用于检测扬麦系列小麦赤霉病抗性的KASP引物组及应用

摘要

本发明提供一组用于检测扬麦系列小麦品种(系)赤霉病抗性的KASP引物组及其应用，所述KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物3；以该KASP引物组为引物，以待测小麦基因组为模板进行PCR扩增，然后利用多功能酶标仪检测PCR扩增产物并进行基因分型，若分型结果显示待测小麦基因分型与扬麦4号相同，则该待测小麦含有等位基因G；反之，则待测小麦含有等位基因A；含有等位基因G的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因A的小麦；该检测方法可快速而直观获得小麦品种赤霉病抗感基因型的结果，适用于大规模育种筛查。

说明书

技术领域

本申请涉及小麦育种领域，特别是一组用于检测扬麦系列小麦品种(系)赤霉病抗性的KASP引物组及其应用。

背景技术

长江中下游麦区一直是我国小麦赤霉病的重发区，选育抗赤霉病的小麦品种是该麦区重要育种目标。据报道，2012～2015年江苏省年均赤霉病发生面积约 120万hm

扬麦4号、扬麦5号、扬麦158、扬麦16、扬麦23、扬麦25和扬麦29等扬麦系列品种分别是长江中下游麦区不同年代的代表性品种，赤霉病抗性稳定，一直被国内育种单位作为赤霉病抗源使用，而且这些抗赤霉病的扬麦品种具有共同的抗源扬麦4号，此前有关该抗源的研究不多，其中主效抗病基因尚不清楚。传统的抗源例如苏麦3号、望水白等农艺性状差，难以在育种上利用，而扬麦品种综合农艺性状优良，推测其赤霉病抗性基因与产量和农艺性状之间没有连锁累赘，在小麦抗赤霉病遗传改良中更易于利用。因此，加快研究扬麦品种的抗赤霉病遗传基因并应用于抗性育种改良，将改变目前小麦抗赤霉病育种主要依赖Fhb1等难以同步提高丰产性的局面，为抗赤霉病育种提供有效的抗病基因和材料来源，具有十分重要的理论与实践价值。

扬麦4号衍生的扬麦品种(系)有扬麦5号和扬麦158，扬麦5号和扬麦158 衍生的品种有扬麦9号、扬麦10号、扬麦11、扬麦12、扬麦16、扬麦17、扬麦18、扬麦19和扬17G83，扬麦9号衍生系有扬麦20、扬麦22，扬麦16衍生系有扬麦23、扬麦26、扬麦28和扬14-214，扬麦17衍生系有扬麦24、扬麦25 和扬麦29，扬麦18衍生系有扬麦30和扬麦33，扬麦19衍生系有扬麦27，扬麦系列品种(系)的赤霉病抗性的共同来源是扬麦4号。已有文献通过分子标记检测研究表明扬麦品种不携带公认的抗赤霉病基因Fhb1。目前暂未有对扬麦4 号抗赤霉病基因的遗传基础的公开研究报道。

发明内容

针对上述问题，为了快速鉴定扬麦系列品种(系)赤霉病抗性，并能使扬麦系列品种(系)携有的控制赤霉病抗性的基因/位点在以扬麦4号、扬麦5号、扬麦158等为亲本的小麦育种中得到可靠应用，本申请根据赤霉病抗感品种之间存在的序列差异，设计了一个一般在实验室可操作、易于分辨的KASP引物组，并将其应用于小麦赤霉病抗性的分子标记辅助育种中。以通过选择特异性分子标记并将其应用于以扬麦系列品种(系)为亲本的抗赤霉病分子标记辅助育种中，进而有效提高小麦杂交育种早世代赤霉病抗性选择的效率。

具体而言，本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

首先，本申请提供了一对用于鉴定扬麦系列小麦赤霉病抗性的KASP引物组，该KASP引物组包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示的引物2，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的共用引物3；其中，引物1和引物2是上游引物，引物3是下游引物。

其次，本申请还提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3所示的 KASP引物组在鉴定扬麦系列赤霉病抗性中的应用。

进一步而言，上述KASP引物组在鉴定扬麦系列小麦赤霉病抗性中的应用是指，以待测小麦基因组DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.3所示的KASP引物组为引物进行PCR扩增，然后利用多功能酶标仪检测 PCR扩增产物，以Kluster Caller软件进行基因分型，以检测小麦2D染色体上的AX109179673分子标记中的SNP位点的基因型，若KASP检测待测小麦基因分型与扬麦4号相同，则证明该待测小麦基因分型为G，反之，则证明待测小麦基因分型为A，含有等位基因G的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因A的小麦；等位基因G是优势等位基因。

本申请发现小麦2D染色体上的AX109179673分子标记中的SNP位点(A/G) 与赤霉病抗性的显著相关性，因此将其转化为成简易、高通量的KASP (Kompetitive allelespecific PCR，http://www.lgcgroup.com/kasp)标记(PolyMarker， http://polymarker.tgac.ac.uk/)YM-FHB-KASP引物组，利于区分优势等位基因(G) 和非优势等位基因(A)。

进一步而言，上述PCR扩增是指：PCR反应体系：浓度为30ng/μL的待测小麦DNA模板2μL、引物工作液0.08μL、KASP Master Mix 2.5μL、无菌超纯水补充至5μL；所述引物工作液包括：12μL核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1(100μM)、12μL核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的引物2(100μM)、 30μL核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物3(100μM)、无菌超纯水补充至100μL；

PCR反应程序；第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65–57℃ (每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min， 32个循环。

第三，本申请还提供了上述KASP引物组所特异性扩增的分子标记 AX109179673，该分子标记的侧翼核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，且该核苷酸序列自5’端起第36位碱基为SNP位点，存在G/A等位基因。

第四，本申请还提供了一种用于检测扬麦系列品种(系)赤霉病抗性的PCR 检测试剂盒；具体而言，该PCR检测试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的共用引物3。

进一步而言，本申请提供的用于检测扬麦系列品种(系)赤霉病抗性的PCR 试剂盒包括：浓度为30ng/μL的待测小麦DNA模板2μL、引物工作液0.08μL、 KASP Master Mix 2.5μL、无菌超纯水补充至5μL；

所述引物工作液包括：12μL核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1(100 μM)、12μL核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2(100μM)、30μL核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的共用引物3(100μM)、菌超纯水补充至100μL。

本申请中，小麦赤霉病抗性鉴定方法是指：赤霉病抗性接种鉴定在田间进行，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10

本申请中，术语“扬麦系列”即“扬麦系列品种(系)”，包括：扬麦4号、扬麦158、扬麦9号、扬麦10号、扬麦11、扬麦12、扬麦16、扬麦17、扬麦 18、扬麦19、扬麦20、扬麦22、扬麦23、扬麦24、扬麦25、扬麦26、扬麦27、扬麦28、扬麦29、扬麦30、扬麦33、扬17G83、扬14-214等以扬麦4号为亲本繁育的品种(系)及后代。

本发明的有益在于：针对扬麦系列品种(系)设计用于检测赤霉病抗性的 KASP引物组，通过该引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，若KASP分型结果显示AX109179673的基因型与扬麦4号相同，则说明待测小麦有扬麦4号抗赤霉病的基因型G；反之，则说明待测小麦AX109179673的基因型与扬麦4 号不同，其含有等位基因A；含有等位基因G的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因A的小麦。利用该KASP引物可以快速而直观获得小麦品种赤霉病抗性结果，适用于大规模育种筛查，可以有效提高小麦杂交育种早世代赤霉病抗感选择的有效性，结果非常直观，不需要通过测序或者比较条带的大小。

附图说明

图1为“偃展1号×扬麦4号”RIL群体2DL部分遗传连锁图及Qfhb-yaas-2DL 遗传位置示意图；

图中，a-c分别代表2018年、2019年和2020年定位到的抗赤霉病QTL，

QTL右边对应LOD值。

图2为SNP位点示意图。

图3为实施例基因分型结果示意图。

图3采用多功能酶标仪对PCR扩增产物进行扫描，FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下确定抗赤霉病位点连锁的SNP标记 AX109179673的基因型：若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller 软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近Y轴的位置，为样本集合1，则待测小麦的基因型为G，其中包括扬麦4号及扬麦系列品种(系)；若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近X轴的位置，为样本集合2，则待测小麦的基因型为A，是其他非扬麦系列品种(系)，左下角显示为黑色的样本为空白对照，为样本3。

具体实施方式

实施例中涉及的小麦品种均由江苏里下河地区农业科学研究所小麦研究室提供、小赤霉病抗性接种鉴定在田间进行，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10

实施例1筛选与扬麦系列品种(系)抗赤霉病QTL相关SNP位点并设计特异性引物

本实施例利用将赤霉病抗性差异明显的2个小麦亲本扬麦4号和偃展1号杂交产生F1，通过单粒传法加代，自交8代，建成151个RIL群体用于QTL定位。RIL群体在2017年，2018年，2019年分别种植于江苏里下河地区农业科学研究所湾头试验基地，并于2018年、2019年、2020年分别参照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》对RIL群体进行了赤霉病抗性鉴定。利用植物基因组DNA提取试剂盒(天根 DP305)提取DNA，采用中国农业科学院作物科学研究所与中玉金公司合作开发的小麦55K芯片对试验材料进行基因组扫描，采用ICimapping软件进行RIL 群体的连锁作图和QTL定位分析，LOD阈值设为2.5。

偃展1号×扬麦4号”RIL群体2DL部分遗传连锁图及Qfhb-yaas-2DL位置如图1所示，其中，(a)为小麦RIL群体2DL部分遗传连锁图，(b)为Qfhb-yaas-2DL 位置示意图，其纵坐标与QTL相对应。由图1可见，扬麦4号的抗赤霉病位点位于染色体2D的长臂上，该QTL在3年(2018—2020)均能检测到，LOD平均值是6.0，对赤霉病抗性的表型贡献率为10.5％—19.5％，是一个主效QTL。位点的峰值遗传位置在46.6cM，对应基因组上的物理位置是550.0Mb，小麦2D 染色体上报道过的抗赤霉病位点是来自武汉1号的QFhb.hbaas-2DL，位于2D 染色体的513.1Mb处(参考文献：Jiang GL et al,QTL analysis of resistance toFusarium head blight in the novel wheat germplasm CJ9306.I,Resistance tofungal spread,Theor Appl Genet,116:3-13；Somers DJ et al,Molecular mapping ofnoval genes controlling Fusarium head blight resistance and deoxynivalenolaccumulation in spring wheat in spring wheat,Genome,46:555-564。|Zhu ZW et al,Genome-Wide association analysis of Fusarium head blight resistance inChinese elite wheat lines, Frontiers in plant science,2020,11,206,doi:10.3389/fp)，其对应的连锁标记是 Xgwm539，本实施例也应用该标记筛选了遗传群体，结果发现该标记定位在遗传距离为70.9cM的位置，证明扬麦4号的抗赤霉病位点Qfhb-yaas-2DL与以往 2D上报道的的抗赤霉病基因/位点不在同一位置(物理位置相差大于30Mb，遗传位置相距24.3cM)，并且来自武汉1号的QFhb.hbaas-2DL不能用于验证大多数抗赤霉病的扬麦系列的品种(系)的赤霉病抗性，例如对扬麦18、扬麦30、扬麦33、扬17G83和扬14-214等均不能有效检测，基因型与抗赤霉病的表型不能对应(文献来源：朱展望，利用全基因组连锁分析和关联分析定位小麦赤霉病抗性基因及分子标记开发，中国农业科学院，2020年8月，32页，蒋正宁等，扬麦品种(系)赤霉病抗扩展性基因分子检测及其抗性评价，麦类作物学报，2019， 39(12)：1406—1415)。证明本实施例在扬麦4号中定位到的是一个不同于以往报道过的抗赤霉病QTL位点，且能用于检测大多数的扬麦品种(系)的赤霉病抗性。

随即对亲本样本进行重测序、660K芯片检测等大量序列分析、比对、筛选以及预实验，发现2DL上的SNP标记AX109179673分子标记的侧翼序列具有较好的特异性，侧翼序列如SEQ ID NO.4，其对应变异的SNP位点是A/G，如图2所示。因此将其转化为成简易、高通量的KASP(Kompetitive allele specific PCR，http://www.lgcgroup.com/kasp)标记YM-FHB-KASP引物组。

KASP标记YM-FHB-KASP引物组的获得：针对核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示的SNP标记AX109179673的侧翼序列，其第36位碱基为SNP位点，存在等位基因A/G(如图2所示)，即在实际小麦材料中该位置碱基为A或G。

根据染色体特异性和KASP引物设计的一般原则，设计成套KASP引物组，由引物1、引物2和引物3组成。上游引物(引物1和引物2)的3’末端为标记AX109179673 的等位变异碱基A/G，下游引物(引物3)保证了PCR扩增的2D染色体特异性。上游引物5’端连接有荧光标签序列。

具体引物序列信息如下：YM-FHB-KASP引物组：引物1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示 (5’–

KASP标记YM-FHB-KASP的实施：

KASP标记引物工作液的制备：

分别取上游引物(引物1和引物2)各12μL(100μM)，取下游引物(共用引物3)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP 标记的引物工作液备用。

PCR扩增反应体系：含有DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08 μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL。

PCR反应程序如下：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、 65–57℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA 的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

以待测小麦基因组DNA为模板(提取方法为取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA，如文献“Stacey J,Isaac P G.Isolation of DNA from plants.MethodsMol.Biol.1994,28:9–15.”中公开的方法)，采用所述KASP标记或所述引物组和所述PCR试剂或所述试剂盒进行PCR扩增。

PCR反应在S1000

本实施例分别对以下小麦品种进行检测：

1)扬麦系列品种(系)：扬麦4号、扬麦158、扬麦9号、扬麦10号、扬麦 11、扬麦12、扬麦16、扬麦17、扬麦18、扬麦19、扬麦20、扬麦22、扬麦23、扬麦24、扬麦25、扬麦26、扬麦27、扬麦28、扬麦29、扬麦30、扬麦33、扬17G83、扬14-214；

2)非扬麦系列品种：浙麦1号、绵阳15、矮孟牛Ⅳ、矮孟牛Ⅴ、冀麦26、鲁麦14、宁春10号、绵阳26、鄂麦16、鄂麦17、淮麦20、周麦18、宁春4 号、信阳12矮、烟农19、偃展1号、偃展4110、淮麦33、中麦175、周麦 22、丰德存麦1号、济麦22、济麦52、济麦44、济麦23。

检测结果如图3所示，根据分析结果按照如下确定抗赤霉病位点连锁的SNP 标记AX109179673的基因型：结果显示，扬麦系列品种(系)小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件(KBioscience)分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近Y轴的位置，与扬麦4号相同，为样本集合1，则证明待测小麦在分子标记AX109179673侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.4所示)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为G；非扬麦系列品种(系)小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近X轴的位置，与扬麦4号不相同，为样本集合2，则待测小麦在该位点的基因型为A。图3左下角显示为黑色的样本为空白对照。

实施例2田间实验

进一步利用传统的小麦赤霉病抗性接种鉴定在田间进行，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10

表2 48个供试品种(系)3年赤霉病抗性鉴定结果和KASP分型结果

表3携带AX109179673不同基因型的供试品种的病小穗率平均值T测验结果

表2可以看出，基因型为G的品种均比基因型为A的品种平均病小穗率低，这与实施例1中PCR检测结果相同，验证了基因分型的准确性。

表3利用Excel 2019对供试品种(系)的三年病小穗率平均值进行T测验结果表明：基因型为G的品种比基因型为A的品种三年病小穗率平均值低33.87％，在p<0.01水平上有显著差异，说明含有等位基因G的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因A的小麦。同时说明上述KASP标记YM-FHB-KASP的引物组及基因型检测体系可以应用于以扬麦系列品种(系)为亲本的抗赤霉病分子标记辅助育种中(表3统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。

由上述实验结果可以得出：通过引物1、引物2、引物3对小麦基因组DNA 进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带系列品种抗赤霉病基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效。

序列表

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 用于检测扬麦系列小麦赤霉病抗性的KASP引物组及应用

<141> 2021-01-29

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttacggagca gatggaaagg a 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttacggagca gatggaaagg g 41

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgcagggga cgctacca 18

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221> mutation

<222> (36)..(36)

<223> g为a

<400> 4

ccagattcga atcacgtacg gagcagatgg aaagggagaa gacgctcagg cacaccaatt 60

ttaccttgag a 71