一株老鼠簕内生真菌Diaporthe goulteri及其代谢产物的应用

摘要

本发明公开了一株老鼠簕内生真菌Diaporthe goulteri及其代谢产物的应用，所述老鼠簕内生真菌Diaporthe goulteri是从老鼠簕根中分离得到的真菌，种名为Diaporthe goulteri，该真菌ITS区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明从老鼠簕根部分离得到了一种新的内生真菌品种，丰富了已知红树林内生真菌的种类；而且由该真菌发酵后得到的次级代谢产物的乙酸乙酯提取物经细胞活性试验验证具有明显的抗肿瘤活性，为肿瘤的新型靶向药研究提供了新的物质基础。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域及肿瘤治疗领域，具体是一株老鼠簕内生真菌

背景技术

内生真菌(

老鼠簕(学名：

最近几年，国内外在对红树林内生真菌的研究中取得很好的成果，亦发现不少内生真菌的次级代谢产物在抗肿瘤方面具有一定的活性。如，LI H.x.等人在对红树林Sonneratia apetala的内生真菌次级代谢产物的研究中，得到五个过氧化物，其中有3-7是新的，并且这五个化合物对人体MCF-7、MDA-MB-435、HepG2、HeLa、PC-3癌细胞有很好的抗癌活性，其中化合物2和4对这五种人体癌细胞的IC

综上，从更多的红树林植物中分离纯化得到更多的内生真菌，并对其次级代谢产物进行深入研究，对于新药物的研究与开发具有重要意义。

发明内容

基于此，本发明提供了一株老鼠簕内生真菌

一株老鼠簕内生真菌

所述老鼠簕内生真菌

（1）采集新鲜的老鼠簕根，洗去表面泥土和灰尘后，用无菌滤纸擦干。

（2）将以上老鼠簕根于超净工作台中按照以下程序进行操作：75%乙醇浸泡 1min→0.1%升汞清洗 1min→无菌水冲洗3遍→滤纸吸干水分→材料切割成约0.5×0.5cm小块，接种于PDA培养基，于25℃恒温培养箱静置培养4-7天，观察内生真菌的生长情况。

（3）挑取组织边缘菌丝尖端部分转入新的PDA培养基中进行纯化，经多次纯化后得到单一的菌落。

以上分离纯化得到的内生真菌

以上所述的老鼠簕内生真菌

所述提取物的制备方法如下：

（1）将内生真菌

（2）将种子液接种至大米固体培养基中，在室温下静置培养30天。

（3）往培养基中加入乙酸乙酯使其没过培养基平面，在室温下浸泡24小时后，利用超声辅助提取，过滤回收提取液，滤渣重复提取2次，合并滤液。

（4）滤液在40℃下减压浓缩得到粗提物，粗提物冻干后放置在-20℃下贮藏。

所述大米固体培养基是由大米和蒸馏水以1:7的质量比混合后在121℃下灭菌30min制得的。

本发明的有益效果是：

本发明从老鼠簕根部分离得到了一种新的内生真菌品种，丰富了已知红树林内生真菌的种类。另外本发明还通过将分离纯化得到的内生真菌

附图说明

图1为老鼠簕内生真菌

图2为老鼠簕内生真菌

图3为老鼠簕内生真菌

图4表示老鼠簕内生真菌

图5表示老鼠簕内生真菌

具体实施方式

为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1

本申请人从广西山口红树林国家级保护区采集了一批新鲜的老鼠簕根、茎、叶，经如下步骤对其分别进行分离纯化：

（1）对新鲜采集的老鼠簕根、茎、叶，洗去表面泥土和灰尘后，用无菌滤纸擦干。

（2）将以上老鼠簕根、茎、叶于超净工作台中分别按照以下程序进行操作：75%乙醇浸泡 1min→0.1%升汞清洗 1min→无菌水冲洗3遍→滤纸吸干水分→材料切割成约0.5×0.5cm小块，接种于PDA培养基，于25℃恒温培养箱静置培养4-7天，观察内生真菌的生长情况。

（3）挑取组织边缘菌丝尖端部分转入新的PDA培养基中，于25℃恒温培养箱继续静置培养4-7天。

（4）再从步骤（3）的PDA培养基中挑取组织边缘菌丝尖端部分转入新的PDA培养基中，于25℃恒温培养箱继续静置培养4-7天。经多次扩繁纯化后得到单一的菌落。

其中，从老鼠簕根部分离得到的单一菌落中发现一株菌丝为白色夹杂黄色，菌丝边缘爬壁，基质随生长时期变化由白色变为黄褐色的真菌，真菌在PDA培养基中的形态见图1。本申请人将该真菌编号为AIL-R-03，然后将菌株交予南宁国拓生物科技有限公司进行双向测序，ITS区的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，序列通过NCBI数据库对比后，确定AIL-R-03菌株为

本申请人首先将从老鼠簕根部分离得到的内生真菌

提取物的制备方法如下：

（1）将内生真菌

（2）再将种子液以5 mL/瓶接种至大米固体培养基（70g大米，105mL蒸馏水，121℃下灭菌30min）中，在室温下静置培养30天。菌株在大米固体培养基中的形态见图3。

（3）往培养基中加入乙酸乙酯使其没过培养基平面，在室温下浸泡24小时后，超声处理15分钟，过滤回收提取液；滤渣再加入适量乙酸乙酯进行超声处理15分钟，过滤回收提取液；滤渣继续加入适量乙酸乙酯进行超声处理15分钟，过滤回收提取液，合并3次滤液。

（4）滤液在40℃下减压浓缩得到粗提物，粗提物用真空冷冻干燥机冻干后放置在-20℃冰箱贮藏备用。

采用CCK8法测定提取物的毒性作用：

（1）将卵巢癌SKOV3细胞、结肠癌HCT-116细胞用含10%FBS（新生牛血清）的McCoy’s5A培养基培养，前列腺癌PC3细胞用含10%FBS的1640培养基培养。

（2）待细胞长至铺满培养瓶底部80-90%时，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心5min后弃去上清液，加入新鲜的完全培养基吹打细胞，得到细胞悬液，用血细胞计数板进行计数。

（3）将计数后的细胞悬液用完全培养基稀释成2×10

（4）将老鼠簕内生真菌

（5）将以上母液用PBS稀释成药物浓度为100μg/mL的稀释液，使得样品中DMSO的终浓度不高于0.1%，再将样品过0.22μm微孔滤膜，得到样品药液。

（5）每孔加入100μL样品药液，同时设置阴性对照组（每孔加入100μL PBS）和空白组（每孔加入200μL样品药液），每组设置3个复孔，继续培养72h后弃去培养基和药物，每孔再加入新鲜的完全培养基100μL，在避光条件下，每孔加入10μL CCK8溶液，加入CCK8溶液时，尽量插到培养基液面以下，避免出现气泡影响OD值；然后置于37℃、5%CO

初步筛选结果显示老鼠簕内生真菌

为了进一步确定老鼠簕内生真菌

序列表

<110> 广西医科大学

<120> 一株老鼠簕内生真菌Diaporthe goulteri及其代谢产物的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 老鼠簕内生真菌(Diaporthe goulteri)

<400> 1

ggagggatca ttgctggaac gcgcccctgg cgcacccaga aaccctttgt gaactcatac 60

ctaccgttgc ctcggcgcag gccggccccc ctcaccgggg gccccccgga gacggggagc 120

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