唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法

摘要

一种唾液酸酶的制备方法，包括如下步骤：制备唾液酸酶基因片段；将唾液酸酶基因片段克隆到pMD‑18T中，得到连接产物，将连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；将阳性克隆子和原核表达载体连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化得到重组工程菌；对重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化，得到唾液酸酶。上述唾液酸酶的制备方法，通过细菌基因组DNA的提取、PCR扩增、构建重组表达载体、转入宿主细胞构建重组表达细胞、重组表达细胞的培养及诱导表达、从培养的宿主细胞中分离、纯化蛋白酶，蛋白酶酶学性质的分析。上述唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶耐高温、耐Ph，为工业和社会应用提供更多的基础材料和科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及表达载体构建方法技术领域，尤其涉及一种唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法。

背景技术

唾液酸是一类含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖,广泛存在于动物组织及微生物中，是细胞膜糖蛋白和糖脂的重要组成部分。唾液酸一般不以游离态的形式存在,它通常与细胞表面的糖蛋白和糖脂等生物大分子结合形成缀合物，并存在于缀合物的末端，在细胞的分化、成熟、细胞与生物大分子间相互作用等生理生化过程中起重要作用。在自然界中已发现五十余种结构不同的唾液酸，其中最为重要研究最多的唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac),它是唾液酸家族中最主要的成员之一,含量占整个唾液酸家族的99％以上，通常是唾液酸家族其他成员生物合成的前体，具有多样的生物学功能。唾液酸在糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用，例如：细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。由于N-乙酰神经氨酸的含量占整个唾液酸家族的99％以上，因此人们对它的研究也较为深入，而对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的生产一般有以下几种方法获得：从天然材料提取、化学合成、酶法合成以及微生物发酵等方法。酶法合成N-乙酰神经氨酸起始于唾液酸酶或N-乙酰神经氨酸醛缩酶的发现和应用。N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL，EC4.1.3.3)又称为N-乙酰神经氨酸裂合酶(Neu5Aclyase)，它是唾液酸代谢的终端酶，既能催化唾液酸(Neu5Ac)裂解形成丙酮酸(Pyruvate)和N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，在一定条件下也能缩合N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(Pyruvate)生成N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)，已有报道利用该酶合成唾液酸和它的类似物。唾液酸酶在动物组织及一些微生物中都有存在，动物体内,该酶主要作用是控制唾液酸的循环，微生物体内,除起到调控作用外，它不仅能把游离的唾液酸降解成可利用的碳源和氮源,还能催化唾液酸的合成。至今为止，对深海无脊椎动物共生微生物来源的唾液酸酶研究尚未见到报道，由于深海特殊的生态环境(低温、高压和寡营养等)及采样技术与工具的欠缺，捕获生物相对困难，促使对深海无脊椎动物共生微生物来源的唾液酸酶的研究报道非常有限，因此人们对该来源的唾液酸酶了解知之甚少。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法。

一种唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将所述连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

在其中一个实施例中，制备唾液酸酶基因片段的方法如下：

采用PowerLyzer^RPowersoilDNAisolation>

引物F：5’-GGATCCATGGAAAAATTAACAGGAATTTTTG-3’；

引物R：5’-GTCGACTTATGAAAGATATTTATCAATTATGTT-3’。

在其中一个实施例中，将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中的步骤前，还包括如下步骤：

将所述唾液酸酶基因片段用琼脂糖凝胶电泳检测，检测后用胶回收试剂盒进行纯化回收。

在其中一个实施例中，将所述阳性克隆子和原核表达载体连接的方法如下：

将所述阳性克隆子和原核表达载体分别经BamHI和SalⅠ双酶切后，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接2h，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体。

在其中一个实施例中，所述原核表达载体为质粒。

一种唾液酸酶的制备方法，包括如下步骤：

制备唾液酸酶基因片段；

将所述唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1所示的基因序列；

将所述阳性克隆子和原核表达载体连接，得到所述唾液酸酶基因重组表达载体；

将所述唾液酸酶基因重组表达载体进行转化，得到重组工程菌；

对得到的重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化，得到所述唾液酸酶。

在其中一个实施例中，对得到的重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化的步骤中，发酵诱导表达的方法如下：

得到的重组工程菌接种到含氨苄青霉素LB液体培养基，于37℃，150rpm过夜培养，然后，将过夜培养的菌液全部移到新鲜LB液体培养基中，接着于37℃，180rpm培养3-4h直到OD₆₀₀＝0.8-1.0，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，转移到30℃，180rpm诱导4h后，离心收集菌体。

在其中一个实施例中，对得到的含有所述唾液酸酶基因重组表达载体的工程菌进行发酵诱导表达、纯化的步骤中，纯化的步骤如下：

将离心收集的菌体用1xPBS冲洗两次，离心收集菌体后用10mL含10mmol咪唑的裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清液，接着将所述上清液移到镍柱中充分混合静置使其自然下沉，然后用40mL含60mmol-80mmol咪唑洗涤缓冲液冲洗杂蛋白，接着，用4mL含350mmol-500mmol咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并用干净的离心管收集目的蛋白，得到所述唾液酸酶。

一种采用上述唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法制得的唾液酸酶基因重组表达载体。

一种采用上述唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶。

上述唾液酸酶的制备方法，通过细菌基因组DNA的提取、PCR扩增、构建重组表达载体、转入宿主细胞构建重组表达细胞、重组表达细胞的培养及诱导表达、从培养的宿主细胞中分离、纯化蛋白酶，蛋白酶酶学性质的分析。上述唾液酸酶的制备方法已获得唾液酸酶的基因序列，表达纯化出唾液酸酶，并已分析了唾液酸酶的相关酶学性质。上述唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶耐高温、耐Ph，为工业和社会应用提供更多的基础材料和科学依据。

附图说明

图1为一实施方式的SDS-PAGE检测纯化效果示意图，图中M是marker，泳道1是未加诱导剂对照；2是未纯化的诱导表达蛋白；3和4是纯化后的蛋白；

图2为唾液酸酶催化反应的温度影响图；

图3为唾液酸酶催化反应的pH影响图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

一实施方式的唾液酸酶的制备方法，包括如下步骤：

S10、制备唾液酸酶基因重组表达载体，即重组工程菌。

S10中，唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法包括如下步骤：

S110、制备唾液酸酶基因片段。

制备唾液酸酶基因片段的方法为：从大王具足虫肠胃中克隆得到唾液酸酶基因(NanA)的核苷酸序列。采用PowerLyzer^RPowersoil>

其中，聚合酶链式反应采用的引物如下：

SEQ ID NO：2

引物F：5’-GGATCCATGGAAAAATTAACAGGAATTTTTG-3’；

SEQ ID NO：3

引物R：5’-GTCGACTTATGAAAGATATTTATCAATTATGTT-3’。

引物F的5’端含有BamHI酶切位点(第1个碱基到第6个碱基)，引物R的5’端含有SalⅠ酶切位点(第1个碱基到第6个碱基)。

聚合酶链式反应的反应条件如下：

10μL 5×Buffer，4μL dNTP，0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，1μL引物F，1μL引物R，1μL模板，32.5μL H₂O，总体积为50μL。

PCR扩增条件如下：

98℃预变性10S，98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸三步进行30个循环，最后72℃补齐末端10min。

S120、将唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中，得到连接产物，将连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆子测序，获得如SEQ ID NO：1示的基因序列。

其中，pMD-18T购买自TaKaRa公司。

将唾液酸酶基因片段克隆到pMD-18T中的步骤前，还包括如下步骤：

将唾液酸酶基因片段用琼脂糖凝胶电泳检测，检测后用胶回收试剂盒进行纯化回收。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示得到了大小约885bp的片段。

将连接产物挑选阳性克隆子测序的方法为：

连接产物转化到大肠杆菌JM109，在含浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆，将验证为阳性的克隆子接入到含浓度为100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养，用离心柱型质粒提取试剂盒提取质粒，进行测序(华大公司)，测序结果显示所得片段大小为885bp，如SEQ ID NO：1所示。

S130、将阳性克隆子和原核表达载体连接，得到唾液酸酶基因重组表达载体。

将阳性克隆子和原核表达载体连接的方法如下：

将阳性克隆子和原核表达载体分别用BamHI和SalⅠ双酶切后，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接2h，得到唾液酸酶基因重组表达载体。

其中，原核表达载体为质粒或其他载体。优选的，原核表达载体为pET载体系列或其他原核表达载体。更优选的，原核表达载体为pET-30a。

编码唾液酸酶的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子如：大肠杆菌的lac或trp启动子、λ噬菌体的PL启动子、真核启动子的CMV早期启动子和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。

上述唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法，通过细菌基因组DNA的提取、PCR扩增、构建重组表达载体，方法简单，易操作。

S20、将唾液酸酶基因重组表达载体进行转化，得到重组工程菌。

将唾液酸酶基因重组表达载体进行转化的方法如下：

将产物转化入宿主细胞中，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR和提取质粒单、双酶切筛选到阳性克隆并测序鉴定，得到重组工程菌。即成功构建含有唾液酸酶基因的大肠杆菌宿主细胞。

宿主细胞可以为大肠杆菌、真菌细胞或酵母等。优选的，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

S30、对得到重组工程菌进行发酵诱导表达、纯化，得到唾液酸酶。

S30中，发酵诱导表达的方法如下：

得到的重组工程菌接种到含氨苄青霉素LB液体培养基，于37℃，150rpm过夜培养，然后，将过夜培养的菌液全部移到新鲜LB液体培养基中，接着于37℃，180rpm培养3-4h直到OD₆₀₀＝0.8-1.0，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)，转移到30℃，180rpm诱导3-4h后，离心收集菌体。

S30中，纯化的步骤如下：

将离心收集的菌体用1xPBS洗两次，离心收集菌体后用10mL含10mmol咪唑的裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清液，接着将上清液移到镍柱中充分混合静置使其自然下沉，然后用40mL含60mmol-80mmol咪唑的洗涤缓冲液冲洗杂蛋白，接着，用4mL含350mmol-500mmol咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并用干净的离心管收集目的蛋白，得到纯化的唾液酸酶。

其中，裂解缓冲液包括如下组分：NaH₂PO₄>

洗涤缓冲液包括如下组分：NaH₂PO₄50mM，NaCl300mM，咪唑60-80mM。

洗脱缓冲液包括如下组分：NaH₂PO₄50mM，NaCl300mM，咪唑350-500mM。

蛋白液上镍柱进行纯化，镍柱中的硫酸镍可以与有组氨酸(Histidine，His)标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。

为验证表达的唾液酸酶是否有酶活，对纯化后的唾液酸酶进行酶活测定及相关酶学性质分析，其结果如图2和图3所示。

此外，还提供一种采用上述唾液酸酶基因重组表达载体的构建方法制得的唾液酸酶基因重组表达载体。以及，一种采用上述唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶。

上述唾液酸酶的制备方法，通过细菌基因组DNA的提取、PCR扩增、构建重组表达载体、转入宿主细胞构建重组表达细胞、重组表达细胞的培养及诱导表达、从培养的宿主细胞中分离、纯化蛋白酶，蛋白酶酶学性质的分析。上述唾液酸酶的制备方法已获得唾液酸酶的基因序列，表达纯化出唾液酸酶，并已分析了唾液酸酶的相关酶学性质。上述唾液酸酶的制备方法制备得到的唾液酸酶耐高温、耐Ph，为工业和社会应用提供更多的基础材料和科学依据。

上述唾液酸酶的制备方法，从深海无脊椎动物大王具足虫共生微生物支原体中克隆唾液酸酶基因并进行表达，并对该酶的酶学性质进行分析具有重要的意义。它有助于分析和阐释极端环境下深海生物生存及其适应机制，有利于对深海生物种质资源与天然产物的开发利用，也为拓展微生物来源的唾液酸酶及唾液酸的工业化生产提供基础材料和科学依据，为提高微生物代谢产物提供新的思路和方法，具有重要的现实意义和良好的应用前景。

下面结合具体实施例进一步进行阐述。

实施例1：从大王具足虫肠胃中克隆得到唾液酸酶基因(NanA)的核苷酸序列。采用PowerLyzer^RPowersoil>

引物F：5’-GGATCCATGGAAAAATTAACAGGAATTTTTG-3’

引物R：5’-GTCGACTTATGAAAGATATTTATCAATTATGTT-3’

PCR反应体系：10μL 5×Buffer，4μL dNTP，0.5μL PrimeSTAR HS DNAPolymerase，1μL引物F，1μL引物R，1μL模板，32.5μL H₂O，总体积为50μL。

PCR扩增条件如下所示：

98℃预变性10S，98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸三步进行30个循环，72℃补齐末端10min。PCR扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，得到了大小约885bp的片段，用胶回收试剂盒进行纯化回收(离心柱型)，把回收片段克隆到pMD-18T(TaKaRa公司产品)中，连接产物转化到大肠杆菌JM109，在含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR验证阳性克隆，将验证为阳性的克隆子接入到含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基，37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒(离心柱型)提取质粒，进行测序(华大公司)，测序结果显示所得片段大小为885bp，如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：重组表达载体的构建

实施例1中扩增得到的片段，因其引物F的5’端含有BamHI酶切位点(第1个碱基到第6个碱基)，引物R的5’端含有SalⅠ酶切位点(第1个碱基到第6个碱基)，所以使用这两个酶对片段进行双酶切，同时将pET-30a用相同的酶进行双酶切，电泳回收酶切片段，并用T4连接酶在16℃连接2h，构建重组表达载体。连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体平板上进行培养，挑取平板上生长的白色菌落，通过菌落PCR和提取质粒单、双酶切筛选到阳性克隆并测序鉴定，成功构建含有唾液酸酶基因的大肠杆菌宿主细胞。

实施例3：唾液酸蛋白酶的表达与纯化

将实施例2中得到的重组工程菌接种到10mLLB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，150rpm过夜培养，第二天将过夜培养的菌液全部移到250mL的新鲜LB液体培养基中，接着于37℃，180rpm培养3-4h直到OD₆₀₀＝0.8-1.0，加入终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，转移到30℃，180rpm诱导4h后，离心收集菌体，将菌体用10mL含10mmol咪唑的裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清。蛋白液上镍柱进行纯化，镍柱中的硫酸镍可以与有His(组氨酸)标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合，先将蛋白液以一定速度通过镍柱使蛋白质挂柱，然后用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱。将上述的上清液移到镍柱中充分混合静置使其自然下沉，然后用40mL含60mmol-80mmol咪唑的洗涤缓冲液冲洗杂蛋白，用4mL含350mmol-500mmol咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用干净的离心管分别收集目的蛋白，洗脱液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，纯化的效果如图1所示。

实施例4：酶活的测定

将纯化后的蛋白酶溶液装到透析袋中，放入透析液(PBS)于4℃中透析24h，其中换液两至三次。将透析好的蛋白放入浓缩管中进行适当浓缩，取少量浓缩后的样品进行SDS-PAGE分析，根据BSA浓度标准曲线估算蛋白浓度。为验证表达的蛋白是否有酶活，对纯化后的蛋白进行酶活测定及相关酶学性质分析，该酶催化的裂解方向以N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)为底物，裂解方向的活性通过分光光度计测定，以酶偶联的方法，其原理是N-乙酰神经氨酸裂解生成的丙酮酸能在NADH和乳酸脱氢酶存在的条件下被还原成乳酸，过程中消耗了NADH，引起340nm波长下对NADH吸光度的下降。一个酶活力单位定义为：在pH 7.0、37℃下，1min裂解1μmol Neu5Ac生成1μmolN-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸所需酶的量。反应体系包括4mmol/L Neu5Ac、150umol/L NADH、0.5U LDH、1.5ug酶。酶催化的合成方向以N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(Pyr)为底物，合成方向的活性通过HPLC测定，其原理为：仅加入ManNAc、Pyr和酶，通过HPLC检测Neu5Ac的生成量确定活力大小。一个酶活力单位定义为：在p H 7.0、37℃下，1min合成1μmol Neu5Ac所需要的酶量。反应体系包括30mmol/L ManNAc，100mmol/L Pyr和20μg酶。酶活检测结果如图2和图3所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深海科学与工程研究所

<120> 唾液酸酶基因重组表达载体及其构建方法，唾液酸酶及其制备方法

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 885

<212> DNA

<213> 大王具足虫肠胃共生支原体

<400> 1

atggaaaaat taacaggaat ttttgctgct atggttacac catttaatga agatggttca 60

ttaaatgaac aagcagtggg agaaactgtc aactttttaa ttgaaaatca aaaagttgat 120

ggtctataca taaatggatc aacaggagaa tttcttgcaa gtaattgcgc aacacaacaa 180

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<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 大王具足虫肠胃共生支原体

<400> 2

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<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 大王具足虫肠胃共生支原体

<400> 3

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