一株银杏内生真菌的代谢产物产品及其在抗菌中的应用

摘要

本公开涉及一株银杏内生真菌的代谢产物产品及其在抗菌中的应用，所用的真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，经发酵培养和提取分离获得银杏内生真菌的代谢产物。本公开的银杏内生真菌的代谢产物在抗大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌活性检测中显示了较明显的抑制作用，具有制备新的抗菌产品的潜在用途。

说明书

技术领域

本公开属于微生物药物领域，具体涉及一株银杏内生真菌的代谢产物产品及其在抗菌中的应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，其引起的大肠杆菌病是一种常见的疾病，兽医临床上大肠杆菌造成的危害十分严重，一年四季均可致病，一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病，给养禽业造成了严重的经济损失。在治疗过程中容易产生耐药性，且耐药谱广，耐药机制复杂，给养禽业预防和治疗该病带来了很大困难。因此寻找一种对抗大肠杆菌有效的成分成为近年来的研究热点。

金黄色葡萄球菌是医院内、外感染最常见的病原菌之一，中国细菌耐药监测网多年来在全国数十所医院获得的临床分离细菌菌株表明，金黄色葡萄球菌占临床致病菌前5位。该菌可以引起严重肺炎、脑膜炎以及骨关节感染、心内膜炎和菌血症。尤其是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病患者易感染该菌。近年来，对一些药物敏感性降低的金黄色葡萄球菌的出现，将使人类面临某些感染无药可治的局面。因此，寻找一种对抗金黄色葡萄球菌有效的成分具有重要意义。

CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》公开了一株从银杏树皮中分离到了具有抗宫颈癌活性的银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，其还公开了该内生真菌的发酵培养液、发酵培养液的乙酸乙酯提取物针对宫颈癌具有治疗活性。

进一步开展银杏植物内生真菌活性物质的研究，对开发我国银杏植物药用内生真菌资源及新的微生物药物均具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

发明内容

针对背景技术，本公开对CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》作进一步研究和探索，提供了一株银杏内生真菌的代谢产物产品及其在制备抗菌产品中的应用。

本公开具体采用以下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供了一株银杏内生真菌的代谢产物产品，其特点是：所用的真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCCNo.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，经发酵培养和乙酸乙酯提取后得到发酵培养液的乙酸乙酯提取物，然后再经过甲醇或水溶解，溶解后即获得银杏内生真菌的代谢产物产品。

在本公开的第二个方面，提供了一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，该方法包括：所用的真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，经发酵培养和乙酸乙酯提取后得到的发酵培养液的乙酸乙酯提取物，然后再经过甲醇或水溶解，溶解后的溶解液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。

在本公开的第三个方面，提供了所述银杏内生真菌的代谢产物产品在制备抗菌产品中的应用。

在本公开的第四个方面，提供了一种抗菌组合物，以所述的银杏内生真菌的代谢产物产品为活性成分。

在本公开的第五个方面，提供一种抗菌方法，该方法包括使用所述银杏内生真菌的代谢产物产品或所述抗菌组合物抑制细菌的步骤。

本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

本公开的银杏内生真菌的代谢产物在抗大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌检测中显示了较明显的抑制作用，具有制备新的抗菌产品的潜在用途。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1：17^#(17-1和17-2)样品的正离子色谱图。

图2：18^#(18-1和18-2)样品的正离子色谱图。

图3：17^#(17-1和17-2)样品的负离子色谱图。

图4：18^#(18-1和18-2)样品的负离子色谱图。

图5：17^#和18^#银杏内生真菌粗提物甲醇溶液对大肠杆菌的抑制效果。

图6：17^#和18^#银杏内生真菌粗提物水溶液对大肠杆菌的抑制效果。

图7：17^#和18^#银杏内生真菌粗提物甲醇溶液对金黄色葡萄球菌的抑制效果。

图8：17^#和18^#银杏内生真菌粗提物水溶液对金黄色葡萄球菌的抑制效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

本申请人对之前的研究成果CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》作进一步研究和探索，提出了一株银杏内生真菌的代谢产物产品，其特点是：所用的真菌为CN108102928A中银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，经发酵培养和乙酸乙酯提取后得到发酵培养液的乙酸乙酯提取物，然后再经过甲醇或水溶解，溶解后的溶解液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，提供发酵培养和乙酸乙酯提取的方法，包括：挖取PDA固体培养基中培养好的银杏内生真菌，将菌丝块接种于PDA液体培养基中，20～28℃、100～150r/min摇床培养5～7d；然后按1:1～2:1的体积比加入乙酸乙酯(乙酸乙酯和发酵液体积比为1:1-2:1)，继续在摇床中培养4～8d；发酵液经过滤后除菌丝体，再进行分层，获得含有银杏内生真菌次级代谢产物的有机相；回收乙酸乙酯，得到含有银杏内生真菌次级代谢产物的浓缩液；最后，将浓缩液干燥，即为发酵培养液的乙酸乙酯提取物。

其中，PDA固体培养基和PDA液体培养基为现有技术中常规的马铃薯培养基，配方可选择但不仅仅局限于：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g和水1000mL；或者，马铃薯200g、葡萄糖20g和水1000mL。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，发酵液与乙酸乙酯的体积比例为1：1～1:2。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述银杏内生真菌的代谢产物产品的活性成分包括但并不仅仅限于甜菜碱、东莨菪素、去氢骆驼蓬碱、迷迭香酸、奥昔嘌醇、白藜芦醇、柚皮素、儿茶素、花旗松素和黄腐酚。

进一步的，甲醇溶解后得到的银杏内生真菌的代谢产物产品活性成分包括但并不仅仅限于甜菜碱、东莨菪素、去氢骆驼蓬碱、迷迭香酸、奥昔嘌醇、白藜芦醇、柚皮素、儿茶素、花旗松素和黄腐酚。

在本公开的一个具体的实施方式中，甜菜碱、东莨菪素、去氢骆驼蓬碱、迷迭香酸、奥昔嘌醇、白藜芦醇、柚皮素、儿茶素、花旗松素和黄腐酚为HPLC图中峰面积在10⁵以上的峰代表的物质。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述银杏内生真菌的代谢产物如表3第6列或第7列所示。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，乙酸乙酯提取物与甲醇或水的比例为(0.01～0.05)g:1mL；进一步的比例为0.02g:1mL。

在本公开的一个典型的实施方式中，提供了一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，该方法包括：所用的真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，已于2017年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，经发酵培养和乙酸乙酯提取后得到发酵培养液的乙酸乙酯提取物，然后再经过甲醇或水溶解(5～30min)，溶解后即获得甲醇或水溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品。

在本公开的一个具体的实施方式中，溶解后过滤膜；进一步的，所述滤膜的孔径为0.22μm。

在本公开的又一个典型的实施方式中，提供所述银杏内生真菌的代谢产物产品在制备抗菌产品中的应用。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述抗菌产品为抗菌药物或其他制剂。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述银杏内生真菌的代谢产物产品能够抗大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述甲醇溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品能够抗大肠杆菌。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述甲醇或水溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品能够抗大肠杆菌/或金黄色葡萄球菌。

在本公开的一个典型的实施方式中，提供了一种抗菌组合物，以所述的银杏内生真菌的代谢产物产品为活性成分。

在本公开的一个具体的实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体，载体选自稀释剂、分散剂、稳定剂、崩解剂、润滑剂中的一种或几种，如淀粉、羧甲基纤维素钠、甘油等其中的一种或多种。

在本公开的一个典型的实施方式中，提供了一种抗菌方法，该方法包括使用所述银杏内生真菌的代谢产物产品或所述抗菌组合物抑制细菌的步骤，其中，所述细菌为大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一种发酵培养液的乙酸乙酯提取物的制备方法，可参考CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》的实施例2中内容。

具体的，该方法包括：挖取PDA固体培养基中培养好的银杏内生真菌，将菌丝块接种于装有250ml PDA液体培养基的三角瓶中，20℃、120r/min摇床培养7d。然后向每个培养瓶中按1:1的体积比加入乙酸乙酯，继续在摇床中培养4d。发酵液经3-4层纱布过滤后除菌丝体，用分液漏斗进行分层，获得含有银杏内生真菌次级代谢产物的有机相。利用旋转蒸发仪将有机相中大多数乙酸乙酯回收，得到含有银杏内生真菌次级代谢产物的浓缩液。最后，利用真空浓缩干燥器将浓缩液完全干燥，即为发酵培养液的乙酸乙酯提取物。其中，所述银杏内生真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，编号17^#对应CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中的J-1菌株。或者，所述银杏内生真菌为CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中的J-2菌株，编号18^#。

一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，将所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物采用甲醇进行溶解，所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物和甲醇的比例为0.02g：1mL，溶解10min后得到的溶解液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。

实施例2

一种银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，将实施例1中所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物采用水进行溶解，所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物和水的比例为0.02g/mL。其中，所述银杏内生真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，编号17^#对应CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中的J-1菌株。

实施例3

一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，将实施例1所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物采用甲醇或水进行溶解，所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物和甲醇或水的比例为0.02g/mL，溶解10min后过0.22μm滤膜，得到的滤液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。其中，所述银杏内生真菌为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC No.14983，编号17^#对应CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中的J-1菌株。或者，所述银杏内生真菌为CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中的J-2菌株，编号18^#。最终得到17^#样品，即：甲醇溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品或者水溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品；18^#样品，即：甲醇溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品或者水溶解后的银杏内生真菌的代谢产物产品。

实施例4

一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，该方法包括：挖取PDA固体培养基中培养好的银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)DZHQ1，将菌丝块接种于装有250ml PDA液体培养基的三角瓶中,25℃、100r/min摇床培养6d。然后向每个培养瓶中按2:1的体积比加入乙酸乙酯，继续在摇床中培养3d。发酵液经3-4层纱布过滤后除菌丝体，用分液漏斗进行分层，获得含有银杏内生真菌次级代谢产物的有机相。利用旋转蒸发仪将有机相中大多数乙酸乙酯回收，得到含有银杏内生真菌次级代谢产物的浓缩液。最后，利用真空浓缩干燥器将浓缩液完全干燥，即为发酵培养液的乙酸乙酯提取物，将所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物采用甲醇或水进行溶解，所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物和甲醇或水的比例为0.02g/mL，溶解10min后得到的溶解液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。

实施例5

一株银杏内生真菌的代谢产物产品的制备方法，该方法包括：

挖取PDA固体培养基中培养好的三株银杏内生真菌，将菌丝块接种于装有250mlPDA液体培养基的三角瓶中,28℃、140r/min摇床培养8d。然后向每个培养瓶中按1.5:1的体积比加入乙酸乙酯，继续在摇床中培养5d。发酵液经3-4层纱布过滤后除菌丝体，用分液漏斗进行分层，获得含有银杏内生真菌次级代谢产物的有机相。利用旋转蒸发仪将有机相中大多数乙酸乙酯回收，得到含有银杏内生真菌次级代谢产物的浓缩液。最后，利用真空浓缩干燥器将浓缩液完全干燥，将所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物采用甲醇或水进行溶解，所述发酵培养液的乙酸乙酯提取物和甲醇或水的比例为0.02g/mL，溶解10min后得到的溶解液即为银杏内生真菌的代谢产物产品。

实施例6 LC-MS非靶向代谢组学检测

1.1材料

1.1.1样本基本信息

样品(实施例1中的发酵培养液的乙酸乙酯提取物)共2组(17^#,18^#)，每组2个平行，共计4个样本(17-1、17-2、18-1、18-2)。

1.1.2试剂

水(water，屈臣氏)、试剂：质谱乙腈(Fisher)，甲酸(Sigma-Aldrich)

1.1.3仪器

仪器信息表1

1.2方法

1.2.1代谢物提取

向样品中加入1mL甲醇溶解(样品：甲醇＝0.02g：1mL)10min，过0.22μm滤膜后进样。

1.2.2液相色谱-质谱分析条件

本实验的分析仪器为Q Exactive plus，Thermo,离子源为ESI。

1.色谱条件

色谱柱为Waters Atlantis T3(100×3mm,1.8mm)。柱温为35℃。流速为0.500[ml/min]。

流动相：A.Equate＝"0.1v/v％HCOOH-H₂O"

D.Equate＝"acetonitrile"

色谱条件见下表：表2

2.质谱条件

扫描范围选择m/z 80–1200；

分辨率：70,000；

Spectrum data type：Profile；

Capillary voltage：4000V(positive)and 3500 V(negative)；

Capillary Temp:350℃.

2结果与分析

2.1正离子色谱图

如图1和2。

2.2负离子色谱图

如图3和4。

2.3物质鉴定

将LC-MS的原始数据导入MS-DIAL 2.76(MS-DIAL:data independent MS/MSdeconvolution for comprehensive metabolome analysis.Nature Methods,12,523-526,2015)软件进行预处理，包括峰提取、去噪音、反卷积，峰对齐，导出CSV格式的三维数据矩阵(原始数据矩阵)。将提取的峰信息与数据库进行比对，对MassBank，Respect，GNPS(共14951个records)三个库进行全库检索。这个三维矩阵包括的信息有：样品信息、保留时间、质核比和质谱响应强度(峰面积)。

2.4结果分析

鉴定结果如下表3。

表3

本次液质鉴定到的物质见上表3，其中发明人经过调研，已有报道的主要活性组分(主要活性组分指峰面积在10⁵以上的峰代表的物质)，17^#包括：甜菜碱、东莨菪素、去氢骆驼蓬碱、迷迭香酸、奥昔嘌醇、白藜芦醇、柚皮素、山奈酚、儿茶素、花旗松素和黄腐酚；18^#包括：东莨菪素、去氢骆驼蓬碱、迷迭香酸、奥昔嘌醇、白藜芦醇、柚皮素、山奈酚、儿茶素、花旗松素和黄腐酚。

由于液质检测只能检出目前已知的化合物，所以本次液质结果分析出了部分具有抗肿瘤和抗菌活性的组分，因此对于发酵液中是否还含有未知的活性化合物还有待于进一步研究。

实施例5体外抑菌研究

1、实验步骤：

将待检测菌接种到装有100ml LB液体培养基的三角瓶中，37℃下，120r/min摇床培养10到12个小时。制作100ml LB固体培养基，灭菌后放凉到合适的温度，在超净工作台中加入待检测菌菌液(标准每100ml固体培养基加入100微升菌液)，摇匀倒平板，静置凝固。在凝固好平板背面分区，一般分为三到四个区域，标好每个区域所加样品。在每个区域最好是正中央的部分稳稳地放上牛津杯，轻压，但保证不能让杯子插入到平板里。放好以后，每个杯中加入100微升到200微升的样品(所述样品为实施例3中得到的17^#银杏内生真菌的代谢产物产品、18^#银杏内生真菌的代谢产物产品)。平稳地将平板放到37℃培养箱中，9到12个小时进行结果观察。

注：本公开了选取了多种银杏内生真菌进行实验，对银杏内生真菌进行编号，选取相对较好的实验结果呈现在本公开中，其中17^#、18^#分别对应CN108102928A《一株银杏内生真菌及其应用》中J-1和J-2，17^#菌株为银杏内生真菌层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)DZHQ1，保藏编号为CGMCC>

2、实验结果：

2.1对大肠杆菌抑制效果

图5为实施例3中的银杏内生真菌17^#、18^#粗提物的甲醇溶液以及甲醇对大肠杆菌抑制作用的实验结果。其中17^#代表银杏内生真菌17^#的粗提物的甲醇溶液；18^#代表的是银杏内生真菌18^#的粗提物的甲醇溶液；“甲”代表的是甲醇溶液。从图中可以发现17^#银杏内生真菌，抑菌圈直径是0.9cm。18^#内生真菌与甲醇溶液的抑制效果很微弱，几乎没有。

图6为实施例3中的银杏内生真菌粗提物的水溶液对大肠杆菌的抑制效果。其中17^#B代表银杏内生真菌17^#的粗提物的水溶液；18^#B代表的是银杏内生真菌18^#的粗提物的水溶液；“水”代表的是水溶液。从图中可以看出，两者都没有抑菌效果。

综上所述，银杏内生真菌17^#、18^#中，17^#内生真菌对大肠杆菌的抑制效果较明显，其次是18^#内生真菌的效果并不是很明显，效果几乎为0。此外，从该实验也可看出，不同溶剂提取的代谢产物的对大肠杆菌的抑制效果不同。17^#粗提物的甲醇溶液对大肠杆菌的抑制效果较为明显。

2.2对金黄色葡萄球菌抑制效果

采用实施例3中的17^#样品或18^#样品进行牛津杯抑菌试验。结果如下：

图7为实施例3中的银杏内生真菌粗提物甲醇溶液对金黄色葡萄球菌抑制效果。实验结果中，17^#和18^#有一定的抑制效果，抑菌圈直径分别为2cm和2.9cm。

图8为实施例3中的银杏内生真菌粗提物水溶液对金黄色葡萄球菌抑制效果，通过观察可以发现虽然有的抑菌圈不是很清晰，但是能够看出17^#内生真菌代谢产物有一定的抑菌效果，18^#内生真菌代谢产物抑菌效果为微弱，几乎没有。

结果显示，17^#和18^#银杏内生真菌对金黄色葡萄球菌有一定的抑制效果。从该实验也可看出，不同溶剂提取的代谢产物的对金黄色葡萄球菌的抑制效果不同。17^#粗提物的甲醇溶液和水溶液对金黄色葡萄球菌均有较明显的抑制效果。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。