高效生产纤维素酶的重组酿酒酵母菌株构建

摘要

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可作为宿主生产多种药用蛋白和工业酶等，近年来作为异源蛋白生产的宿主被广泛研究。然而，由于酿酒酵母蛋白生产和分泌水平较低，限制了其实际应用。酿酒酵母蛋白生产需要多基因协同作用，过量生产蛋白可能导致代谢胁迫，但对重组酵母蛋白生产的全局调控机制研究还不够深入。本课题组前期在利用环境胁迫耐性关键基因改造酿酒酵母菌株的研究过程中，发现膜蛋白Mdg1p和与维持基因组稳定性相关的蛋白Mhf1p在乙酸耐性提高的重组酵母中表达显著上调。目前对这两个蛋白的功能研究较少，其对异源蛋白生产的作用还不清楚。 本研究利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术，在分泌表达纤维二糖水解酶（CBH）、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母菌株中分别过表达MDG1和MHF1基因，并对所获得的重组酵母菌株产酶能力进行评价，进而初步探讨了其作用机理。结果表明，分别过表达这两个基因后均提高了重组酵母CBH的活性。此外，MDG1的过表达还提高了胞外内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性。利用实时定量PCR对蛋白分泌途径相关基因的转录水平进行分析，结果表明，所获得的重组酵母CBH活性的增加可能与囊泡运输途径中关键基因的转录水平提高有关。对胞内活性氧积累进行分析，发现过表达MHF1基因的重组酵母活性氧含量与对照无明显区别，推测过表达MHF1的重组酵母活性氧清除能力提高。重组酵母在含有衣霉素或二硫苏糖醇的平板上生长没有改善，推测重组蛋白生产的提高和缓解未折叠蛋白胁迫无关。在异源表达纤维素酶的重组酵母中过表达MDG1使菌株细胞膜通透性明显增加，推测可能是产酶提高的关键原因之一。进一步分析MDG1和MHF1过表达提高纤维素酶分泌生产的机理，有助于深入理解酿酒酵母中重组蛋白合成分泌的调控机制，并开发新的代谢工程改造策略提高重组酿酒酵母分泌生产异源蛋白。

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