用于检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用

摘要

本发明提供一组检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用，所述KASP引物组KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的共用引物1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物3；以该KASP引物组为引物，以待测小麦基因组为模板进行PCR扩增，若扩增结果显示待测小麦基因分型与扬麦15相同，则该待测小麦含有等位基因T；反之，则待测小麦含有等位基因C；含有等位基因T的小麦小穗数着生密度高于含有等位基因C的小麦；该检测方法可快速而直观获得小麦品种小穗数着生密度高低的结果，适用于大规模育种筛查。

说明书

技术领域

本申请涉及小麦育种领域，特别是一组用于检测小麦小穗着生密度高低的 KASP引物组及其应用。

背景技术

小麦是世界主要的粮食作物之一，小麦产量与小麦穗部性状高度相关，性状间关系错综复杂，小麦穗部性状主要是小穗数、穗长、小穗着生密度、穗粒数、穗粒重等，其中穗长、小穗着生密度、穗粒数、穗粒重是由主基因与微效多基因共同控制，而小穗数由多基因控制，无主基因存在。小麦小穗着生密度是指单位穗长的着生小穗数量(小穗着生密度＝单个穗子的总小穗数/穗长)，其与小麦籽粒产量密切相关，小穗着生密度高的小麦品种结实小穗数更多，更容易获得高产。

田间无法直观的测定小穗着生密度，必须要先测定穗长和总小穗数，计算后才能确定小穗着生密度，因此在育种中要检测大量材料间的小穗着生密度高低需要的工作量繁重。

国内外对小穗着生密度的遗传研究偏少，已有研究发现小穗着生密度主基因遗传率高达88.69％—92.14％，受环境影响小，育种中早代选择结果可靠性较高 (参考文献：魏艳丽，王彬龙，李瑞国，蒋会利，张安静.大穗小麦穗部性状的遗传分析，麦类作物学报，2015,35(10):1366-1371)，分别在1A、3A、2D、4B、 4D、6B、6D等染色体上(参考文献：刘凯，邓志英，李青芳，张莹，孙彩铃，田纪春，陈建省.利用高密度SNP遗传图谱定位小麦穗部性状基因，中国农业科学，2016，42(6)：820-831；)。

分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可在苗期进行选择，操作简便，有利于育种早代选择。单核苷酸多态性 (SNP)标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析，目前市场中已存在多种适用于不同动植物的SNP芯片，在遗传育种中发挥十分重要的作用。通过遗传分析挖掘到重要性状的连锁标记后，需要将其转化为易于使用的分子标记。Kompetitive AlleleSpecific PCR(KASP)标记技术通过荧光探针，可以将SNP标记的不同等位变异区分，通量高、快速、稳定，是一种育种使用便捷的分子标记。

扬麦15和扬麦13均是江苏里下河地区农业科学研究所育成的小麦品种，扬麦15粒重高、株高矮，产量高，相比而言，扬麦13株高偏高，粒重与产量与扬麦15相当，而且两者均是全国少有的优质弱筋小麦，经过多年性状考察发现，扬麦15的小穗着生密度是1.85个/cm—1.95个/cm，扬麦13的小穗着生密度是 1.60个/cm—1.70个/cm，而普通小麦的小穗着生密度是1.65—1.75个/cm，扬麦 15呈现的是显著的高于普通小麦和扬麦13的小穗着生密度，因此挖掘扬麦15 控制小穗着生密度的主效QTL并开发成可供育种使用的连锁分子标记对于分子标记辅助选择小穗着生密度高低的小麦育种工作十分重要。目前暂未有对扬麦15小穗着生密度的遗传基础的公开研究报道。

发明内容

针对上述问题，本发明，利用illumina 90K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦15的1个与小穗着生密度相关的主效QTL位点YM15- SC-5A，其紧密连锁标记是RAC875_c8690_446，并据此开发了1个KASP标记引物组Y15-SC-KASP，用以对小穗着生密度高低进行高效筛选，本发明是通过如下方案实现的：

本发明首先提供了与小麦小穗着生密度相关的KASP引物组，该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1(共用上游引物)，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2(下游引物)，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物3(下游引物)；上述KASP引物组可特异性检测5A染色体上的标记 RAC875_c8690_446。

其次，本申请还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3所示的 KASP引物组在鉴定小穗着生密度中的应用。

进一步而言，上述KASP引物组可特异性检测在鉴定小穗着生密度中的应用是指，以待测小麦基因组DNA为模板，利用KASP引物组Y15-SC-KASP为引物进行PCR扩增，PCR扩增同时加入扬麦15的DNA作为对照，然后利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并用KlusterCaller软件(KBioscience)对5A染色体上144.40—145.70CM处的标记RAC875_c8690_446进行基因分型，根据分析结果确定小穗着生密度相关位点连锁的SNP标记RAC875_c8690_446的基因型(其对应变异的位点是T/C)；若基因分型结果与扬麦15相同，则携有优势等位基因T，反之，则携有等位基因C，含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。因此将其转化为成简易、高通量的KASP(Kompetitive allele specific PCR，http://www.lgcgroup.com/kasp)标记(PolyMarker， http://polymarker.tgac.ac.uk/)YM15-SC-KASP引物组，利于区分优势等位基因和非优势等位基因。

进一步而言，上述样品小麦优选同一生态区种植的小麦。

进一步而言，上述步骤所述的PCR检测是指：

KASP标记引物工作液的制备：

分别取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)30μL(100μM)，下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用；

PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液 0.08μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；

PCR反应程序：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65–57℃ (每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min， 32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照 (NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA(参考文献：Stacey J,Isaac PG.Isolation ofDNAfrom plants.Methods Mol.Biol.1994,28:9–15.)

具体检测方法为：以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、 PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000

第三，本申请还提供了上述KASP引物组所特异性扩增的分子标记 RAC875_c8690_446，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且该核苷酸序列自5’端起第51位碱基为SNP位点，存在T/C等位基因。

第四，本申请还提供了一种鉴定小麦小穗着生密度的PCR检测试剂盒，该PCR 检测试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物3。

进一步而言，上述PCR检测试剂盒包括：浓度为30ng/μL的待测小麦DNA模板 2μL、引物工作液0.08μL、KASP Master Mix 2.5μL、无菌超纯水补充至5μL；所述引物工作液包括：浓度为100μM的引物130μL、浓度为100μM的引物212μL、浓度为100μM的引物312μL，以无菌超纯水补充至100μL。

本申请首次于小麦5A染色体发现标记RAC875_c8690_446，因组特异性最好、与小穗着生密度相关性最显著，并转化为KASP标记引物组YM15-SC-KASP，经验证利用这个标记可快速对小麦小穗着生密度进行筛选，为筛选同一生态区携带优异等位变异的小麦材料提供便捷，提高育种效率。

本申请KASP检测适用于长江中下游地区选育的品种(系)。

附图说明

图1为5A的部分遗传连锁图谱及小穗着生密度QTL定位示意图；

图中，a、b、c分别代表2016年、2017年和平均值定位到的小穗着生密度QTL， QTL右侧对应LOD值。

图2为RAC875_c8690_446标记序列等位基因示意图。

图3为实施例1中KASP标记验证部分RIL家系的试验标记扩增检测结果示意图。

图4为实施例2中KASP标记应用在部分小麦品系的试验标记扩增检测结果示意图。

具体实施方式

实施例中涉及的小麦品种和品系由江苏里下河地区农业科学研究所小麦研究室提供

实施例1筛选稳定的显著与小穗着生密度相关的SNP位点并且验证

本实施例以198份来源于“扬麦15×扬麦13”的重组自交系(F

采用CTAB法(参考文献：Stacey J,Isaac P G.Isolation ofDNA from plants.Methods Mol.Biol.1994,28:9–15.)提取基因组DNA，利用illumina90K芯片获取基因型，并构建遗传图谱。利用IciMapping v4.1软件(http://www.isbreeding.net) 过滤和去冗余基因型数据。利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，与已有的小麦90K整合图谱比对，以确定每条染色体的长臂和短臂，利用MapChart2.3 (https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1 的完备区间作图法(Inclusivecomposite interval mapping，ICIM)检测与小穗着生密度显著相关的QTL，LOD阈值设为2.5。

实验获得1个相对稳定的与小穗着生密度相关的位点QYM15-SC-5A，增效基因来源于扬麦15，即增加小穗着生密度的基因来源于扬麦15，QTL峰值位置在5A染色体上144.40—145.70CM，对应标记区间为 BS00068178_51—RAC875_c8690_446和 RAC875_c8690_446—wsnp_Ex_c5626_9897389(附图1、表1)，相距1.3个CM，表型贡献率达到12.90％—25.31％。

表1 QY15-SC-5A遗传效应及其侧翼标记

如图1所示，本申请通过QTL作图检测到1个增效基因来源于扬麦15的与小穗着生密度相关的位点QYM15-SC-5A，QTL峰值位置在5A染色体上 144.40—145.70CM，在2015—2016年对应标记区间为 BS00068178_51—RAC875_c8690_446，2016—2017年和平均值对应标记区间为RAC875_c8690_446—wsnp_Ex_c5626_9897389，经过与小麦参考基因组比对发现位于小麦5A染色体长臂的末端，与前人报道的位于5A染色体短臂的 Qsc-5A.1、Qsc-5A.2、Qsc-5A.3、Qsc-5A.4完全不一致，(参考文献：孙中沛，刘天相，左希亚，赵璟琛，王中华，李春莲.普通小麦穗部性状QTL分析，麦类作物学报，2017,37(4)：452—457，涉及标记Xbarc316、IWA825、IWA3530、 IWA6166、IWA6412、Xbarc319、IWA3355)。申请人进一步从QTL区间中依据标记同源性初步筛选SNP标记，选择区间中特异性高、与小穗着生密度相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化，确定RAC875_c8690_446标记的基因组特异性最好、与小穗着生密度相关性最显著，其侧翼序列是SEQ ID NO.4，利用 Polymarker(http://polymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设计，引物由华美瑞康(北京)国际生物技术研究院有限公司合成。最终成功将RAC875_c8690_446标记转化为KASP标记Y15-SC-KASP，其对应的变异位点是T/C，即核苷酸序列 SEQ ID NO.4自5’端起第51位碱基存在T/C等位基因(SNP)位点，如图2所示；小麦育种来说，小穗着生密度高的是优势等位变异，扬麦15携有优势等位变异T，携有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。

本实施例针对该SNP位点设计YM15-SC-KASP引物组，包括核苷酸序列如 SEQ IDNO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，以及核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的引物3。其中引物1作为共用引物，为上游引物，引物2和引物3为下游引物。上游引物(引物1)保证了PCR扩增的5A染色体特异性，下游引物(引物2和引物3)的3’末端为标记RAC875_c8690_446的等位变异碱基T/C的互补碱基A/G。

KASP标记引物工作液的制备：

取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)30μL(100μM)，分别取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)各12μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。

PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液 0.08μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；

PCR反应程序：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65–57℃ (每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min， 32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA(参考文献：Stacey J,Isaac PG.Isolation of DNA from plants.Methods Mol.Biol.1994,28:9–15.)

以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行 PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000

从198份“扬麦15×扬麦13的重组自交系”中随机选取74个家系连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经 Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦15相同，即证明这些小麦在分子标记RAC875_c8690_446侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.4)的第51位碱基(SNP位点)的基因型为T；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦15分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为C；附图3中左下角显示为黑色的样本为空白对照。74个家系连同两个亲本的KASP 检测结果和大田试验结果如表2、表3和图3所示。

表2 74个家系和亲本的小穗着生密度平均值和KASP分型结果

由表2可见，含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。

表3携带RAC875_c8690_446不同基因型的部分RIL家系的小穗着生密度平均值T测验结果

表3所示利用Excel 2019的双样本T测验74个RIL家系的基因型和表型，结果表明：扬麦15基因型为T，扬麦13基因型为C，74个家系中基因型为T 的家系比基因型为C的家系小穗着生密度平均值高12.0％，在p<0.01水平上有显著差异，说明上述KASP标记Y16-GF-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦小穗着生密度分子标记辅助育种中(表3统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。附图3显示材料分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。

实施例2 KASP引物组育种应用

田间试验：本实施例以来源于江苏里下河地区农科所2018年和2019年种植于湾头实验基地的小麦育种鉴定圃80份长江中下游地区选育的高代品系为材料，于2019年和2020年小麦灌浆期调查品系的主茎穗长，每穗小穗数，每个品系随机调查30个单株的主茎，穗长，每穗小穗数，取30个单株的平均值，计算每个系的平均小穗着生密度(单个穗子的总小穗数/穗长)，取2年平均值，利用实施例1获得的KASP引物组对江苏里下河地区农科所2018—2020年种植于湾头实验基地小麦育种鉴定圃的80份高代品系进行基因分型(检测结果见附图 4和表4)。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦15相同，即证明这些小麦品系在分子标记RAC875_c8690_446的基因型为T；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经KlusterCaller软件分析聚集与扬麦15分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为C，含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。

表4 80份高代品系的小穗着生密度平均值和基因型检测结果

表5携带不同基因型的供试品系的小穗着生密度平均值T测验结果

表5参考文献：“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9 月”。表5Excel 2019的双样本T测验结果表明：基因型为T的品种比基因型为C的品种小穗着生密度平均值高14.74％，T测验结果t＝8.15，在p<0.01水平上有极显著差异，表明含有等位基因T的小麦小穗着生密度高于含有等位基因C的小麦。同时说明上述KASP标记YM15-SC-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦小穗着生密度的分子标记辅助选择育种中。

由上述实验结果可以得出：通过引物1、引物2、引物3对小麦基因组DNA 进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦15的小穗着生密度高的基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效。

序列表

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 用于检测小麦小穗数着生密度的KASP引物组及其应用

<141> 2021-01-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcatctcgtg tgatctcata ccgaa 25

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tgctttgctt tatgcccata cca 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tgctttgctt tatgcccata ccg 43

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221> mutation

<222> (51)..(51)

<223> t为c

<400> 4

ggcttgatat ctgcatgagg cgtcatctcg tgtgatctca taccgaatag tggtatgggc 60

ataaagcaaa gctatacgac tatagaaatg ttcaatgact g 101