一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法

摘要

本发明公开了一种检测HLA‑B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法，涉及基因检测技术领域，该核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对1和序列如SEQ ID No.4～5所示的引物对2。引物对1是针对HLA‑B*15:02基因的特异性位点和区域设计的引物，可将HLA‑B*15:02与除HLA‑B*15:13以外的其他常见等位基因区分开；引物对2用于区分HLA‑B*15:02与HLA‑B*15:13，进一步降低检测假阳性结果出现，提高检测准确性。该核酸组合物仅需2个反应即可鉴定出HLA‑B*15:02基因，减少了操作及结果判读难度，降低了检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法。

背景技术

主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，人类的MHC被称为人类白细胞抗原(HumanLeukocyte Antigen，HLA)。HLA基因定位于人类第6号染色体短臂上，由一群密切连锁的复等位基因组成，包含约360万个碱基对，长约4MB，是当前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最为丰富的区域。HLA是细胞表面分子，主要参与T细胞活化的已加工过的抗原肽的呈递并在其中起重要作用，构成机体最重要的免疫系统之一。

HLA包含HLA-I、HLA-II和HLA-III，也称作MHC-I、MHC-II和MHC-III。HLA-I主要包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，位于HLA复合体远离着丝粒的一端；HLA-II主要包括HLA-DR、HLA-DQ及HLA-DP，位于HLA复合体近着丝粒的一端；III类基因区位于二者之间。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到28000多个(2020.12)，在HLA-I和HLA-II等位基因家族中HLA-B的多态性最显著。HLA基因复合体不仅是多基因的，而且是多等位基因的，HLA基因的多态性决定了在个体间可以产生高度多样化的HLA蛋白，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，从遗传水平上调控免疫应答功能，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受，或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病。

HLA-B*15:02等位基因几乎只存在于亚洲人种之中，其在汉族人群中的频率为2％～12％，在泰国人群中频率约为8％，在菲律宾和部分马来西亚人群中频率＞15％，韩国人群中频率约为2％，印度人群中频率约为6％，而HLA-B*15:02在欧裔人群、部分非裔人群、美洲土著人群、西班牙裔人群和日裔人群中的频率均<1％。

药物不良反应(Adverse Drug Reaction，ADR)己经成为许多国家重要的致病甚至致死原因，皮肤不良反应是药物不良反应中的重要一部分，约占药物不良反应的三分之一。皮肤不良反应在临床上最常见的主要包括轻度的斑丘疹(Macular Papule，MPE)、Stevens-Johnson综合征(Stevens-Johnson Syndrome，SJS)、中毒性表皮坏死松懈症(ToxicEpidermal Necrolysis，TEN)。其中SJS和TEN是严重的皮肤和黏膜反应，可导致永久性残疾甚至致命，SJS致死率约为5％，TEN致死率则高达25～50％。皮肤不良反应大部分患者主要和以下这些药物相关：别嘌呤醇(Allopurinol)、卡马西平(Carbamazepine)、奥卡西平(Oxcarbazepine)、苯妥英(Phenytoin)、拉莫三嗪(Lamotrigine)、苯巴比妥(Phenobarbital)以及磺胺类抗菌素等。

癫痫是一种由多种病因引起的慢性脑部疾病，以脑神经元过度放电导致反复、发作性和暂时性的中枢神经系统功能失常为特征，是仅次于脑血管病的神经科第二大疾病。癫痫的治疗手段包括对病因进行针对性治疗、药物治疗、外科手术治疗及物理疗法等，但药物治疗目前仍是癫痫治疗的主要方法。

卡马西平(Carbamazepine)为三环类抗惊厥药，被广泛用于治疗癫痫、三叉神经、躁狂抑郁症等疾病；奥卡西平(Oxcarbazepine)是卡马西平的10-酮基衍生物，药效与卡马西平相似或稍强，可用于局限性及全身性癫痫发作。苯妥英(Phenytoin)为乙丙酰脲类药物，于1937年发现其抗惊厥活性并作为AEDs应用于临床，由于其疗效高、价格低廉,故迄今为止仍作为一线抗癫痫药物在临床上广泛应用。由于这些药被广泛应用相应的病症治疗中，其不良反应也日益凸显。

研究表明，卡马西平、奥卡西平、苯妥英诱导的SJS/TEN与患者是否携带HLA-B*15:02等位基因有很大关联。卡马西平诱导产生SJS/TEN的患者中HLA-B*15:02阳性患者的比例约为70％～100％，而对照群体中HLA-B*15:02的携带者比例低于16％，FDA曾于2007年12月12日发布警示，告诫HLA-B*1502等位基因阳性者服用卡马西平可能发生严重和潜在致命的皮肤反应，并推荐亚裔血统患者开始使用卡马西平前进行血液基因筛查。现有的临床证据以及来自非临床研究的数据表明，奥卡西平与HLA-B*15:02蛋白之间存在直接的相互作用，这表明HLA-B*15:02等位基因也可能增加奥卡西平引起SJS/TEN的风险，因此FDA建议在开始使用奥卡西平进行治疗之前，应考虑对属于遗传高危人群的患者进行HLA-B*15:02等位基因检测，对于HLA-B*15:02呈阳性的患者，除非其益处明显大于风险时应避免使用奥卡西平。少量证据表明，HLA-B*15:02可能是亚裔患者服用其他与SJS/TEN相关的抗癫痫药物(包括苯妥英)时出现SJS/TEN的危险因素，FDA建议对于HLA-B*15:02阳性的患者，应考虑避免使用苯妥英替代卡马西平。临床药物基因组学实施联盟(The Clinical PharmacogeneticsImplementation Consortium，CPIC)对卡马西平、奥卡西平及苯妥英用药前对患者进行HLA-B*15:02等位基因检测进行了1A类推荐。因此，对癫痫等神经性疾病患者而言，首先进行检测等位HLA-B*15:02基因，再决定是否给患者服用卡马西平、奥卡西平、苯妥英还是其它替代药物则是很有意义的。

目前，HLA等位基因分型的常用方法主要包括：基于测序分型的聚合酶链式反应法(PCR Sequence Based Typing，PCR-SBT)、序列特异性寡核苷酸探针法(SequenceSpecific Oligonucleotide Probes，PCR-SSOP)、序列特异性引物PCR技术(SequenceSpecific primers，PCR-SSP)、环介导等位基因扩增反应(Loop Mediated IsothermalAmplification，LAMP)、实时荧光定量PCR(Real Time Polymerase Chain Reaction PCR，RT-PCR)等。

PCR-SBT直接测序法是国际上公认的HLA基因分型方法的"金标准"，通过一对扩增引物、多个测序引物和组特异性测序引物进行DNA序列分析，使用特定软件分析确定基因型别。由于其技术特点，它主要应用于HLA基因分型，具有特异性强、灵敏度高、样本需求量较少等优点。PCR-SBT存在着操作繁琐、耗时长，测序结果会出现套峰，会出现模棱两可的结果，不利于结果的判读。

PCR-SSOP技术首先是对HLA等位基因的多态区域进行扩增，并对产物进行标记，然后针对扩增产物设计不同的寡核苷酸探针固定在膜上，将产物与膜上的特异性探针杂交并显色，根据信号判断实验结果。该技术特异性较强、灵敏度较高，且需要的样本量少。由于其所用的载体大多为膜或微滴定板，且需大量探针及单独的杂交反应，因此流程繁琐，难以标准化和自动化。

PCR-SSP技术是根据HLA等位基因特异性序列设计引物，直接扩增基因组DNA，通过凝胶电泳检测扩增产物，根据产物的有无和DNA片段大小来判断HLA基因型。该技术条件容易掌握、操作简便，需要的样本量少、对血液条件要求不高，适用于临床对于已知HLA序列的快速检测应用等优势；但是，由于PCR-SSP技术需使用凝胶电泳实验，因此该技术在操作中易造成二次污染、时间长，同时在PCR过程中多对引物易造成二聚体等非目的基因产物，从而易造成假阳性结果等。

LAMP在等温条件下高度特异、高效且快速地扩增DNA。在目的DNA序列上，这种方法主要采用一种具有链置换性质的DNA聚合酶和4条特异性引物来识别DNA靶序列上的6个特异区域，从而进行循环扩增。靶序列的扩增反应需要在等温条件下进行大约1小时，可实现指数倍数的扩增。LAMP灵敏度高，临床使用时不需特殊仪器，操作简单，在63℃-65℃之间的恒温条件下即可完成DNA序列的扩增。但LAMP技术在操作时不能避免二次开盖，容易形成气溶胶造成污染，并且假阳性问题比较严重。

RT-PCR是在PCR过程中加入了荧光基团或者荧光染料指示剂，对PCR产物进行标记跟踪，利用信号积累实时监测PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析和计算。RT-PCR在反应的对数期检测，分析起始点产物的量、实时监测荧光信号、动力学范围广、有效鉴别非特异性扩增和突变、可以相对定量和绝对定量。因此，该技术灵敏度高、特异性强、能进行多重反应、自动化程度高、污染性小、具有实时性和准确性。

目前，HLA-B*15:02等位基因的检测技术以PCR-SSP和RT-PCR这两种方法为主，检测目标分为检测HLA-B*15:02的关联位点和直接检测HLA-B*15:02基因两种。

由于HLA-B等位基因数量庞大、结构复杂，目前可查的HLA-B*58:01基因检测专利及相关试剂盒多采用检测HLA-B*15:02等位基因连锁SNP位点的方法(CN105506165A、CN105483279A、CN109112188A、CN105296615A)，目前常用的关联SNP位点包括：rs2844682、rs3909184及rs10484555，然而实现SNP连锁分析法检测，首先满足的条件是SNP与HLA等位基因必须完全连锁，然而研究表明这些位点与HLA-B*15:02等位基因并非完全连锁，因而其并没有太大的临床意义。

直接进行HLA-B*15:02基因检测的方法相较于SNP连锁位点的更加准确、可靠。目前可查的直接检测HLA-B*15:02基因的专利多使用PCR-SSP法(CN103114138B、CN101353698A、CN104046696B、CN111518887A、CN106434972A)或多探针多反应Taqman法(CN103820543A、CN102660635B、CN104830852A、CN106119362B、CN104450914A)，但基于这些方法开发的试剂成本高，操作复杂，且检测的模板只能是纯化后的核酸，必须核酸纯化的步骤，整个检测流程一般在3个小时以上，并且难以区分HLA-B*15其他亚型，易产生假阳性，在临床推广上不太理想。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物，其包括引物对1和引物对2；

所述引物对1的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示；

所述引物对2的碱基序列如SEQ ID No.4～5所示。

第二方面，本发明实施例提供了一种检测HLA-B*15:02基因的试剂盒，其包括如前述实施例所述的检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物。

第三方面，本发明实施例提供了一种检测HLA-B*15:02基因的方法，其包括：采用如前述实施例所述的检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物或如前述实施例所述的检测HLA-B*15:02基因的试剂盒对待测样本进行荧光定量PCR检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法，该核酸组合物包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对1和序列如SEQ ID No.4～5所示的引物对2。引物对1是针对HLA-B*15:02基因的特异性位点和区域设计的引物，可将HLA-B*15:02与除HLA-B*15:13以外的其他常见等位基因区分开；引物对2用于区分HLA-B*15:02与HLA-B*15:13，进一步降低检测假阳性结果出现，提高检测准确性。该核酸组合物仅需2个反应即可鉴定出HLA-B*15:02基因，减少了操作及结果判读难度，降低了检测成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中引物对1和探针1的HLA-B*15:02特异性区域；

图2为实施例1中引物对2和探针2的HLA-B*15:02特异性区域；

图3为实施例2中空白对照BC-1的检测结果；

图4为实施例2中空白对照BC-2的检测结果；

图5为实施例2中阳性对照PC-1的检测结果；图6为实施例2中阳性对照PC-2的检测结果；

图7为实施例2中HLA-B*15:02阳性-1的检测结果；

图8为实施例2中HLA-B*15:02阳性-2的检测结果；

图9为实施例2中HLA-B*15:02阴性I-1的检测结果；

图10为实施例2中HLA-B*15:02阴性I-2的检测结果；

图11为实施例2中HLA-B*15:02阴性II-1的检测结果；

图12为实施例2中HLA-B*15:02阴性II-2的检测结果；

图13为实施例2中HLA-B*15:02阴性III-1的检测结果；

图14为实施例2中HLA-B*15:02阴性III-2的检测结果；

图15为验证例1中的阳性样本S109的PCR-SBT的分型结果；

图16为验证例1中的阳性样本S059的PCR-SBT的分型结果；

图17为验证例1中HLA-B*15:02基因检测试剂盒的灵敏度验证01-FAM通道的检测结果图；

图18为验证例1中HLA-B*15:02基因检测试剂盒的灵敏度验证01-VIC/HEX通道的检测结果图；

图19为验证例1中HLA-B*15:02基因检测试剂盒的灵敏度验证02-FAM通道的检测结果图；

图20为验证例1中HLA-B*15:02基因检测试剂盒的灵敏度验证02-VIC/HEX通道的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

首先，本发明提供了一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物，其包括引物对1和引物对2；

所述引物对1的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示；

所述引物对2的碱基序列如SEQ ID No.4～5所示。

发明人经一系列创造性研究，针对HLA-B*15:02基因的特异性位点和区域进行引物设计，提供了上述引物对1和引物对2，仅需要2个反应即可特异的鉴定出HLA-B*15:02基因，减少了操作及结果判读难度，降低了检测成本。

本文中的“引物对1的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示”具体是指，引物对1中的上游引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；引物对2～3依此类推。

本文中的“HLA-B*15:02”中，15是等位基因组别的代码，02是特异等位基因代码。

优选地，所述核酸组合物还包括探针1和/或探针2；

所述探针1的碱基序列如SEQ ID No.3所示；

所述探针2的碱基序列如SEQ ID No.6所示。

优选地，所述核酸组合物还包括用于检测内参基因的引物对3。

本文中的“内参基因”是指内部对照，内参基因在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用于作为参照物，以保证实验结果的准确性。在一些实施例中，对内参基因不作具体限制，只要能够满足内参基因的功能即可。

优选地，所述内参基因为GAPDH，所述引物对3的碱基序列如SEQ ID No.7～8所示。

优选地，所述核酸组合物还包括探针3，所述探针3的碱基序列如SEQ ID No.9所示。

可选地，探针1、探针2和探针3的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。对应该基团和淬灭基团不作具体限制，荧光基团可选自FAM、HEX和TET中的任意一种，荧光淬灭基因可选自BHQ1和TAMPR中的任意一种。

本发明实施例还提供了一种检测HLA-B*15:02基因的试剂盒，其包括如前述任一实施例所述的检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物。

优选地，其包括以下试剂中的至少一种：PCR反应试剂、试剂A和试剂B。

通常在对待测的全血样本进行PCR检测之前，需要进行核酸提取，而常规核酸提取流程需耗时60～90min。介于此，本发明提供了一种可快速处理样本的试剂盒，采用以下试剂A和试剂B对全血样本进行预处理之后，全血样本仅需两步处理即可作为后续荧光定量PCR检测的模板使用，样本处理过程简便、快速，可在5min内完成模板的制备。

所述试剂A包括：蔗糖、Tris-HCl、MgCl

所述试剂B包括：NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。

全血样本的预处理主要包括：将试剂A与全血样本混合，对混合后的产物离心，将离心产物去除上清液后与试剂B混合。

当试剂A与所述全血样本混合时，混合溶液中试剂A各组分的终浓度如下：蔗糖的终浓度为200～400mM，Tris-HCl的终浓度为1～20mM，MgCl

在一些实施例中，蔗糖的终浓度可以为200mM、250mM、300mM、350mM和400mM中的任意浓度；Tris-HCl的终浓度可以为1mM、5mM、10mM、15mM和20mM中的任意浓度；MgCl

当所述离心产物与试剂B混合时，混合溶液中所述试剂B各组分的终浓度如下：NaCl的终浓度为50～150mM，Tris-HCL的终浓度为20～70mM，NaOH的终浓度为20～70mM，EDTA的终浓度为0.5～5mM，SDS的终浓度为0.001％～0.05％。

在一些实施例中，NaCl的终浓度可以50mM、70mM、90mM、110mM、130mM和150mM中的任意浓度；Tris-HCL的终浓度可以为20mM、40mM、60mM和70mM中的任意浓度；NaOH的终浓度可以为20mM、40mM、60mM和70mM中的任意浓度；EDTA的终浓度可以为0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM和5mM中的任意浓度，SDS的终浓度为0.001％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％和0.05％中的任意百分比。

需要说明的是，本发明对试剂A和试剂B的初始浓度不作具体限制，只要检测时，满足上述对各组分终浓度的限制即属于本申请的保护范围内。

优选地，PCR反应试剂可选自以下试剂中的至少一种：PCR缓冲液、海藻糖溶液、DMSO溶液、BSA溶液、dNTP溶液、ROX溶液、MgCl

优选地，在检测过程中，PCR缓冲液的终浓度为2×；海藻糖溶液的终浓度可以为300～500mM；DMSO溶液的终浓度可以为3％～10％；BSA溶液的终浓度可以为0.1～1.0μg/μL、dNTP溶液的终浓度可以为300～500μM、ROX溶液的终浓度可以为60～100μM、MgCl

本发明实施例还提供了一种检测HLA-B*15:02基因的方法，其包括：采用如前述任一实施例所述的检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物或如前述任一实施方式所述的检测HLA-B*15:02基因的试剂盒对待测样本进行荧光定量PCR检测。

所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

优选地，所述待测样本为全血样本。

优选地，在进行荧光定量PCR之前，所述方法还包括对所述全血样本进行预处理；所述预处理包括以下步骤：

将试剂A与所述全血样本混合，将混合后的产物离心，将去除上清液后的离心产物与试剂B混合；

所述试剂A包括：蔗糖、Tris-HCl、MgCl

所述试剂B包括：NaCl、Tris-HCL、NaOH、EDTA、SDS和水。

优选地，当试剂A与所述全血样本混合时，所述试剂A中试剂的终浓度如下：200～400mM蔗糖、1～20mM Tris-HCl、1～10mM MgCl

当所述离心产物与试剂B混合时，所述试剂B中试剂的终浓度如下：50～150mMNaCl、20～70mM Tris-HCL、20～70mM NaOH、0.5～5mM EDTA、0.001％～0.05％SDS。

优选地，所述离心的条件为：8000～12000rpm，离心0.1～2min。在一些实施例中，离心的转速可以为8000、9000rpm、10000rpm、11000rpm和12000rpm中的任意转速，离心时间为0.1min、0.2min、0.4min、0.6min、0.8min、1min、1.2min、1.4min、1.6min、1.8min和2min中的任意时间。

试剂A和试剂B对全血样本的预处理过程简单快速，对样本的需求量少(≤100μL)，为常规核酸提取纯化用量(≥200μL)的一半以下；且预处理过程可在5min内完成，预处理后的全血样本可省略核酸提取步骤，直接进行PCR检测，荧光定量PCR反应过程通常需要50～60分钟，结合预处理步骤，可在1小时内获得HLA-B*15:02的检测结果。预处理步骤在不影响PCR的检测结果的准确性的基础上，显著提高了样本检测的效率。

且预处理试剂(试剂A和试剂B)成本较低，常规核酸提取纯化一例样本的成本约3～6元/样本，而全血样本快速处理试剂及方案试剂成本低于0.1元/样本。本发明提供的核酸组合物及其方法为HLA-B*15:02的快速有效检测提供了一种新的途径。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种试剂盒，其包括：用于检测HLA-B*15:02的核酸组合物、PCR反应液、试剂A和试剂B。

1、用于检测HLA-B*15:02的核酸组合物。

核酸组合物具体包括引物对1～3和探针1～3，具体参照表1。

表1引物和探针

备注：F为上游引物，R为下游引物，P为探针；

探针1～2的3’端连接有FAM荧光基团，5’端连接有BHQ1荧光淬灭基团；

探针3的3’端连接有HEX荧光基团，5’端连接有BHQ1荧光淬灭基团。

具体地，通过对IPD-IMGT/HLA数据库中HLA-B位点7560个等位基因的序列比对，进行HLA-B*15:02特异位点的分析，并根据特异区域的序列特征设计用于RT-PCR检测的ARMS引物及TaqMan探针。

引物对1和探针1是基于内含子5上的特异性序列设计的(图1)，上游引物HLA-B1502-F1位于HLA-B基因g.2131～c.2156处，核心位点为g.2156，并在引物3’端倒数第2位引入错配碱基t，增加扩增特异性；下游引物HLA-B1502-R1位于HLA-B基因g.2233～g.2257处，核心位点为g.2233，并在引物3’端倒数第3位引入错配碱基g，增加扩增特异性；探针1(HLA-B1502-P1)位于HLA-B基因g.2168～g.2189处。

引物对2和探针2是基于外显子2上的特异性序列设计的(图2)，上游引物HLA-B1502-F2位于HLA-B基因c.242～c.261处，并在引物3’端倒数第3位引入错配碱基t，增加扩增特异性；下游引物HLA-B1502-R2位于HLA-B基因c.311～c.333处，核心位点为c.311，并在引物3’端倒数第3位引入错配碱基a，增加扩增特异性；探针2(HLA-B1502-P2)位于HLA-B基因c.270～c.299处。

引物对3和探针3用于监测模板质量和质控试剂性能。

2、试剂A和试剂B的配制。

试剂A按照表2配方进行配制，以配制500mL试剂A为例：在1个1000mL的灭菌试剂瓶中依次加入蔗糖54.786g、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液5mL、1M MgCl

试剂B按照表3配方进行配制，以配制10mL试剂B为例：在1个15mL的无菌离心管中依次加入1M NaCl溶液1000μL、1M Tris-HCl(pH8.0)溶液500μL、1M NaOH溶液500μL、0.5MEDTA(pH8.0)溶液20μL、10％SDS溶液10μL，然后加入7970μL灭菌超纯水，轻轻颠倒混匀后室温保存备用。

表2全血样本快速处理试剂-组分A

表3全血样本快速处理试剂-组分B

3、PCR反应试剂的配制。

2×qPCR Mix混合液(PCR反应试剂)按照表4配方进行配制，以配制1mL2×qPCRMix混合液为例：在1个1.5mL的无菌离心管中依次加入10×PCR缓冲液200μL、1M海藻糖溶液400μL、DMSO溶液60μL、10mg/mL BSA溶液20μL、25mM dNTP溶液16μL、5μM ROX溶液16μL、100mM MgCl

表4 2×qPCR Mix混合液

4、用于检测HLA-B*15:02基因的试剂盒的制备。

4.1、配制HLA-B*15:02qPCR反应的试剂：HLA-B*15:02qPCR反应试剂包括两个反应体系：

体系1按照表5要求的体积依次将2×qPCR Mix、HLA-B1502-F1、HLA-B1502-R1、HLA-B1502-P1、GAPDH-F、GAPDH-R、GAPDH-P和灭菌ddH

体系2按照表5要求的体积依次将2×qPCR Mix、HLA-B1502-F2、HLA-B1502-R2、HLA-B1502-P2、GAPDH-F、GAPDH-R、GAPDH-P和灭菌ddH2O加入到8联排荧光PCR反应管第二个管中；8联管其余反应管中的试剂依次类推进行配置；也可根据试剂需求量，按照表5要求的体积等比例放大后配制HLA-B*15:02qPCR反应体系1和反应体系2试剂，然后按照18μL/反应管将试剂分装于8联排荧光PCR反应管中，每个8联管中的试剂分装顺序可为：反应体系1-反应体系2-反应体系1-反应体系2-反应体系1-反应体系2-反应体系1-反应体系2，每两个相连的反应管为一个完整的检测体系。分装有HLA-B*15:02qPCR反应试剂的8联管，于-20℃避光保存。

表5HLA-B*15:02qPCR反应试剂

4.2、用于检测HLA-B*15:02基因的试剂盒的组装：试剂盒规格为24人份/盒，试剂盒试剂组分包括：

试剂A体积30mL，装于30mL无菌试剂瓶中，室温保存；

试剂B体积3mL，装于5mL无菌离心管中，室温保存；

qPCR反应试剂24人份，共包括6条8联排荧光PCR反应管，-20℃避光保存；

阳性对照品为5ng/μL的HLA-B*15:02阳性DNA，体积40μL，装于0.6mL无菌离心管中，-20℃保存；

空白对照品为灭菌超纯水，体积120μL，装于0.6mL无菌离心管中，-20℃保存。

实施例2

本实施例提供了一种检测HLA-B*15:02基因的方法，采用实施例1提供的试剂盒进行，包括以下步骤。

(1)样本处理：取100μL全血样本，置于1.5mL离心管中，加入1mL试剂A，轻柔颠倒混匀10～15次；10000rpm离心1min，弃去上清液；加入100μL试剂B，涡旋混匀30s，瞬时离心后备用。处理好的样本，可以4℃短期保存，长期保存置于-20℃。

(2)加样：根据需要检测的样本数量n计算所需8联管孔数(2n+4)，从冰箱中取出所需8联管，置于96孔管架上，8联管的管盖尾端朝向左上方；按照2μl/反应孔，将处理好的样本、阳性对照品、空白对照平依次加入到对应的孔位；加样完毕后，盖紧8联管盖，涡旋3sec或用手指轻弹两下8联管底部进行混匀，瞬时离心备用。

(3)上机：取出加样后的八联管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。按照表6设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增。

表6仪器核酸扩增参数

(4)结果分析：

①空白对照检测结果(BC-1～2)：本试剂盒中空白对照为无菌超纯水，反应1的FAM及VIC/HEX通道应无扩增信号或Ct值＞33，且反应2的FAM及VIC/HEX通道应无扩增信号或Ct值＞33(图3和图4)；

②阳性对照检测结果(PC-1～2)：反应1的FAM及HEX(VIC)通道Ct值≤33，且反应2的FAM及HEX(VIC)通道Ct值≤33，扩增曲线均有明显指数增长期(图5和图6)；

③样品检测结果判读：当空白对照和阳性对照结果均合格，且检测样本反应1、反应2的Ct(HEX/VIC)均≤33时，综合反应1、反应2的Ct(FAM)值对HLA-B*15:02检测结果进行判读，当反应1的Ct(FAM)≤33且反应2的Ct(FAM)≤33时，样本为HLA-B*15:02阳性(图7-图8)；反应1的Ct(FAM)＞33且反应2的Ct(FAM)＞33时，样本为HLA-B*15:02阴性(图9和图10)；反应1的Ct(FAM)＞33、反应2的Ct(FAM)≤33时，样本为HLA-B*15:02阴性(图11和图12)；反应1的Ct(FAM)≤33、反应2的Ct(FAM)＞33时，样本为HLA-B*15:13，即HLA-B*15:02阴性(图13和图14)。

验证例1

1、准确性验证

对比实验使用“金标准”的PCR-SBT直接测序法进行：109例全血样本采用常州金麦格生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒进行全基因组DNA提取，基因组DNA浓度应≥30ng/μL，纯度OD260/280应为1.7～2.0。检测合格的基因组DNA样本用于后续PCR-SBT扩增测序。依据IPD-IMGT/HLA数据库中HLA-B位点等位基因的序列信息，设计2条PCR扩增引物及8测序引物用于HLA-B基因Exon 1～Exon 7的扩增和测序(表7)。

表7 HLA-B基因分型检测扩增引物及测序引物

PCR扩增上游引物HLA-B-F位于HLA-B基因的5’端非编码区；下游引物HLA-B-R位于HLA-B基因Intron 7区；扩增产物长度～2757bp，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性20sec，63℃退火30sec，72℃延伸3min，共进行35个循环；72℃终延伸7min。PCR扩增产物直接送上海生工进行Sanger测序，测序引物为HLA-B-Ex2F、HLA-B-Ex2R、HLA-B-Ex3F、HLA-B-Ex3R、HLA-B-Ex4F、HLA-B-Ex4R、HLA-B-Ex5F、HLA-B-Ex5R。测序结果使用HLA分型软件进行判读。

使用PCR-SBT技术对109例血液样本进行HLA-B基因分型检测，分型结果见表8，其中6例样本携带HLA-B*15:02基因，103样本例不携带HLA-B*15:02基因，即HLA-B*15:02阳性样本6例、阴性样本103例，阴性样本中1例样本S109携带HLA-B*15:13基因型，其PCR-SBT分型结果见图15，阳性样本S059 PCR-SBT分型结果见图16。

表8 109例临床血液样本HLA-B*15:02基因检测结果

109例全血样本使用本发明实施例1提供的试剂盒进行全血样本快速处理及荧光定量检测(依照实施例2的方法)，统计样本Ct(FAM)和Ct(HEX)值，依据试剂盒结果判读标准对检测结果进行判读；检测结果与PCR-SBT结果一致的判定统计为真阳/阴性，不一致的统计为假阳/阴性，并计算阴性符合率、阳性符合率及总符合率。

使用本发明HLA-B*15:02基因快速检测试剂盒，空白对照、阳性对照及样本Ct(VIC/HEX)均合格，109例样本检测结果均有效。共检出HLA-B*15:02阳性样本6例，HLA-B*15:02阴性样本103例，

检测结果与预期结果完全一致，阴性符合率、阳性符合率及总符合率均为100％(表9)。

表9本发明试剂盒与PCR-SBT法HLA-B*15:02检测结果比对

本发明HLA-B*15:02基因检测试剂盒进行单样本检测理论耗时～1小时，使用PCR-SBT法进行单样本检测理论耗时＞8小时。实际应用中，使用本发明试剂盒检测同时对109例全血样本进行HLA-B*15:02基因检测，总耗时～5小时，单样本平均耗时2.8分钟；而使用PCR-SBT法对109例全血样本进行检测，总耗时>16小时，单样本检测平均耗时＞8.9分钟；因此，本发明的HLA-B*15:02基因检测试剂盒，与PCR-SBT方法相比，在进行全血样本的HLA-B*15:02基因检测时，在检测总耗时及单样本耗时方面具有明显的优势。

2、灵敏度验证

选取1例HLA-B*15:02阳性样本，采用常州金麦格生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒进行全基因组DNA提取，基因组DNA浓度应≥50ng/μL，纯度OD260/280应为1.7～2.0。

定量后的DNA样本，依次稀释至40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL，稀释后的样本作为模板，使用本发明的HLA-B*15:02基因检测试剂盒进行检测，计算试剂盒灵敏度。

灵敏度验证结果表明，使用本发明实施例1提供的HLA-B*15:02基因检测试剂盒进行检测时，40ng/μL、20ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、2.5ng/μL、1.25ng/μL的阳性样本均可准确检出(表10、图17-图20)，本发明试剂盒的灵敏度可达到1.25ng/μL。

表10本发明HLA-B*15:02基因检测试剂盒灵敏度验证结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 为朔医学数据科技（北京）有限公司

<120> 一种检测HLA-B*15:02基因的核酸组合物及其试剂盒和方法

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctcattact gggaagcagc atctt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccacaaccat caaggcgata cagct 25

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgcagcctg ggaccctgtg tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggagtattg ggaccggtac 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctggttgtag tagccgcgca agt 23

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaagaccaa cacacagact taccgaga 28

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgttccaata tgattccacc cat 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atttccattg atgacaagct tcc 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tccatggcac cgtcaaggct ga 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgcacccac ccggactca 19

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccactctaga ccccaagaat ctcacct 27

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggagggaaat ggcctctg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggggagtc gtgacctg 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttcagttgag gccaaaatcc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cattttcctc ctcttctcgt gg 22

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctcaggctg gtcacatgg 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gaaaggaggg gaagatgagg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctcagggaaa gcaggagcc 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acacttctac ctggggcttg a 21