一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及肌酐检测技术领域，公开了一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品，其特征在于，所述试剂A包括以下组分：1,4‑哌嗪二乙磺酸缓冲液，肌酸脒基水解酶，肌氨酸氧化酶，N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3,5‑二甲氧基‑6‑甲基苯胺钠盐；所述试剂B包括以下组分：1,4‑哌嗪二乙磺酸缓冲液，4‑氨基安替比林，肌酐酰氨基水解酶，过氧化物酶。本发明采用N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3,5‑二甲氧基‑6‑甲基苯胺钠盐（MHDAOS）作为色原，利用苯环上的给电子基甲基，能有效降低羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰。

说明书

技术领域

本发明涉及肌酐检测技术领域，尤其涉及一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒及检测方法。

背景技术

检测血肌酐是常用的了解肾功能的主要方法之一。肾功能不全时，肌酐在体内蓄积成为对人体有害的毒素。血浆肌酐的正常上限值为100微摩尔/升左右。目前临床上常用的肌酐测定方法有苦味酸法和普通酶法。前者原料易得，价格低，但线性范围小，试剂稳定性差，灵敏度低且随时间逐步下降、苦味酸的颜色还会污染设备的比色杯。后者线性范围宽，试剂稳定性好，灵敏度较高，但是易受到羟苯磺酸钙药物的负干扰，使肌酐测定结果明显偏低。

在临床上，羟苯磺酸钙作为一种微血管保护药物，被广泛应用于糖尿病并发症、动脉硬化等疾病的治疗，也常被用于慢性肾功能衰竭病人中作为降肌酐药物。但是，病人血液中高浓度的羟苯磺酸钙(CD)对酶法肌酐项目检测结果会产生严重的负干扰，影响临床诊断。

公开号为CN106198509B的中国专利文献公开了一种用于测定肌酐的试剂盒和方法，所述试剂盒包含试剂组1和试剂组2，所述试剂组1包含肌酸酶、肌氨酸氧化酶、色原和过氧化氢酶，所述试剂组2包含肌酐酶、4-氨基安替吡啉和过氧化物酶，其中，所述色原选自N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺或其钠盐(HDAOS)和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺(DAOS)。该试剂盒通过采用HDAOS或DAOS作为色原，可以有效降低羟苯磺酸钙对肌酐检测造成的负干扰，但程度有限，难以完全消除干扰。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒及检测方法。本发明采用N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐(MHDAOS)作为色原，能有效降低羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰。

本发明的具体技术方案为：

一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒，包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品；所述试剂A包括以下组分：1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液，肌酸脒基水解酶，肌氨酸氧化酶，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐；所述试剂B包括以下组分：1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液，4-氨基安替比林，肌酐酰氨基水解酶，过氧化物酶。

本发明试剂盒的检测机制如下：肌酐在肌酐酰氨基水解酶的催化下分解成肌酸，后者经肌酸脒基水解酶作用后分解成肌氨酸，而后肌氨酸氧化酶将肌氨酸氧化成过氧化氢，在过氧化物酶的催化下，过氧化氢作为氢受体，色原N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐(MHDAOS)与4-氨基安替比林(4-APP)作为氢供体，MHDAOS与4-APP偶联氧化缩合形成红色的醌类化合物。

试剂盒设计成试剂A和试剂B的目的在于：在使用时，先在待测样品中加入试剂A，测量吸光度A1，在加入B试剂反应后再次测量吸光度A2，通过A2-A1可消除空白干扰；此外，在试剂盒存放过程中，MHDAOS与4-APP会与试剂中带入的氧气缓慢反应，生成红色的醌类化合物。

已有专利报道HDAOS、DAOS能减少羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰。本发明采用MHDAOS作为色原，其与HDAOS在分子结构上的差别在于，MHDAOS苯环上的6位C原子上连接有甲基。发明人在实验过程中发现，相较于现有技术中的HDAOS和DAOS而言，MHDAOS抗羟苯磺酸钙干扰能力更强，推测原因可能在于：MHDAOS中，苯环上连接的甲基是给电子基团，能使苯环上的电子云密度增大，从而使苯环上的氢更易脱去，因此，MHDAOS与过氧化氢的反应活性更高，在与羟苯磺酸钙竞争过氧化氢的过程中更具优势。

作为优选，所述试剂A与试剂B的质量比为2.8～3.2:1。

作为优选，试剂A中，所述N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐的含量为1.5～2.0mmol/L。

作为优选，试剂B中，所述4-氨基安替比林的含量为2.5～3.0mmol/L。

作为优选，试剂A中，所述肌酸脒基水解酶的含量为40～80kU/L。

作为优选，试剂A中，所述肌氨酸氧化酶的含量为7～10kU/L。

作为优选，试剂B中，所述肌酐酰氨基水解酶的含量为400～600kU/L。

作为优选，试剂B中，所述过氧化物酶的含量为100～400kU/L。

作为优选，试剂A和试剂B中，所述1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液的浓度为90～110mmol/L，pH为7.0～7.4。

作为优选，所述试剂A还包括含量为2～5kU/L的抗坏血酸氧化酶。

作为优选，所述肌酐校准品为含肌酐的溶液，由90～110mmol/L、pH 7.0～7.4的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和350-400μmol/L的肌酐组成。

作为优选，所述肌酐质控品为含肌酐的溶液，由90～110mmol/L、pH 7.0～7.4的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和150-200μmol/L的肌酐组成。

一种运用上述试剂盒进行肌酐检测的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与试剂A混合后，在35～37℃下孵育5～7min，获得混合液1；测定混合液1的吸光度，记为A1；

(2)将混合液1与试剂B混合后，在35～37℃下孵育5～7min，获得混合液2；测定混合液2的吸光度，记为A2；

(3)将待测样品换成校准品，重复步骤(1)～(2)，测得校准品混合液1的吸光度A3和校准品混合液2的吸光度A4；

(4)计算待测样品的肌酐浓度：待测样品肌酐浓度＝(A2-A1)/(A4-A3)×校准品肌酐浓度。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：采用N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐作为色原，利用苯环上的给电子基甲基，能有效提高色原与过氧化氢的反应活性，降低羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒，包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品。所述试剂A与试剂B的质量比为2.8～3.2:1。

所述试剂A的组分及其在试剂A中的含量如表1。

表1

所述试剂B的组分及其在试剂B中的含量如表2。

表2

所述肌酐校准品为含肌酐的溶液，由90～110mmol/L、pH 7.0～7.4的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和350-400μmol/L的肌酐组成。

所述肌酐质控品为含肌酐的溶液，由90～110mmol/L、pH 7.0～7.4的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和150-200μmol/L的肌酐组成。

一种运用所述试剂盒进行肌酐检测的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与试剂A混合后，在35～37℃下孵育5～7min，获得混合液1；测定混合液1的吸光度，记为A1；

(2)将混合液1与试剂B混合后，在35～37℃下孵育5～7min，获得混合液2；测定混合液2的吸光度，记为A2；

(3)将待测样品换成校准品，重复步骤(1)～(2)，测得校准品混合液1的吸光度A3和校准品混合液2的吸光度A4；

(4)计算待测样品的肌酐浓度：待测样品肌酐浓度＝(A2-A1)/(A4-A3)×校准品肌酐浓度。

实施例1

一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒，包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品。所述试剂A与试剂B的质量比为3:1。

所述试剂A的组分及其在试剂A中的含量如表3。

表3

所述试剂B的组分及其在试剂B中的含量如表4。

表4

所述肌酐校准品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和350μmol/L的肌酐组成。

所述肌酐质控品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和150μmol/L的肌酐组成。

一种运用所述试剂盒进行肌酐检测的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与试剂A混合后，在37℃下孵育6min，获得混合液1；测定混合液1的吸光度，记为A1；

(2)将混合液1与试剂B混合后，在37℃下孵育6min，获得混合液2；测定混合液2的吸光度，记为A2；

(3)将待测样品换成校准品，重复步骤(1)～(2)，测得校准品混合液1的吸光度A3和校准品混合液2的吸光度A4；

(4)计算待测样品的肌酐浓度：待测样品肌酐浓度＝(A2-A1)/(A4-A3)×校准品肌酐浓度。

实施例2

一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒，包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品。所述试剂A与试剂B的质量比为2.8:1。

所述试剂A的组分及其在试剂A中的含量如表5。

表5

所述试剂B的组分及其在试剂B中的含量如表6。

表6

所述肌酐校准品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和350μmol/L的肌酐组成。

所述肌酐质控品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和150μmol/L的肌酐组成。

一种运用所述试剂盒进行肌酐检测的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与试剂A混合后，在35℃下孵育7min，获得混合液1；测定混合液1的吸光度，记为A1；

(2)将混合液1与试剂B混合后，在35℃下孵育7min，获得混合液2；测定混合液2的吸光度，记为A2；

(3)将待测样品换成校准品，重复步骤(1)～(2)，测得校准品混合液1的吸光度A3和校准品混合液2的吸光度A4；

(4)计算待测样品的肌酐浓度：待测样品肌酐浓度＝(A2-A1)/(A4-A3)×校准品肌酐浓度。

实施例3

一种抗羟苯磺酸钙干扰的酶法肌酐检测试剂盒，包括试剂A、试剂B、肌酐校准品和肌酐质控品。所述试剂A与试剂B的质量比为3.2:1。

所述试剂A的组分及其在试剂A中的含量如表7。

表7

所述试剂B的组分及其在试剂B中的含量如表8。

表8

所述肌酐校准品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和350μmol/L的肌酐组成。

所述肌酐质控品为含肌酐的溶液，由100mmol/L、pH 7.2的1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液和150μmol/L的肌酐组成。

一种运用所述试剂盒进行肌酐检测的方法，包括以下步骤：

(1)将待测样品与试剂A混合后，在36℃下孵育5min，获得混合液1；测定混合液1的吸光度，记为A1；

(2)将混合液1与试剂B混合后，在36℃下孵育5min，获得混合液2；测定混合液2的吸光度，记为A2；

(3)将待测样品换成校准品，重复步骤(1)～(2)，测得校准品混合液1的吸光度A3和校准品混合液2的吸光度A4；

(4)计算待测样品的肌酐浓度：待测样品肌酐浓度＝(A2-A1)/(A4-A3)×校准品肌酐浓度。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，将N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐换成苯酚。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，将N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐换成N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，将N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐换成N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺(DAOS)。

测试例

将羟苯磺酸钙(CD；生产商为上海阿拉丁生化试剂有限公司)纯化水，配制成浓度为2g/L的羟苯磺酸钙溶液(记为H)；将H用纯化水对半稀释，配制成浓度为1g/L的羟苯磺酸钙溶液(记为M)；将M用纯化水对半稀释，配制成浓度为0.5g/L的羟苯磺酸钙溶液(记为L)。按以下配方配制混合血清S1～S4：S1：0.95mL血清+0.05mL纯化水(CD浓度0mg/L)；S2：0.95mL血清+0.05mL L(CD浓度25mg/L)；S3：0.95mL血清+0.05mL M(CD浓度50mg/L)；S4：0.95mL血清+0.05mL H(CD浓度100mg/L)。分别采用实施例1、对比例1～3的试剂盒检测混合血清S1～S4中的肌酐含量，每个样本测5次，并计算S2～S4与S1之间的相对偏差。若S2～S4与S1之间的相对偏差＞7％，则认为有干扰；相对偏差越大，则表明干扰越大。检测结果如表9。

表9

从表9可知，采用对比例1的试剂盒，S2～S4与S1之间的相对偏差均大于2％，说明羟苯磺酸钙对肌酐检测会产生负干扰；采用实施例1的试剂盒，S2～S4与S1之间的相对偏差均小于2％，说明本发明采用N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基-6-甲基苯胺钠盐(MHDAOS)作为色原，能消除羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰。

从表9可知，相较于对比例2而言，采用实施例1的试剂盒，S2～S4与S1之间的相对偏差明显减小，说明相较于现有技术中已报道的HDAOS和DAOS而言，采用本发明MHDAOS能进一步减小羟苯磺酸钙对肌酐检测的干扰，推测原因在于：在MHDAOS中，苯环上连接的甲基是给电子基团，能使苯环上的电子云密度增大，从而使苯环上的氢更易脱去，因此，MHDAOS与过氧化氢的反应活性更高，在与羟苯磺酸钙竞争过氧化氢的过程中更具优势。

测试例2

选取市面上肌酐检测试剂盒作为对照组，实施例1作为实验组进行血清比对实验。取40份血清，每份血清均加入羟苯磺酸钙，使之浓度为0.1g/L。血清比对结果见表10。

表10

结果显示实验组血清检测结果高于对照组，故实施例1检测含羟苯磺酸钙血清检测结果优于对照组，故实施例1抗羟苯磺酸钙性能较优。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。