高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用

摘要

本发明公开了一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用，本发明以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为底盘细胞，异源表达来在梭菌的7α‑HSDH和7β‑HSDH编码基因，旨在实现将CDCA为底物生物合成UDCA。目前，底物CDCA的转化率达到80％。

说明书

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。

熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid,UDCA)是传统的中药的有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，在治疗胆结石、促进肝移植、胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化和药物诱发的肝炎，有非常好的疗效，市场用量很大。目前，制备UDCA主要有活熊取胆汁和人工合成两种方法，天然来源是活熊取胆或熊胆汁，活熊受到动物保护法的保护，提取来源受到限制造成天然熊胆的来源日趋减少。人工合成是指使用能够大量获取的牛、鹅胆汁提取的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)化学法合成UDCA，通过氧化还原的方法使7-OH发生构型反转,但是存在着反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题，尤其是保护和脱保护过程中需要有毒和危险试剂，严重限制了化学法的工业化应用。目前使用化学法生产的UDCA约占到市场份额的30％，而且制备高纯度较低，约80％左右，还远不能满足市场对UDCA的用量及质量的需求。

与化学差向异构化相比，CDCA生物合成UDCA具有高效性和相对环境友好性。微生物转化或生物酶催化主要围绕7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)展开，利用产7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和谐梭菌、巴氏梭菌和嗜麦芽黄单胞菌，实现了CDCA向UDCA的生物转化，UDCA的生物酶催化反应过程如图1所示。

然而，高浓度的CDCA抑制细胞生物量的积累，在产品回收和纯化过程中存在困难。此外，以往的研究表明，随着培养时间的延长，中间体的产量增加，UDCA降低，无法实现工业化生产。

Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(Appl Environ Microbiol,1982,43(5):1057-1063)，但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135)，发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680),重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。

综上，目前仅有报道有关7α-HSDH和7β-HSDH在大肠杆菌中的表达，而该酶在其他菌株中能否实现同样的表达，尚不明确，需要科研工作者的进一步探索研究。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株及其应用，利用酵母细胞作为底盘细胞，实现7α-HSDH和7β-HSDH的异源表达，得到高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的另一个目的是，提供一种高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株，具体是以酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C为出发菌株，转入含有7α-HSDH和7β-HSDH基因的重组表达质粒获得的工程菌。

进一步的，所述7α-HSDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述7β-HSDH的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述重组酵母菌株名称为S.cerevisiae CEN.PK2-1C 7α-HSDH↑7β-HSDH↑。

本发明的另一个目的是，提供一种高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株的构建方法，以酿酒酵母底盘细胞菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C为宿主，根据7α-HSDH基因的核苷酸序列和7β-HSDH的核苷酸序列，委托公司合成全基因序列，进而将7α-HSDH和7β-HSDH基因插入穿梭载体pY15TEF1和pYX212中，得到重组表达质粒pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH，之后，将所述重组表达质粒转化入所述突变型酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C中。

本发明的另一个目的是，提供上述的高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株在生产熊去氧胆酸中的应用。

本发明的另一个目的是，提供上述的应用得到的熊去氧胆酸。

有益效果：本发明提供的高效转化熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用，与现有技术相比，具有以下优势：

本发明以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C为底盘细胞，异源表达来在梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因，旨在实现将CDCA为底物生物合成UDCA。目前，底物CDCA的转化率达到80％。

附图说明

图1为UDCA的生物酶催化反应过程示意图。

图2为UDCA的LC-MS图谱。(a)UDCA标准品的液相色谱图谱；(b)重组酵母菌株发酵液的液相色谱图谱；(c)UDCA标准品的质谱图谱；(d)重组酵母菌株发酵液的质谱图谱。

图3为底物CDCA的转化率随时间的变化。

具体实施方式

本发明在酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C中异源表达来自梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因，提高了底物转化效率。

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：转化鹅去氧胆酸工程酵母的构建

以pY15TEF1和pYX212为表达质粒，构建pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH过量表达载体，具体方法为：带有限制性酶切位点的基因产物7α-HSDH和7β-HSDH由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，之后，将上述基因产物7α-HSDH和7β-HSDH和质粒pY15TEF1、pYX212同时用XbaI和BamHI、EcoRI和BamHI(引物序列如表1中SEQ.NO.03-SEQ.NO.06所示)双酶切，用T4 DNA连接酶连接，5μL连接产物转化到50μL酿酒酵母菌株感受态细胞，涂布LA平板，获得的转化子通过菌落PCR及酶切验证其正确性，用XbaI和BamHI、EcoRI和BamHI双酶切验证，并通过测序验证正确的转化子，得到重组质粒pY15TEF1-7α-HSDH和pYX212-7β-HSDH。

将质粒电击转化入酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C中，在抗性平板上挑出转化子，用引物对7α-HSDH-F和7α-HSDH-R，7β-HSDH-F和7β-HSDH-R(表1)进行菌落PCR验证，成功构建重组菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C 7α-HSDH↑7β-HSDH↑。

本实施例所用的酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C购自欧洲EUROSCARF，具体可参见：http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html。

表1引物序列

实施例2：转化鹅去氧胆酸工程酵母的发酵

酿酒酵母培养条件：从-80℃菌种保藏管取菌在YPD(含营养标记质粒的转化子在对应的SD缺陷培养基)平板上进行活化，30℃培养3d；挑取活化的单菌落接种到装有YPD(含营养标记质粒的转化子在对应的SD缺陷培养基)培养基的3mL试管中，30℃、220rpm过夜培养至饱和。

发酵培养条件：从平板上挑取活化的单菌落接种到种子培养基，30℃、220rpm摇瓶培养24h至饱和。以起始OD＝0.2转接到发酵培养基摇瓶中，30℃、220rpm培养。将细胞培养至稳定期(48h)，离心收集细胞，在0.1M的PBS溶液中重悬，加入2％的CDCA溶液，30℃恒温水浴反应4h。

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母氮源1.7，(NH

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母氮源3.4，(NH

其中，氨基酸混合液10×AA：含有缬氨酸1.5g、精氨酸0.2g、赖氨酸0.3g、苯丙氨酸0.5g、苏氨酸2g、色氨酸0.4g、酪氨酸0.3g、甲硫氨酸0.2g、异亮氨酸0.3g、硫酸腺嘌呤0.2g的氨基酸混合物5.9g用去离子水定容至1L。100×Ura：去离子水溶2g Uracine定容至1L；100×His：去离子水溶2g Histidine定容至1L；100×Leu：去离子水溶10g Leucine定容至1L；100×Arg：去离子水溶10g Arginine定容至1L；100×Trp：去离子水溶10g Tryptophane定容至1L。

实施例3：产物验证

采用液相色谱图谱和质谱图谱对实施例2的发酵产物进行测定，测定方法为：

标准品及制备：精密称取UDCA(98％)和CDCA(98％)标准品100mg到10mL容量瓶，甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后，将其用甲醇稀释2500倍，制成4mg/L备用。样品用甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后备用。

LC-MS:色谱柱为5cm HypersilGold C18柱，柱温30度，C是乙腈，D是0.1％甲酸水，采用梯度洗脱的方式(表2)，质谱采用负离子模式全扫200-500。

表2梯度洗脱条件

图谱测定结果如图2所示，其中，(a)是UDCA标准品的液相色谱图谱，(b)是重组酵母菌株发酵液的液相色谱图谱；(c)是UDCA标准品的质谱图谱，(d)是重组酵母菌株发酵液的质谱图谱。说明成功发酵得到了UDCA。

实施例4：转化率测定

底物CDCA余量及UDCA产量测定方法：

标准品的标准曲线：精密称取UDCA(98％)和CDCA(98％)标准品100mg到10mL容量瓶，甲醇超声溶解后稀释到刻度，用0.22μm有机滤膜过滤后，将其用甲醇稀释2500倍，制成4mg/L备用，进一步将其稀释到0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L，根据实施例3中的LC色谱条件，采用外标法制作标准曲线。

对底物及产物进行测试，反应体系包括0.1M pH8.0的PBS缓冲液，2％的辅酶NADP

综上，本发明以酿酒酵母菌株S.cerevisiae CEN.PK2-1C为底盘细胞，异源表达来自梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH编码基因，与目前通常使用的以大肠杆菌作为底盘细胞进行7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的异源表达的方法相比，本发明选择酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C菌株为宿主，异源表达了来源于梭菌的7α-HSDH和7β-HSDH，产品更具有安全性，克服了大肠杆菌产毒素的潜在安全问题，同时，酵母不会被噬菌体浸染，有利于工业化的生产，取得了出乎预料的技术效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 高效转化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的重组酵母菌株、构建与应用

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<211> 789

<212> DNA

<213> 7α-HSDH

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