从头合成莱鲍迪苷M的酿酒酵母工程菌及其应用

摘要

本发明公开了一种从头合成莱鲍迪苷M的酿酒酵母工程菌及其应用，属于代谢工程技术领域。本发明的酿酒酵母工程菌整合表达了贝壳杉烯合酶fpps、贝壳杉烯合酶ks、贝壳杉烯酸氧化酶ko、甜菊醇合酶kah、UDP葡萄糖基转移酶ugt74g1、UDP葡萄糖基转移酶ugt85C2、UDP葡萄糖基转移酶eugt11和UDP葡萄糖基转移酶ugt76g1。本发明提供的重组酿酒酵母可实现以葡萄糖为底物发酵生产莱鲍迪苷M，并在胞内积累，为代谢工程改造酿酒酵母从头合成莱鲍迪苷M奠定了基础。本发明提供的重组酿酒酵母的构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从头合成莱鲍迪苷M的酿酒酵母工程菌及其应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

莱鲍迪苷(Rebaudioside M，Reb M)，属于甜菊糖中的一种口感好且无后苦味的一种甜味成分。甜菊糖，又名甜菊糖苷，具有高甜度(蔗糖的300～450倍)、低热值(蔗糖的1/300)等特点，天然蔗糖替代品，被誉为“世界第三糖原”。甜菊糖是从甜叶菊中萃取甜菊糖苷净化而来的产物。生产商们在甜叶菊中提取出的甜菊糖苷大都是Reb A类型。这种类型的甜菊糖苷因为含量高所以最容易提取，但却是苦味的来源。研究发现新的甜菊糖苷——Reb D和Reb M。这两种甜菊糖苷不带苦味，但是在甜叶菊中含量极低——在甜叶菊的干叶中，RebA就占了1/3，而Reb D和Reb M占不到1％。为了解决这个问题，需要培育富含Reb D和Reb M的新甜叶菊品种，但其所需要的先进技术和设备都仰赖大量资金。即便在甜菊糖的最大出口国中国，大多数生产商也无法负担得起。目前采用基因工程法构建基因工程菌株从头合成天然产物其具有低成本、原料不受限制、提取过程简单、无季节性、生产时间短，对环境污染小等诸多优点，从而受到广大学者的青睐。

微生物发酵法具有可持续性、绿色环保的社会经济效益，采用微生物发酵法生产莱鲍迪苷M是解决上述问题的有效途径。由于微生物中不具有Reb M合成途径，因此本研究以Reb M为最终目标产品进行代谢改造。目前，未有关于微生物发酵法以葡萄糖为底物从头合成莱鲍迪苷M的相关报道。

酿酒酵母是又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，作为食品安全菌株已用于制作面包和馒头等食品、酿酒工业。近年来，学者们开始研究利用酿酒酵母生产天然产物，如青蒿酸、三七皂苷等。相比大肠杆菌而言，酿酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也在基因工程领域发挥着重要作用。然而，酿酒酵母中没有Reb M合成的代谢通路。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明采用CRISPR Cas9技术将Reb M的代谢途径整合至酿酒酵母，由于Reb M合成的前体焦磷酸异戊二烯和二甲基丙烯基二磷酸积累对细胞生长有毒，因此我们选用葡萄糖抑制型启动子P

本发明的第一个目的是提供一种从头合成莱鲍迪苷M的酿酒酵母工程菌，所述的酿酒酵母工程菌整合表达了贝壳杉烯合酶fpps、贝壳杉烯合酶ks、贝壳杉烯酸氧化酶ko、甜菊醇合酶kah、UDP葡萄糖基转移酶ugt74g1、UDP葡萄糖基转移酶ugt85C2、UDP葡萄糖基转移酶eugt11和UDP葡萄糖基转移酶ugt76g1。

进一步地，所述的酿酒酵母工程菌是以启动子P

进一步地，所述的启动子P

进一步地，所述的启动子P

进一步地，贝壳杉烯合酶fpps的NCBI编号为P08836.2、贝壳杉烯合酶ks的NCBI编号为Q9UVY5、贝壳杉烯酸氧化酶ko的NCBI编号为AAQ63464.1、甜菊醇合酶kah的NCBI编号为NP_197872.1、UDP葡萄糖基转移酶ugt74g1的NCBI编号为Q6VAA6.1、UDP葡萄糖基转移酶ugt85C2的NCBI编号为Q6VAB0.1、UDP葡萄糖基转移酶eugt11的NCBI编号为AAS07253.1、UDP葡萄糖基转移酶ugt76g1的NCBI编号为AGL95113.1。

进一步地，贝壳杉烯合酶基因和贝壳杉烯合酶基因插入酿酒酵母基因组308a位点；贝壳杉烯酸氧化酶基因插入酿酒酵母基因组1014a位点；甜菊醇合酶基因插入酿酒酵母基因组1309a位点；UDP葡萄糖基转移酶基因和UDP葡萄糖基转移酶基因插入1622a位点；UDP葡萄糖基转移酶基因和UDP葡萄糖基转移酶基因插入gal80位点。

进一步地，所述的酿酒酵母工程菌还包括，将P

本发明的第二个目的是提供所述的酿酒酵母工程菌在发酵生产莱鲍迪苷M中的应用。

进一步地，所述的应用是将所述的酿酒酵母工程菌按照1-5％接种量接种至发酵培养基中，于28-32℃、200-250rpm条件下培养90-100h。

进一步地，所述的发酵培养基包括(g/L)：葡萄糖30～50，蛋白胨10～30，酵母粉5～15。

本发明的有益效果是：

本发明提供的重组酿酒酵母可实现以葡萄糖为底物发酵生产莱鲍迪苷M，并在胞内积累，为代谢工程改造酿酒酵母从头合成莱鲍迪苷M奠定了基础。本发明提供的重组酿酒酵母的构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

附图说明

图1为质谱定性分析结果图；

图2为色谱分析结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

莱鲍迪苷M的检测方法：高效液相-质谱联用仪(LC-MS)检测法：Waters(MICROMASSQUATTRO MICRO)，BEH-C18柱子，流动相乙腈和0.1％甲酸水溶液，柱温45℃，进样量1μL。

种子培养基(g/L)：Yeast Nitrigon Base 6.7，葡萄糖20，根据需要添加组氨酸、色氨酸、亮氨酸及尿嘧啶，使其在培养基中终浓度为50g/mL，自然pH。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40，蛋白胨20，酵母粉10，自然pH。

实施例1：莱鲍迪苷M从头合成重组酿酒酵母菌株的构建

根据NCBI上公布的莱鲍迪苷M合成关键酶fpps(NCBI ID：P08836.2)、贝壳杉烯合酶ks(NCBI ID：Q9UVY5)、贝壳杉烯酸氧化酶ko(NCBI ID:AAQ63464.1)、甜菊醇合酶kah(NCBI ID：NP_197872.1)、UDP葡萄糖基转移酶ugt74g1(NCBI ID:Q6VAA6.1)、UDP葡萄糖基转移酶UGT85C2(NCBI ID:Q6VAB0.1)、UDP葡萄糖基转移酶eugt11(NCBI ID:AAS07253.1)和UDP葡萄糖基转移酶ugt76g1(NCBI ID:AGL95113.1)，按照酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化并进行全基因合成。根据酿酒酵母基因组308a，416d，1309a，1622b和gal80整合位点选择CRISPR Cas9的20bp的PAM序列，在PAM序列的两侧设计基因整合框的上下游同源臂扩增引物，分别以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR将左臂和右臂扩增下来。

根据重叠衍生PCR引物设计方法，设计引物扩增莱鲍迪苷M合成通路中的关键酶、启动子P

构建CRISPR Cas9的sgRNA质粒，以质粒pML104为模板，用SEQ ID NO.2～6所示的20bp PAM序列设计引物进行环状PCR，经测序获得具有相应PAM序列质粒。

将构建好的pML104-PAM与基因整合框转化至酿酒酵母感受态细胞，具体是将fpps和gfks基因整合框插入酿酒酵母基因组308a位点，获得贝壳杉烯合成菌株RebM-1；以RebM-1为出发菌株，将ko基因整合框插入基因组中的416d位点，获得贝壳杉烯酸合成菌株RebM-2；以Reb M-2为出发菌株，将kah基因整合框插入1309a位点，获得甜菊醇生产菌株Reb M-3；以Reb M-3为出发菌株将UGT74G1和UGT85C整合框插入至1622b位点，获得Reb M-4；以RebM-4为出发菌株，将EUGT11和UGT76G1整合框插入至gal80位点，获得生产莱鲍迪苷M重组酿酒酵母菌株Reb M-5。

实施例2：合成莱鲍迪苷M前体关键限速异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的强化

莱鲍迪苷M合成属于次级代谢，前体积累较少，为提高前体的合成，增加甲羟戊酸途径中的关键限速酶基因idi的拷贝数；切除羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的N端内质网定位信号肽获得thmg1，增加thmg1的拷贝数，具体是将P

实施例3：重组酿酒酵母发酵生产莱鲍迪苷M

将具有莱鲍迪苷M合成通路的酿酒酵母重组菌株Reb M-6划线与SD平板(添加尿嘧啶50mg/L)，30℃下培养直至长出大量菌落。

接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养18至20h至细胞生长对数前期。

按起始3％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃220rpm培养96h。每隔12h取一次菌液，测量OD

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> （人工序列）

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ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60

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tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180

taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240

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