压为4～5kV，离子源温度为60～65℃，毛细管温度为325～375℃；

四极杆静电场轨道离子阱质谱采用两级扫描方式，二级扫描方式为可变的数据非依赖采集，扫描时间为0～20min；分辨率采用95000FWHM，分为两个质量扫描片段：m/z＝150-550设定为第一个扫描，隔离窗口范围设为54Da，相应循环计数设定为9个，m/z＝600-900设为第二个扫描，隔离窗口范围设为104Da，相应循环计数设定为4个。

进一步，超高效液相色谱条件中，流动相A为甲酸、甲酸铵和水组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mM，流动相B为甲酸、甲醇和甲酸铵组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mM；

梯度洗脱程序为0～1min内，流动相A的体积比例为80％；1～10min内，流动相A的体积比例由80％线性减小至0；10～14min内，流动相A的体积比例为0；14～16min内，流动相A的体积比例由0线性增加至80％；16～20min内，流动相A的体积比例为80％，流速为0.3～0.5mL/min。

再进一步，超高效液相色谱条件中，鞘气流速为55～60arb，辅助气流速为40～45arb，气帘气流速为5～8arb，加热温度为325～375℃。

再进一步，四极杆静电场轨道离子阱质谱中，碰撞能量分别为20.0eV，35.0eV和50.0eV。

优选的，步骤3将对应的稀释液在数据依赖扫描模式下进行二级扫描，其他的测定条件与提取液相同。

优选的，步骤3在获得11种氯化烟碱类药物及其代谢产物各自对应的二级特征断裂片段时，选择离子碎片间信号强度比大于15％来区分同类药物的二级特征断裂碎片。

优选的，步骤4标准物质数据库中所述的二级特征断裂片段为二级特征断裂片段丰度比和二级特征断裂片段质荷比。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

本发明一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法，先利用QuEChERS前处理方法对羊肉匀浆中的固体样品经过乙腈萃取，通过分散基质萃取去除乙腈中存在的大部分干扰物，萃取液就能直接进行质谱分析，之后利用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱对11种氯化烟碱类药物及其代谢产物标准物质化合物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征断裂片段进行采集，并建立11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准数据库，再利用色谱峰、全扫描质荷比和二级特征断裂片段，和标准物质数据库完成色谱峰与对应氯化烟碱类药物及其代谢产物的一一对应，用每个待检测物质对应的色谱峰的峰面积与相应物质的色谱峰的峰面积比值乘以相应物质的标准溶液浓度，得到提取液中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，最后得到羊肉中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，完成对羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测，构建了羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的非定向筛查方法，可实现羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物精确定性和准确定量，具有峰容量大、精密度与准确度高、精准定性的特点，降低了分析物中药物的损失，可得到高的药物回收率，具有重要的应用价值。本发明对羊肉进行非定向药物筛查，可鉴定及筛选出羊肉中未知的药物，从而实现精准筛选及大量数据的高通量分析，适用于目前对于羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的监测。

附图说明

图1为本发明所述的超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱对测定氯化烟碱类药物啶虫脒的质谱图；

图2为本发明所述的啶虫脒的断裂机理图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明原理及优势进行解释和说明，以便本领域技术人员更好的理解本发明。下述说明仅是示例性的，并对其内容进行限定。

本发明一种羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测方法，所用仪器、试剂和溶液的配制，如下所示，

1.仪器

Vortex.Genie 2T型旋涡混合器(美国Scientific Industries公司)；Avnti J-26×PI型高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱，配备有离子源(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Thermo HypersilGoldAccucore aQ色谱柱(美国Thermo Fisher Scientific公司)；调速多用振荡器；分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；旋涡混合器(IKA公司)。

2.试剂

羊肉、LC-MS级乙腈、甲酸铵、甲酸、乙酸铵、冰醋酸(美国Sigma公司)、0.22μm微孔滤膜(美国Pall公司)、优级纯无水硫酸镁，醋酸钠(美国Supelco公司)、氯化烟碱类药物及其代谢产物相关化学品标准物质(德国Sigma-Aldrich公司及德国Dr.Erenstofer公司)。

3.溶液的配制

11种氯化烟碱类药物及其代谢产物具体指吡虫啉和吡虫啉尿素、五羟基吡虫啉、烟碱吡虫啉；啶虫脒和啶虫脒-代谢物-IM-1-4、啶虫脒-代谢物-IM-1-2、啶虫脒-代谢物-6-氟烟酸、啶虫脒-代谢物-IM-2-1；呋虫胺和呋虫胺-代谢物-UF。

分别称取11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准物质各1.0mg(精确至0.01mg)，置于10mL容量瓶，依据标准物质在不同溶剂(正己烷、丙酮和乙腈)中溶解度及测定需要，选择对应的溶剂溶解并定容至10mL，配制成100mg/L单一化合物标准储备液，于-15℃下避光保存。移取单一化合物标准储备液各0.5mL于100mL容量瓶中，用乙腈-水溶液(1:1，v/v)稀释并定容至刻度，配制相应浓度的标准溶液。标准溶液置于棕色密闭瓶-15℃避光保存。本发明所用所有标准溶液现用现配。

具体检测方法包括以下步骤：

1，采用QuEChERS前处理方法处理羊肉样品；

具体步骤为：

称取羊肉样品5～10g(精确至0.01g),切碎，研磨成匀浆。

将匀浆置于50mL离心管中，加入15～20mL 1％乙腈乙酸溶液(乙腈与乙酸的体积比为1％)，涡旋1～3min后加入5～6g无水硫酸镁、2～3g乙酸钠，涡旋混合1～3min后振荡提取2～5min，在2000～4000rpm下离心5～10min(0～5℃)。

取2～5mL上清液于15mL聚丙烯离心管中，加入300～400mg固体分散净化剂PSA(即乙二胺-N-丙基硅胶，吸附中等极性和极性的杂质)、200～400mg固体分散净化剂C18(即十八烷基三氯硅烷，吸附反相固体吸附剂，吸附脂类等非极性杂质)和600～800mg MgSO

QuEChERS前处理方法机理是肉制品匀浆中的固体样品经过乙腈萃取，接着通过分散基质萃取去除乙腈中存在的大部分干扰物，萃取液就能直接进行质谱分析，是一种有效分离痕量农残的方法。

本发明在具体实施时，在以上数据中采用了最优的数据进行，由于本身范围较小，固没有提供其他数据，具体如下。

称取羊肉样品5g(精确至0.01g),切碎，研磨成匀浆。

将匀浆置于50mL离心管中，加入20mL 1％乙腈乙酸溶液(乙腈与乙酸的体积比为1％)，涡旋1min后加入6g无水硫酸镁、2g乙酸钠，涡旋混合1min后振荡提取2min，在3000rpm下离心5min(3℃)。

取2mL上清液于15mL聚丙烯离心管中，加入300mg固体分散净化剂PSA、200mg固体分散净化剂C18和800mg MgSO

2，采用高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱仪对氯化烟碱类药物及其代谢产物进行测定；

取500μL提取液与500μL 0.2M乙酸铵溶液，这样以1：1(v/v)对提取液进行稀释，以加强离子化，称取154g的乙酸铵溶于1L的纯化水中就得到0.2mol/L乙酸铵溶液，经0.22μm有机微孔膜过滤，得到的待测样品导入进样小盘中进样，利用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱采集11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的色谱峰、全扫描质荷比和二级特征断裂片段。

色谱测定条件如下：

色谱柱为Accucore aQ，是一种UHPLC保护柱，(规格为10mm×2.1mm，2.6μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)。柱温为50～55℃。流动相A为甲酸、甲酸铵和水组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mM，流动相B为甲酸、甲醇和甲酸铵组成的混合溶液，其中甲酸占混合溶液总体积的0.1％，甲酸铵的浓度为4mM。梯度洗脱程序为0～1min内，流动相A的体积比例为80％；1～10min内,流动相A的体积比例由80％线性减小至0；10～14min内,流动相A的体积比例为0，14～16min内，流动相A的体积比例由0线性增加至80％；16～20min内，流动相A的体积比例为80％，流速为0.3～0.5mL/min。碰撞气为高纯氮气(纯度为99.99％)，离子源为电喷雾离子源，化合物采用正模式测定，鞘气流速为55～60arb，辅助气流速为40～45arb，气帘气流速为5～8arb，喷雾电压为4～5kV，离子源温度为60～65℃，毛细管温度为325～375℃，加热温度为325～375℃，进样量为10μL。

本发明在具体实施时，在以上数据中采用了最优的数据进行，由于本身范围较小，固没有提供其他数据，具体如下。

柱温为50℃。鞘气流速为55arb，辅助气流速为40arb，气帘气流速为5arb，喷雾电压为4kV，离子源温度为65℃，毛细管温度为375℃，加热温度为375℃。

质谱测定条件如下：

一级扫描方式：全扫描模式下，分辨率为95,000FWHM，自动增益控制的目标值设定为8.0×10

二级扫描模式为可变的数据非依赖采集，英文名称为Variable DataIndependent Acquisition，简写为vDIA，扫描时间为0min～20min，分辨率采用95,000FWHM，最大注入时间为100ms，自动增益控制的目标值设为3.0×10

3，11种氯化烟碱类药物及其代谢产物标准物质数据库的建立

将11种氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准溶液稀释配制成浓度为500μg/L的溶液，分别取500μL溶液与500μL 0.2M乙酸铵溶液，这样以1：1(v/v)对提取液进行稀释，用于标准物质数据库的信息采集，氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准物质数据库包含色谱峰、全扫描质荷比、二级特征断裂片段、分子式；二级特征断裂片段涵盖了二级特征断裂片段丰度比、二级特征断裂片段质荷比，色谱峰涵盖了保留时间、峰面积和峰宽，平行进样分析6次，色谱-质谱的测定条件仅二级扫描方式不同于稀释后的提取液，以实现氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准物质数据库的准确性及重现性。

首先采集各个标准物质的全扫描色谱、全扫描质谱图、二级断裂色谱、二级断裂质谱图。在数据依赖扫描模式的二级扫描方式下1秒3次扫描后，通过低(20eV)、中(35eV)、高(50eV)三种不同碰撞能量碰撞裂解，标准物质碰撞裂解离子谱图通过不同碰撞能量级质谱信息的归一化结果得到。通过选择氯化烟碱类药物及其代谢产物离子碎片间信号强度比大于15％来区分同类药物的二级断裂碎片作为定量信息。

基于实测断裂信息的分析结果，建立氯化烟碱类药物及其代谢产物的标准物质数据库，包括了正离子和负离子模式下4种加合物形式([M-H]

具体通过对断裂途径及机理研究得到二级特征断裂片段，将二级特征断裂片段应用于羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物筛查中，从而建立非定向筛查方法。

(1)断裂途径与机理研究

本发明对11种氯化烟碱类药物及其代谢产物进行了断裂片段机理分析，得到了所有断裂片段的反应途径。以啶虫脒为例，啶虫脒的高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱图如图1所示。

化合物失去一个电子的所形成的离子为奇电子离子，奇电子离子包含两个活化中心，该化合物的断裂机理主要为重排反应(即rH

C

(2)二级特征断裂片段

啶虫脒的分子式为C

4，非定向筛查方法具体步骤为：

将二级特征断裂片段与标准氯化烟碱类药物及其代谢产物数据库相结合用于羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的筛查中。

运用标准数据库中氯化烟碱类药物及其代谢产物的二级特征断裂片段及全扫描质荷比进行峰提取，分析其中呈正态分布的色谱峰；与标准氯化烟碱类药物及其代谢产物数据库中的色谱峰进行对比，首先判断该物质的类别，然后通过色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征断裂片段与标准物质数据库中色谱峰的保留时间、全扫描质荷比、二级特征断裂片段，以及断裂途径进行比对，推测该化合物的结构式与分子式，完成对色谱峰与对应氯化烟碱类药物及其代谢产物的一一对应。最后运用标准分析物的色谱及质谱信息进行定量与定性。分析物浓度由羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物与标准分析物的峰面积比乘标准分析物浓度计算可得。用如下公式得到羊肉中每个氯化烟碱类药物或其代谢产物的浓度，完成对羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的检测；

c

推测出该分析物的分子式为C

5，方法学考察

a方法的标准曲线、线性范围及相关系数

配制氯化烟碱类药物及其代谢产物基质匹配标准物质溶液，浓度分别为2μg/kg、5μg/kg、8μg/kg、11μg/kg、15μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、80μg/kg、200μg/kg、500μg/kg。绘制标准分析物校准曲线时，纵坐标y表示氯化烟碱类药物及其代谢产物色谱峰峰面积，x表示标准分析物浓度(μg/kg)。结果显示，本发明中氯化烟碱类药物及其代谢产物在各自相应的浓度范围内，相关系数均大于0.99，呈良好的线性关系。

b发明的检测限、定量下限、相对标准偏差与回收率

定量下限与检测限通过检测容量(即CCβ)和确定限(即CCα)考察。检测容量和确定限，如表1所示，分别为0.08μg/kg～0.63μg/kg与0.03μg/kg～0.32μg/kg。通过平均回收率与其12次平行实验结果的相对标准偏差评价发明的准确性，通过在羊肉样品中添加CCβ，2倍CCβ和4倍CCβ三个浓度水平的氯化烟碱类药物及其代谢产物的混合标准物质溶液，运用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱检测，计算氯化烟碱类药物及其代谢产物的相对标准偏差与平均回收率。最终最高的相对标准偏差与平均回收率结果，如表2所示，分别为5％～7.6％和83％～111％，本方法的准确性和精密度可满足羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物非定向筛查的需要。

表1方法的线性范围、相关系数和检测容量、确定限

表2方法的CCβ，2倍CCβ和4倍CCβ三个浓度水平的相对标准偏差与平均回收率

6)实际样品检测

采用本发明所建立的超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱高分辨质谱快速筛查方法，筛查121个批次羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物。结果表明，本方法可用于羊肉中氯化烟碱类药物及其代谢产物的快速筛查。

结果显示所有潜在目标化合物在各自相应的浓度范围内，相关系数r