重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法

摘要

本发明公开了一种重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法，该表达基因包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点NdeI和限制性酶切位点PstI以及位于重组蛋白羧基端的6×HisTag。本发明的重组唾液酸外切酶AMUC_0625基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的唾液酸外切酶AMUC_0625的有对唾液酸特异性的生物学活性，可用于降解糖蛋白糖链末端的α‑唾液酸，对于生物制药以及临床治疗有重要意义；本发明提供的重组蛋白AMUC_0625是一种新型的有应用前景的唾液酸外切酶。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法。

背景技术

唾液酸是一类含有9个碳原子并有吡喃糖结构的酸性氨基糖的总称，是一种天然的碳水化合物，其衍生物超过50种，主要包括三种：①N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、②N-羟基神经氨酸(Neu5Gc)、③酮基-脱氧壬酮糖酸(KDN)。通常所说的唾液酸多指N-乙酰神经氨酸，通常以α-糖苷的形式处于糖蛋白或糖脂的非还原性末端。唾液酸直接或间接参与多种细胞活动，包括1)本身作为被识别的受体，2)细胞间信息传递，激素、凝集素、抗体等分子都是唾液酸的配体，3)调节免疫反应和细胞的粘附过程、通过阻止或者弱化细胞分子对特异性识别位点的接触引起的掩蔽作用。例如糖链末端的唾液酸，能够掩蔽识别位点，阻止细胞表面一些重要抗原位点的识别；同时也是糖链的保护帽，在增加黏蛋白的黏度的同时能够有效阻止黏蛋白中的糖链不被特异性的糖苷酶所降解，也能保护蛋白质被蛋白酶所降解。

唾液酸酶包括4种：(1)唾液酸内切酶(2)唾液酸外切酶(3)转移唾液酸酶(4)唾液酸糖基转移酶，其中，唾液酸外切酶是一种糖苷水解酶，能够将切割α-(2→3)、α-(2→6)和α-(2→8)键的唾液酸残基，将唾液酸从糖链的非还原末端水解除去。唾液酸酶在生物制药，临床医疗，食品等多领域中都有应用潜力。

原核表达是将外源目的基因通过分子克隆，片段连接等实验手段构建出表达质粒载体后，将表达质粒倒入合适的表达菌株中，利用特定诱导手段诱导目的蛋白大量表达，随后进行分离纯化，得到目的蛋白的一种生物学技术。原核表达结合了包括基因工程、细胞工程、蛋白质工程等等多种分子生物学手段，具有周期短，操作简便，成本低的优点，切有多种可供选择的表达原件，表达载体质粒，宿主菌。原核表达获得的目的蛋白能够在生物医学，结构生物学，细胞生物学等多领域研究和应用中发挥作用。

但目前，尚未有关于应用原核表达系统进行稳定表达唾液酸外切酶的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种重组唾液酸外切酶AMUC_0625的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点NdeI和限制性酶切位点PstI以及位于重组蛋白羧基端的6×His Tag。

本发明还提供一种重组唾液酸外切酶AMUC_0625的原核表达载体，其包括如上所述的AMUC_0625的表达基因。

优选的是，其选用的原核表达载体为pMAL-c5X。

本发明还提供一种如上所述的重组唾液酸外切酶AMUC_0625的原核表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)获取唾液酸外切酶AMUC_0625的核苷酸序列，设计扩增引物；

2)获取艾克曼粘细菌的全cDNA；

3)利用所述扩增引物从所述cDNA中克隆AMUC_0625基因；

4)将克隆得到的AMUC_0625基因与所述原核表达载体pMAL-c5X进行连接，得到重组后的原核表达载体pMAL-c5X-Amuc_0625。

优选的是，所述步骤1)具体包括：

根据转录组测序数据以及GenBank数据库中收录的艾克曼粘细菌的蛋白组对比获取唾液酸外切酶AMUC_0625的核苷酸序列，经过生物信息学分析去除C端信号肽；

设计扩增引物：在引物的5’端添加限制性酶切位点NdeI，在3’端添加6×His Tag的氨基酸序列以及限制性酶切位点PstI，得到用于扩增AMUC_0625基因的引物。

优选的是，所述扩增引物包括如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物。

本发明还提供一种重组融合蛋白AMUC_0625，其通过如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码得到，所述重组融合蛋白AMUC_0625的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种如上所述的重组融合蛋白AMUC_0625的制备方法，包括以下步骤：

a)将重组原核表达载体pMAL-c5X-Amuc_0625转化大肠杆菌Rossatta(DE3)；

b)诱导pMAL-c5X-Amuc_0625在大肠杆菌Rossatta(DE3)中表达，获得融合蛋白MBP-AMUC_0625；

c)将获得的融合蛋白MBP-AMUC_0625进行酶切，纯化，得到重组蛋白AMUC_0625。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的重组唾液酸外切酶AMUC_0625基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的唾液酸外切酶AMUC_0625的有对唾液酸特异性的生物学活性，可用于降解糖蛋白糖链末端的α-唾液酸，对于生物制药以及临床治疗有重要意义；

(2)本发明提供的重组蛋白AMUC_0625是一种新型的有应用前景的唾液酸外切酶；

(3)本发明的原核表达载体构建利用了酶切酶连的技术手段，构建简便，表达系统选用MBP与目的蛋白的融合表达，增强了目的蛋白的可溶性表达，纯化体系成熟，能够稳定获取具有生物学活性的所述重组蛋白AMUC_0625；

(4)本发明获得的重组蛋白AMUC_0625氨基酸序列，相比于NCBI公布序列，切除了C端信号肽，以防影响重组蛋白的分泌表达，重组蛋白具有生物学活性，证明了本发明提供的整个方案的可操作性。

附图说明

图1为本发明的实施例中的唾液酸外切酶AMUC_0625的重组蛋白的原核表达载体pMAL-c5X-Amuc_0625的克隆筛选结果；

图2为本发明的实施例中的唾液酸外切酶AMUC_0625的重组蛋白的原核表达载体pMAL-c5X-Amuc_0625的质粒图谱；

图3为本发明的实施例中的麦芽糖结合蛋白与唾液酸外切酶的融合蛋白MBP-AMUC_0625经过Ni柱纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图4为本发明的唾液酸外切酶AMUC_0625不同温度下反应速率图；

图5为本发明的唾液酸外切酶AMUC_0625不同pH条件下反应速率图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供了一种重组唾液酸外切酶AMUC_0625的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点NdeI和限制性酶切位点PstI以及位于重组蛋白羧基端的6×His Tag。

本发明还提供了一种重组唾液酸外切酶AMUC_0625的原核表达载体，其包括如上所述的表达基因。在优选的实施例中，其选用的原核表达载体为pMAL-c5X。本发明还进一步提供了一种重组唾液酸外切酶AMUC_0625的原核表达载体的构建方法。

本发明还提供了一种重组融合蛋白AMUC_0625，所述重组融合蛋白AMUC_0625的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的该重组融合蛋白AMUC_0625。本发明还进一步提供了一种重组融合蛋白AMUC_0625的制备方法。

以下结合具体实施例以对本发明作进一步说明。

实施例1重组唾液酸外切酶AMUC_0625的制备方法、表达基因、重组表达载体及其载体构建方法

1、引物设计

查询美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)中的Genbank数据库Amuc_0625基因序列(NM_053615)，经过生物信息学分析去除了C端信号肽，设计PCR引物，在Amuc_0625的5’端添加NdeI酶切位点，3’端添加6×HisTag序列以及PstI酶切位点，扩增Amuc_0625基因(SEQ ID NO：1)。

上游引物5′-CATATGAGCGCCGGGGAGGGTAATCCC-3′(SEQ ID NO：3)

下游引物5′-CTGCAGCTACTTGAGAACAGGAGC-3′(SEQ ID NO：4)

2、艾克曼粘细菌的培养以及RNA的获取

将艾克曼粘细菌接种于专用培养基中，培养基成分表见下表1和表2，在无氧，37℃，100rpm的培养条件下培养至0D600＝1，室温下12000rpm离心10min，移除上清，收集底部菌体，每1g湿重菌体，加入1.0ml Trilzol试剂，振荡混匀；室温静置5分钟，每1ml体积加入0.2ml氯仿，室温静止5分钟，4℃12000rpm离心15分钟分层；将上层水相转入一干净的EP管中，加入等体积异丙醇，室温静置10分钟，4℃12000rpm离心10min以沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的DEPC水溶解沉淀。离心(12000g，10分钟)收集沉淀，加入RNaseH，37℃20min；-20℃保存。

表1基础培养基成分表

表2酸痕量溶液、碱痕量溶液及维生素溶液成分表

3、cDNA的获取

利用RT-PCR将RNA反转录得到cDNA，PCR采用TOYOBO公司的反向转录试剂盒，步骤包括：

3-1、RNA变性

把RNA在65℃条件下孵育5min，立即置于冰上冷却；

3-2、去除基因组DNA，总体系为：

4×DN MASTER MIX 10μl

gDNA Remover 0.2μl

RNA 2μg

Nuclease-free water加至40μl

混匀反应液，37℃温育5min；

3-3、逆转录反应

在上述②反应液中加入10μl 5×RT MASTER MIXⅡ，按照如下程序进行反应：

1)37℃15min；

2)50℃5min；

3)98℃5min；

4)4℃HOLD；

反应结束后，将得到的cDNA-20℃保存。

4、Amuc_0625基因克隆获取

利用Amuc_0625基因特异性引物，从cDNA中克隆得到Amuc_0625基因，使用Takara公司高保真酶进行PCR，总体系为50μL，包括：

2×PrimeSTAR Max Premix 25μl

引物-F(10μM)1μl

引物-R(10μM)1μl

cDNA 200μg

ddH2O加至50μl；

扩增程序为：

1)95℃5min；

2)95℃10s；59℃15s；72℃30s；34个循环；

3)72℃10min。

5、重组质粒pMAL-c5X-Amuc_0625的构建

利用酶切，酶连的技术手段将PCR克隆得到的Amuc_0625基因和pMAL-c5X质粒整合得到重组表达质粒pMAL-c5X-Amuc_0625，具体步骤为：

5-1、酶切

原始质粒pMAL-c5X的双酶切反应体系为：

10×BUFFER 5μl

pMAL-c5X质粒2μl

NdeI 2μl

PstI 2μl

ddH2O加至50μl；

酶切条件37℃2h。

Amuc_0625的双酶切反应体系为：

10×BUFFER 5μl

Amuc_0625 2μl

NdeI 2μl

PstI 2μl

ddH2O加至50μl；

酶切条件37℃2h。

酶切反应后加入5μl 10×LOADING BUFFER终止反应，经过1％琼脂糖凝胶电泳，目的条带进行切胶后使用TIANGEN公司试剂盒纯化回收目的条带

5-2、酶连

利用双酶切后形成的互补黏性末端将Amuc_0625和pMAL-c5X进行酶连

酶连体系为：

10×T4 Ligase buffer 5μl

双酶切后Amuc_0625 50ng

双酶切后pMAL-c5X 50ng

T4 DNA Ligase 2μl

ddH2O加至50μl；

4℃过夜反应，酶连后产物同上进行切胶回收，得到重组质粒pMAL-c5X-Amuc_0625。

5-3、重组质粒转化大肠杆菌和阳性克隆筛选

将感受态细胞Rossatta(DE3)(100μl)从-80℃冰箱中取出，在冰上溶解；把2μl重组质粒pMAL-c5X-Amuc_0625加入到Rossatta(DE3)中，冰上孵育30min；将质粒和感受态细胞混合物在42℃下水浴热激30s，立即转移至冰上孵育2min；加入900μl不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm在摇床中培养1h；把200μl转化物用涂布棒均匀涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上，将平板正置在37℃恒温培养箱中20min，随后转为倒置，过夜培养；挑选单克隆培养，提取质粒进行鉴定，鉴定结果如图1所示，说明表达质粒构建成功。

挑选阳性克隆进行测序，结果显示基因序列与Genebank公布的一致，重组表达质粒pMAL-c5X-Amuc_0625见图2。

6、融合蛋白MBP-AMUC_0625的表达

6-1、按照1：1000比例，取50μl单克隆培养物加入含有100μg/ml氨苄青霉素的50mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养约4h，OD600＝0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于恒温摇床中培养。根据诱导条件不同设置不同组别：①37℃，100rpm，IPTG浓度0.1mM，诱导6h；②37℃，100rpm，IPTG浓度0.5mM，诱导6h；③37℃，100rpm，IPTG浓度1.0mM，诱导6h；④20℃，100rpm，IPTG浓度0.1mM，诱导6h；⑤20℃，100rpm，IPTG浓度0.5mM，诱导6h；⑥20℃，100rpm，IPTG浓度1.0mM，诱导6h。将各个组别培养物收集于50ml离心管，4℃，8000rpm离心10min沉淀菌体，用PBS清洗2次，加入15ml含有1mM PMSF以及1mM溶菌酶的PBS重悬，放置在-20℃冰箱过夜。

6-2、把菌悬液从-20℃中取出，冰上溶解，用涡旋振荡器重悬菌体，冰浴超声破碎15min，功率300W，超声5s，间隔5s，细胞破碎悬液4℃，12000rpm，离心10min，收集上清，沉淀中加入15ml PBS重悬。

6-3、分别取上清和沉淀40μl，加入5×Loading buffer 10μl，100℃金属浴10min使蛋白彻底变性，10％SDS-PAGE电泳检测，图X中可看出，MBP-AMUC_0625融合蛋白在宿主菌Rossette(DE3)中有较高表达量，且大部分位于上清中，包涵体内也存在一定量。

6-4、将含有目的融合蛋白MBP-AMUC_0625的上清过Ni柱进行蛋白纯化，分别用20，50，100，250，500mM的咪唑进行洗脱(pH 7.4)，收集洗脱液，利用BCA蛋白定量试剂盒定量后，进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，表明250mM咪唑能够洗脱高浓度目的蛋白。

6-5、将洗脱下的目的蛋白利用超滤管进行浓缩，最终溶解于Column buffer(20mMTris-HCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)中。Xa因子酶能够识别标签蛋白MBP与AMUC_0625之间特异性的Ile-(Glu/Asp)-Gly-Arg，并水解精氨酸残基。向上述得到的纯化后融合蛋白MBP-AMUC_0625中按照1：100的重量比加入Xa因子酶，室温下反应24h，得到酶解分离后的MBP和AMUC_0625。酶切后的蛋白过Amylose纯化柱，收集流穿液，得到分离后AMUC_0625，用含有10mM麦芽糖的Column buffer洗脱得MBP。

实施例2重组蛋白AMUC_0625的活性和生化指标检测

利用4MU-NANA(4-甲基伞形酮-α-乙酰神经氨酸)作为唾液酸外切酶AMUC_0625的底物检测其活性，AMUC_0625可以水解4MU-NANA，生成4MU和乙酰神经氨酸，其中4MU为荧光染料，最大吸收光波长为365nm，最大发射光波长450nm。绘制4MU标准曲线后，检测4MU荧光值，能够反映AMUC_0625水解4MU-NANA的速率。

反应体系如下：

1mM 4MU-NANA 20μl

48μg/ml AMUC_0625 1μl

反应缓冲液79μl；

室温下反应20min后，加入200μl的反应终止液(100mM甘氨酸/氢氧化钠,pH10.7)终止反应,检测荧光值。在相同反应体系下，设置不同反应温度(25～65℃)，检测荧光值；在相同反应体系下，改变反应缓冲液pH值后反应，检测荧光值，分析得到AMUC_0625的最佳反应温度和最适pH，如图4和图5所示，AMUC_0625最佳反应温度为35℃，最适pH为5.6。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

申请人：上海大学昆明理工大学

发明名称：重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法

SEQ NO.1

AGCGCCGGGGAGGGTAATCCCTATGCGTCCATCCGTATTCCCGCCCTGCTCAGTATCGGCAAGGGCCAGCTTCTGGCATTCGCCGAAGGACGGTACAAAAATACCGACCAGGGGGAGAACGATATTATCATGAGCGTCAGCAAGAATGGCGGGAAGACCTGGTCCCGTCCCCGGGCGATAGCCAAGGCCCATGGCGCCACGTTCAATAATCCGTGCCCCGTTTATGATGCCAAAACCAGGACCGTGACTGTCGTATTCCAGCGTTACCCTGCCGGGGTCAAGGAGCGGCAGCCCAATATCCCGGACGGATGGGATGATGAAAAGTGCATCCGCAATTTCATGATTCAGAGCAGGAACGGAGGTTCTTCCTGGACGAAGCCGCAGGAGATCACGAAGACGACCAAGCGTCCTTCCGGAGTGGATATTATGGCGTCCGGCCCGAATGCGGGAACCCAGCTGAAGAGCGGCGCCCACAAGGGCCGCCTGGTGATTCCGATGAATGAAGGGCCGTTCGGCAAATGGGTGATTTCCTGCATTTACAGCGATGACGGCGGCAAGAGCTGGAAGCTGGGCCAGCCGACTGCCAATATGAAGGGCATGGTGAACGAGACGTCCATTGCGGAAACGGATAACGGCGGCGTTGTGATGGTTGCGCGCCATTGGGGCGCAGGCAATTGCCGCCGTATTGCGTGGTCCCAGGATGGCGGGGAGACCTGGGGACAGGTGGAGGACGCTCCGGAGCTGTTTTGCGACAGTACCCAGAATTCCCTGATGACGTATTCCCTGAGCGACCAGCCTGCCTATGGCGGCAAAAGCCGCATTCTGTTTTCCGGGCCCAGTGCGGGCCGGCGCATTAAGGGACAGGTGGCCATGAGCTATGACAACGGCAAGACCTGGCCGGTGAAGAAATTGCTGGGCGAGGGCGGTTTTGCCTATTCCAGCCTTGCCATGGTGGAACCCGGCATCGTTGGGGTGCTTTATGAGGAGAACCAGGAGCATATTAAAAAGCTGAAGTTTGTTCCCATTACCATGGAATGGCTGACGGACGGAGAAGACACAGGGCTGGCTCCCGGCAAAAAAGCTCCTGTTCTCAAGCATCATCACCATCACCATTAA

SEQ NO.2

SAGEGNPYASIRIPALLSIGKGQLLAFAEGRYKNTDQGENDIIMSVSKNGGKTWSRPRAIAKAHGATFNNPCPVYDAKTRTVTVVFQRYPAGVKERQPNIPDGWDDEKCIRNFMIQSRNGGSSWTKPQEITKTTKRPSGVDIMASGPNAGTQLKSGAHKGRLVIPMNEGPFGKWVISCIYSDDGGKSWKLGQPTANMKGMVNETSIAETDNGGVVMVARHWGAGNCRRIAWSQDGGETWGQVEDAPELFCDSTQNSLMTYSLSDQPAYGGKSRILFSGPSAGRRIKGQVAMSYDNGKTWPVKKLLGEGGFAYSSLAMVEPGIVGVLYEENQEHIKKLKFVPITMEWLTDGEDTGLAPGKKAPVLKHHHHHH

SEQ NO.3

5′-CATATGAGCGCCGGGGAGGGTAATCCC-3′

SEQ NO.4

5′-CTGCAGCTACTTGAGAACAGGAGC-3′