细胞的基因组异常评价方法

摘要

本发明提供一种细胞的基因组异常评价方法，无需评价的专业性，简便且迅速并且为非侵袭性的。基因组异常评价方法将在培养基中经培养的多能干细胞或由多能干细胞进行分化诱导而得的细胞作为被检验细胞，评价所述被检验细胞是否有基因组异常，且所述方法包括下述步骤：测定被检验细胞的培养上清液中的指标物质的存在量；以及基于所述指标物质的存在量来评价所述被检验细胞是否有基因组异常，所述指标物质为选自由脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚及苏糖酸所组成的组群中的至少一个，基于所述至少一个指标物质的存在量来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的基因组异常评价方法，更详细来说，本发明涉及一种无需评价的专业性，简便且迅速并且为非侵袭性的细胞的基因组异常评价方法。

背景技术

诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS细胞)或胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)等多能干细胞可分化为构成人体的所有细胞，作为再生医疗用的细胞供给源而备受关注。为了将这些细胞用于再生医疗用途，需要大量培养iPS细胞或ES细胞。另一方面已知，若这些细胞反复分裂，则基因组发生异常[染色体个数的异常、染色体的形状异常(染色体的一部分转移至其他染色体的异常、染色体的某部分的朝向相反的异常)]的危险增高(非专利文献1、非专利文献2)。对于基因组发生了异常的细胞来说，引起癌化的可能性也提高，因而必须在移值细胞之前确认是否未发生所述基因组异常。

作为染色体的解析法，通常采用下述方法：培养一定数量的细胞后，利用秋水仙酰胺(colcemid)溶液使分裂停止，以低渗溶液进行处理后，利用甲醇/乙酸等进行固定。然后，在载玻片(slide glass)上制作标本，进行吉姆萨染色(Giemsa stain)或G带/Q带处理等后，进行显微镜观察。参照非专利文献3(日本染色体基因检查Vol.32No.1 2014，pp60-89)。

日本专利特表2010-508815号公报(WO2008/066655号公报)中公开了下述方法：对培养与受精及着床有关的卵母细胞时、培养基中的成分进行分析，诊断染色体异常。所述公报中，对象细胞为卵母细胞，并无与多能干细胞有关的公开。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特表2010-508815号公报

专利文献2：WO2008/066655号公报

非专利文献

非专利文献1：路易斯C.洛朗(Louise C.Laurent)等人，“人胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的细胞增殖和多能性基因拷贝数在重编程和培养过程中的动态变化(DynamicChanges in the Copy Number of Pluripotency and Cell Proliferation Genes inHuman ES and iPS Cells during Reprogramming and Time in Culture)”，细胞-干细胞(Cell Stem Cell)8，106-118，January(一月)7，2011

非专利文献2：“筛选不同种族的人类胚胎干细胞，识别20号染色体赋予生长优势的微小扩增子(Screening ethnically diverse human embryonic stem cellsidentifies a chromosome 20minimal amplicon conferring growth advantage)”，自然-生物技术第29卷(Nature Biotechnology volume 29)，1132-1144(2011)

非专利文献3：日本染色体基因检查学会,“染色体基因检查的品质保证指南第2版”(Guidelines for Quality Assurance of Chromosomal and Genetic TestingSecond Edition)，日本染色体基因检查Vol.32No.1 2014，pp60-89

发明内容

[发明所要解决的问题]

所述非专利文献3所公开的染色体的解析法除了包含前处理操作而其顺序烦杂以外，还利用显微镜进行目测观察，因而评价需要专业性。因此，通常委托外部进行解析评价。此时，到获得解析结果需要几周至几个月。

而且，所述解析法中，均必须对细胞进行侵袭性处理，因而在进行染色体的解析后，无法将供所述评价的细胞用于其他目的，例如无法作为再生医疗用的细胞源。

本发明的目的在于提供一种细胞的基因组异常评价方法，无需评价的专业性，简便且迅速并且为非侵袭性的。

[解决问题的技术手段]

本发明者等人进行了努力研究，结果发现，可基于培养上清液中的特定的指标物质的存在量来评价细胞的基因组异常，以至完成本发明。

本发明包含以下发明。

(1)一种基因组异常评价方法，将在培养基中经培养的多能干细胞或由多能干细胞进行分化诱导而得的细胞作为被检验细胞，评价所述被检验细胞是否有基因组异常，且所述方法包括下述步骤：

测定被检验细胞的培养上清液中的指标物质的存在量；以及

基于所述指标物质的存在量来评价所述被检验细胞是否有基因组异常，

所述指标物质为选自由脱氧胞苷(deoxycytidine)、犬尿氨酸(kynurenine)、腐胺(putrescine)、丙氨酸(alanine)、半胱氨酸(cysteine)、胱硫醚(cystathionine)及苏糖酸(threonic acid)所组成的组群中的至少一个，

基于所述至少一个指标物质的存在量来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

(2)根据所述(1)所记载的基因组异常评价方法，还包括下述步骤：

测定对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量，所述对照细胞已知具有正常型染色体，

针对所述至少一个指标物质，将所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量进行比较，由此进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

(3)根据所述(2)所记载的基因组异常评价方法，其中，针对所述至少一个指标物质，基于所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量相对于所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量之比是否为预定的阈值以上或者是否为阈值以下，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

(4)根据所述(3)所记载的基因组异常评价方法，其中，在所述指标物质为脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、胱硫醚或苏糖酸的情况下，基于所述比是否为预定的阈值以下，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

(5)根据权利要求3所记载的基因组异常评价方法，其中，在所述指标物质为丙氨酸或半胱氨酸的情况下，基于所述比是否为预定的阈值以上，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

(6)根据所述(1)至(4)中任一项所记载的基因组异常评价方法，其中，选择所述指标物质中的选自由腐胺、脱氧胞苷及犬尿氨酸所组成的组群中的至少一个作为指标物质。

(7)根据所述(1)至(6)中任一项所记载的基因组异常评价方法，其中，选择所述指标物质中的两种以上作为指标物质。

(8)根据所述(1)至(7)中任一项所记载的基因组异常评价方法，其中评价18号染色体是否有异常。

(9)根据所述(1)～(8)中任一项所记载的基因组异常评价方法，其中使用液相色谱质谱分析仪(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS)来测定所述培养上清液中的所述指标物质的存在量。

一种细胞的培养方法，包括下述工序：基于由所述(1)至(9)中任一项所记载的方法所得的基因组异常评价结果，来挑选所述被检验细胞。

本发明的基因组异常评价方法将在培养基中经培养的多能干细胞或由多能干细胞进行分化诱导而得的细胞适用作被检验细胞。但是，不限于多能干细胞，也可适用于在培养基中经培养的普通细胞。多能干细胞为胚胎干细胞(Embryonic Stem cells，ES细胞)或诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stemcells，iPS细胞)等。

本发明中，关于所述培养上清液中的所述指标物质的存在量，可使用任何方法来进行测定。代表性的方法可举出：气相色谱分析法(Gas Chromatography，GC)、液相色谱分析法(Liquid Chromatography，LC)、质谱分析法(Mass Spectrometry，MS)、液相色谱质谱分析法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)、气相色谱质谱分析法(GasChromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)。

[发明的效果]

根据本发明，为了解析细胞的染色体，只要采集培养上清液即可，因而无需以往那样的烦杂的前处理，可在短时间内获得解析结果。而且，无需如以往那样对细胞进行侵袭性处理，因而可在染色体的解析后，将被检验细胞用作再生医疗用的细胞源等。

即，根据本发明，无需如以往那样使用显微镜来目测观察染色体，无需染色体的目测观察的专业性。而且，评价顺序简便，可迅速进行基因组异常的评价。

附图说明

图1为对本发明的一实施例的细胞的基因组异常评价方法进行说明的示意图。

图2为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸的存在量的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为面积比。面积比＝指标物质的面积值/内标物质的面积值。图3～图8中，横轴及纵轴表示相同内容。

图3为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质胱硫醚的存在量的经时变化的图表。

图4为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸的存在量的经时变化的图表。

图5为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸的存在量的经时变化的图表。

图6为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸的存在量的经时变化的图表。

图7为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺的存在量的经时变化的图表。

图8为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷的存在量的经时变化的图表。

图9为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸的存在量的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为面积比。面积比＝指标物质的面积值/内标物质的面积值。图10～图15中，横轴及纵轴表示相同内容。

图10为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸的存在量的经时变化的图表。

图11为表示实施例中、有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸的存在量的经时变化的图表。

图12为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸的存在量的经时变化的图表。

图13为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺的存在量的经时变化的图表。

图14为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷的存在量的经时变化的图表。

图15为表示实施例中，有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过孔(well)的摄像所求出的细胞被覆率的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为细胞被覆率。

图16为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸(Threonic acid)的存在量的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为面积比/细胞被覆率。面积比＝指标物质的面积值/内标物质的面积值。图17～图21中，横轴及纵轴表示相同内容。

图17为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸(Kynurenine)的存在量的经时变化的图表。

图18为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸(Cysteine)的存在量的经时变化的图表。

图19为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸(Alanine)的存在量的经时变化的图表。

图20为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺(Putrescine)的存在量的经时变化的图表。

图21为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷(Deoxycytidine)的存在量的经时变化的图表。

图22为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸的培养上清液中的Δ浓度/Δ细胞被覆率(ΔConc/ΔConfluency)的图表。纵轴为ΔConc/ΔConfluency。图23～图27中，纵轴表示相同内容。

图23为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图24为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图25为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图26为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图27为表示实施例中，有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

具体实施方式

本发明的基因组异常评价方法将在培养基中经培养的多能干细胞或由多能干细胞进行分化诱导而得的细胞作为被检验细胞，评价所述被检验细胞是否有基因组异常，且所述方法包括下述步骤：

测定被检验细胞的培养上清液中的指标物质的存在量；以及

基于所述指标物质的存在量来评价所述被检验细胞是否有基因组异常。

所述指标物质、即生物标志物(biomarker)为选自由脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚及苏糖酸所组成的组群中的至少一个，

所述评价步骤中，基于所述至少一个指标物质的存在量来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

本发明中，被检验细胞为在培养基中经培养的多能干细胞或由多能干细胞进行分化诱导而得的细胞。多能干细胞为胚胎干细胞(Embryonic Stem cells，ES细胞)或诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells，iPS细胞)等。这种多能干细胞在培养基中进行培养的期间中反复分裂，基因组发生异常[染色体个数的异常、染色体的形状异常(染色体的一部分转移至其他染色体的异常、染色体的某部分的朝向相反的异常)]的危险增高。因此，必须确认细胞是否未发生基因组异常。

本发明的优选形态中，基因组异常评价方法还包括下述步骤：测定对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量，所述对照细胞已知具有正常型染色体。本形态的情况下，所述评价步骤中，针对所述至少一个指标物质，将所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述对应的指标物质的存在量进行比较，由此进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

本发明的另一形态中，基因组异常评价方法中，也可代替已知具有正常型染色体的对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量的测定步骤，而将已知具有正常型染色体的对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量预先注册于文库，使用基于所述预先制作的文库的、对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量。此时，所述被检验细胞的培养条件必须与用于制作文库的培养条件相同或近似。

作为用于培养被检验细胞及培养对照细胞的培养基，可使用培养干细胞通常所使用的培养基，例如杜尔贝科改良伊格尔培养基/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12，DMEM/F12)或以所述DMEM/F12作为主成分的培养基(例如mTeSR1、TeSR-E8、必需-8(Essential-8)等)。表1中示出DMEM/F12的结构成分。

[表1]

本发明中，所述指标物质为选自由脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、丙氨酸、半胱氨酸、胱硫醚及苏糖酸所组成的组群中的至少一个。

所述指标物质中，脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、胱硫醚或苏糖酸在所述被检验细胞有基因组异常的情况下，与不存在基因组异常的正常型细胞的情况相比，有减少的倾向。另一方面，所述指标物质中，丙氨酸或半胱氨酸在所述被检验细胞有基因组异常的情况下，与不存在基因组异常的正常型细胞的情况相比，有增加的倾向。

本发明的优选形态中，基因组异常评价方法针对所述至少一个指标物质，基于所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量相对于所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量之比是否为预定的阈值以上或者是否为阈值以下，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

比＝(所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量)/(所述对照细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量)

当所述指标物质为脱氧胞苷、犬尿氨酸、腐胺、胱硫醚或苏糖酸时，在所述被检验细胞有基因组异常的情况下，与不存在基因组异常的正常型细胞的情况相比，可见所述指标物质减少的倾向。因此，可基于所述比是否为预定的阈值以下，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

当所述指标物质为丙氨酸或半胱氨酸时，在所述被检验细胞有基因组异常的情况下，与不存在基因组异常的正常型细胞的情况相比，可见所述指标物质增加的倾向。因此，可基于所述比是否为预定的阈值以上，来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。

所述形态的情况下，阈值可由本领域技术人员预先规定。阈值也可视所培养的被检验细胞株而不同。

本发明中，从可在不存在基因组异常的正常型细胞与有基因组异常的细胞之间确认到存在量的显著差异的观点来看，也推荐选择所述指标物质中的选自由腐胺、脱氧胞苷及犬尿氨酸所组成的组群中的至少一种作为指标物质。

而且，本发明中，也优选的是选择所述指标物质中的两种以上作为指标物质。通过基于两种以上的指标物质的存在量来进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价，从而可进行准确度更高的评价。

本发明中，尤其可评价18号染色体是否有异常。

而且，本发明的另一形态中，也有时代替已知具有正常型染色体的细胞，而将已知具有某特定异常型染色体的细胞作为对照细胞。本形态的情况下，本基因组异常评价方法可还包括下述步骤：测定已知具有某特定异常型染色体的对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量。或者，也可将已知具有某特定异常型染色体的对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量预先注册于文库，使用基于所述预先制作的文库的、对照细胞的培养上清液中的指标物质的存在量。此时，所述被检验细胞的培养条件必须与用于制作文库的培养条件相同或近似。

而且，在将已知具有某特定异常型染色体的细胞作为对照细胞的形态的情况下，所述评价步骤中，针对所述至少一个指标物质，将所述被检验细胞的培养上清液中的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的培养上清液中的所述对应的指标物质的存在量进行比较，由此进行所述被检验细胞是否有基因组异常的评价。即，若可认定所述被检验细胞的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的所述对应的指标物质的存在量为相同行为，则可判断为，所述被检验细胞具有与所述对照细胞的异常型染色体相同的、特定异常型染色体。若可认定所述被检验细胞的所述指标物质的存在量、与所述对照细胞的所述对应的指标物质的存在量为不同行为，则可判断为，所述被检验细胞不具有所述对照细胞的异常型染色体。此时，可判断为所述被检验细胞有可能具有正常型染色体，或者具有与所述对照细胞的异常型染色体不同的异常型染色体。

关于测定培养上清液中的所述指标物质的存在量的方法，可使用利用气相色谱分析装置(GC)、液相色谱分析装置(LC)或质谱分析装置的定量分析，尤其可合适地使用利用液相色谱质谱分析装置(LC-MS)或气相色谱质谱分析装置(GC-MS)的定量分析，但不限定于此。例如，也可将对培养上清液实施了规定前处理的试样与洗提液一起流入至液相色谱(LC)装置的管柱，利用紫外可见光分光检测器或红外分光检测器等检测器对经管柱分离而洗脱的成分进行检测，根据检测结果来求出试样中所含的所述指标物质的存在量。而且，也可将使所述各指标物质特异地显色或发光的试剂等添加至培养上清液，基于所述显色或发光的强度来求出指标物质的存在量。

关于所述指标物质的存在量，可使用气相色谱分析法(GC)、液相色谱分析法(LC)、气相色谱质谱分析法(GC-MS)或液相色谱质谱分析法(LC-MS)中的所述指标物质的波峰面积值(Area)，或者根据所述指标物质的波峰面积值(Area)而算出的、培养上清液中的所述指标物质的浓度(Concentration)。或者，也可使用经细胞的融汇度(细胞被覆率(Confluency))修正(标准化)的“Area/Confluency”、“Concentration/Confluency”或者经细胞数(细胞数量(Cell Number)或细胞计数(Cell Count))修正的“Area/Cell Number”、“Concentration/Cell Number”。通过使用经细胞的融汇度(Confluency)或细胞数(细胞数量(Cell Number)或细胞计数(Cell Count))修正(标准化)的值，从而在对照细胞与被检验细胞之间，即便在这些细胞的增殖率有差异的情况下，也能以细胞个数单位的指标物质的波峰面积值(Area/Confluency)或指标物质的浓度(Concentration/Confluency)彼此进行比较。因此，可进行进一步反映出对照细胞与被检验细胞各自的代谢的、精度高的比较，可更高精度地评价被检验细胞是否有基因组异常。

实施例

以下示出实施例，对本发明进行具体说明，但本发明不受实施例限制。

对利用本发明的方法进行的、细胞有无基因组异常的评价的一实施例进行说明。图1为用于对本发明的一实施例的细胞的基因组异常评价方法进行说明的示意图。

本实施例中，使用自同一人iPS细胞株分别培养的四个样本[具有正常染色体的人iPS细胞株样本(A、B、C)及18号染色体有异常的人iPS细胞株样本(D)]。即，本例中，使用来自具有正常染色体的iPS细胞株的对照细胞样本A、对照细胞样本B、对照细胞样本C及来自染色体有异常的iPS细胞株的被检验细胞样本D。以下，对本实施例的从细胞培养到培养上清液的分析为止的顺序进行说明。

[对照细胞的培养及培养上清液的回收]

在涂布有玻连蛋白-N(Vitronectin-N，生命科技(Life Technologies)公司)的6孔板(6well plate)(孔直径为35mm)的5孔中，将所述对照细胞传代并进行培养(图1中为了简化而仅示出1孔)。而且，作为对照样本(control sample)，制作不将细胞传代而仅添加了培养基的1孔。培养基使用必需-8(Essential-8)，每天更换培养基。必需-8(Essential-8)的结构成分示于表2。将进行细胞传代(继代)的当天设为第1天，持续培养至第4天。培养4天后将细胞传代至新的6孔板(孔直径为35mm)的5孔，同样地持续培养至第4天。继代实施合计3次，将每天更换培养基时从培养孔回收的培养上清液作为分析用的样本A。将所述对照细胞的传代起至3次继代培养完成为止设为1组，合计3组以相同条件实施培养，将每天更换培养基时从培养孔回收的培养上清液作为分析用的样本(将第2组回收的培养上清液样本作为分析用的样本B，将第3组回收的培养上清液样本作为分析用的样本C)。

[表2]

[被检验细胞的培养及培养上清液的回收]

在涂布有玻连蛋白-N(Vitronectin-N，生命科技(Life Technologies)公司)的6孔板(孔直径为35mm)的5孔中，将所述被检验细胞传代并进行培养(图1中为了简化而仅示出1孔)。而且，作为对照样本，制作不将细胞传代而仅添加了培养基的1孔。培养基使用必需-8(Essential-8)，每天更换培养基。将进行细胞传代(继代)的当天设为第1天，持续培养至第4天。培养4天后将细胞传代至新的6孔板(孔直径为35mm)的5孔，同样地持续培养至第4天。继代实施合计3次，将每天更换培养基时从培养孔回收的培养上清液作为质谱分析用的样本D。

[样本的前处理]

对所述各样本50μL分别添加作为内标物质的0.5mM异丙基苹果酸水溶液20μL，进而添加甲醇260μL，由此使样本中所含的蛋白质变性。利用过滤器进行除蛋白处理，回收滤液。

[利用GC-MS的分析]

将进行了所述前处理的各样本加以冷冻干燥后，在含有甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液中孵育(incubate)，然后进一步对各样本添加N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA)，由此将样本中的化合物三甲基硅烷化。接着，对实施了这些衍生处理的样本供于利用GC-MS进行的分析。关于分析结果的解析，使用岛津制作所制造的“智能代谢物数据库(Smart Metabolites Database)”。所述数据库是将利用GC-MS对实施了与所述相同的衍生处理的各种化合物标准品进行分析而得的数据集中而成。按下述指标来进行化合物的鉴定，即：所述数据库中设定的保持指标(使保持时间相对化的数值)与样本中的衍生化合物的保持指标之差是否为±5以内，以及针对样本中的衍生化合物是否检测到所述数据库中设定的定量离子及确认离子两者。另一方面，利用下述方法来实施化合物的定量：按照所述数据库中设定的条件，算出样本中的各衍生化合物中与特征性离子有关的质量色谱(mass chromatogram)的面积。

[利用LC-MS的分析]

对进行了上述前处理的各样本添加适当量的超纯水(Milli-Q(注册商标)水，默克(Merck)股份有限公司)进行稀释，供于利用LC-MS进行的分析。LC-MS分析中，通过使用逆相分离管柱的梯度洗脱将各样本中的化合物于时间上分离后，进行多反应监测(MultipleReaction Monitoring，MRM)模式的质谱分析。MRM模式下的分析条件的设定是使用化合物标准品来实施。以标准品的保持时间与样本中的化合物的保持时间之差是否为±0.1分钟以内为基准，来进行化合物的鉴定。而且，利用下述方法来实施化合物的定量：关于样本中的各化合物，对特征性离子算出质量色谱的面积。

液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的条件：

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)：

使用装置：超高效液相色谱奈克赛拉(Nexera)X2系列(岛津制作所)

管柱：发现(Discovery)HS F5-3*(2.1mm I.D.×150mmL，粒径：3μm，西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))

LC/MS：

使用装置：超高效三重四极型质谱分析仪LCMS-8060(岛津制作所)

除了利用GC-MS的分析、利用LC-MS的分析以外，也可利用LC进行分析，且可使用其结果按照与以下相同的顺序进行数据解析，对基因组异常进行评价。

[细胞被覆率的测定]

使用生物工作室(Biostudio)(尼康(Nikon)制造)在各培养日对孔进行摄像，算出细胞在孔中所占的面积比率作为细胞被覆率。

[数据解析1：指标物质的面积比]

针对在各培养日回收的培养上清液样本A、培养上清液样本B、培养上清液样本C、培养上清液样本D，通过进行所述LC-MS分析而求出各指标物质化合物(标志物)的定量值(面积值)，算出所述各指标物质化合物(标志物)的定量值(面积值)除以所述内标物质的定量值(面积值)所得的值(面积比)。接着，关于对照细胞与被检验细胞各自，计算利用LC-MS对从所述5孔回收的培养上清液分别进行分析结果所得的面积比减去对照样本的面积比所得的值，进而以细胞被覆率进行修正，将所得的修正值作为一个细胞在培养24小时的期间中产生或消耗的物质量的指标值进行比较。具体来说，将有关对照细胞所求出的面积比减去对照样本的面积比所得的值设为[a]，将有关被检验细胞所求出的面积比减去对照样本的面积比所得的值设为[b]，将每培养24小时的对象细胞的细胞被覆率的增加率设为[c]，将每培养24小时的被检验细胞的细胞被覆率的增加率设为[d]时，当[a]/[c]与[b]/[d]的可靠区间不重叠时，判定为在对照细胞的培养上清液与被检验细胞的培养上清液之间，一个细胞在培养24小时的期间中产生或消耗的物质量有显著差。

首先，将由面积比(Area ratio)所得的结果示于以下。

图2为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸(Threonic acid)的存在量的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为面积比。面积比＝指标物质的面积值/内标物质的面积值。图3～图8中，横轴及纵轴表示相同内容。

图3为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质胱硫醚(Cystathionine)的存在量的经时变化的图表。

图4为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸(Kynurenine)的存在量的经时变化的图表。

图5为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸(Cysteine)的存在量的经时变化的图表。

图6为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸(Alanine)的存在量的经时变化的图表。

图7为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺(Putrescine)的存在量的经时变化的图表。

图8为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷(Deoxycytidine)的存在量的经时变化的图表。

此处，对于对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)来说，由培养所得的细胞增殖率大致相同，即，随时间经过的细胞数大致相同。图15为表示有关对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过孔的摄像所求出的细胞被覆率的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为细胞被覆率(Confluency)。由图15可知，对于对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)来说，由培养所得的细胞增殖曲线大致一致。作为对照细胞的样本，优选细胞增殖曲线与被检验细胞的样本大致一致。若细胞增殖曲线大致一致，则细胞个数大致同等，因而能以细胞个数单位的指标物质的波峰面积值(Area)或指标物质的浓度(Concentration)彼此进行比较。因此，可进行进一步反映出对照细胞与被检验细胞各自的代谢的、精度高的比较，可更高精度地评价被检验细胞是否有基因组异常。

根据图2～图4及图7～图8，与具有正常型染色体的对照细胞(样本C)相比，18号染色体具有异常的被检验细胞(样本D)的情况下，作为指标物质的苏糖酸、胱硫醚、犬尿氨酸、腐胺及脱氧胞苷随时间经过而可见显著减少。

另一方面，根据图5～图6，与具有正常型染色体的对照细胞(样本C)相比，18号染色体具有异常的被检验细胞(样本D)的情况下，作为指标物质的半胱氨酸及丙氨酸随时间经过而可见显著增加。

图9～图14中，相对于所述图2及图4～图8，除了对照细胞(样本C)和被检验细胞(样本D)以外，还写入了有关对照细胞(样本A)及对照细胞(样本B)的结果。对照细胞(样本A)及对照细胞(样本B)与对照细胞(样本C)及被检验细胞(样本D)相比，由培养所得的细胞增殖率不同，即，随时间经过的细胞数不同，但对于对照细胞(样本A～C)与被检验细胞(样本D)来说，各指标物质的存在量可见显著差。因此，即便在由培养所得的细胞增殖率不同的情况下，也可通过比较对照细胞与被检验细胞的各指标物质的存在量，从而评价被检验细胞是否有基因组异常。

接下来，将由利用细胞被覆率(Confluency)将面积比(Area ratio)的值加以修正的修正值(Area ratio/Confluency)所得的结果示于以下。

图16为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸(Threonic acid)的存在量的经时变化的图表。横轴为培养天数，纵轴为面积比/细胞被覆率。面积比＝指标物质的面积值/内标物质的面积值。图17～图21中，横轴及纵轴表示相同内容。

图17为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸(Kynurenine)的存在量的经时变化的图表。

图18为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸(Cysteine)的存在量的经时变化的图表。

图19为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸(Alanine)的存在量的经时变化的图表。

图20为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺(Putrescine)的存在量的经时变化的图表。

图21为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷(Deoxycytidine)的存在量的经时变化的图表。

此处，如上文所述，根据图15，对照细胞(样本C)与被检验细胞(样本D)的由培养所得的细胞增殖率大致相同，即，随时间经过的细胞数大致相同。

根据图16、图17、图20及图21，与具有正常型染色体的对照细胞(样本C)相比，18号染色体具有异常的被检验细胞(样本D)的情况下，作为指标物质的苏糖酸、犬尿氨酸、腐胺及脱氧胞苷随时间经过而可见显著减少。

另一方面，根据图18及图19，与具有正常型染色体的对照细胞(样本C)相比，18号染色体具有异常的被检验细胞(样本D)的情况下，作为指标物质的半胱氨酸及丙氨酸随时间经过而可见显著增加。

ΔArea ratio/ΔConfluency的可靠区间的计算方法如下。

ΔArea ratio＝(针对第3天的对照细胞所求出的面积比)－(第3天的对照样本的面积比)

ΔConfluency＝(针对第3天的对照细胞所求出的细胞被覆率)－(针对第2天的对照细胞C所求出的细胞被覆率)

此处，关于正常系的对照细胞，使用对象细胞(样本A、样本B、样本C)的所有测定值来算出可靠区间。

表3中示出有关各指标物质的95％可靠区间，表4中示出有关各指标物质的90％可靠区间。

[表3]

95％可靠区间

[表4]

90％可靠区间

根据表3及表4，将有关对照细胞样本A、对照细胞样本B、对照细胞样本C所求出的面积比减去对照样本的面积比所得的值设为[a]，将有关被检验细胞所求出的面积比减去对照样本的面积比所得的值设为[b]，将每培养24小时的对象细胞的细胞被覆率的增加率设为[c]，将每培养24小时的被检验细胞的细胞被覆率的增加率设为[d]时，当[a]/[c]与[b]/[d]的可靠区间不重叠时，判定为在对照细胞的培养上清液与被检验细胞的培养上清液之间，一个细胞在培养24小时的期间中产生或消耗的物质量有显著差。通过这样判定，从而可进行更准确的判定。

[数据解析2：指标物质的浓度比]

关于在各培养日回收的培养上清液样本，针对通过进行所述LC-MS分析从而求出的各指标物质化合物(标志物)的面积值，根据浓度已知的各指标物质化合物的LC-MS分析结果，通过外标法来求出各指标物质化合物的浓度值。接着，关于对照细胞样本与被检验细胞样本各自，计算利用LC-MS对从所述5孔回收的培养上清液分别进行分析结果所得的浓度值减去对照样本的浓度值所得的值(ΔConc)，进而以细胞被覆率的变化量(ΔConfluency)进行修正，将所得的修正值(ΔConc/ΔConfluency)作为一个细胞在培养24小时的期间中产生或消耗的物质量的指标值进行比较。

ΔConc＝(针对第3天的培养上清液样本所求出的浓度值)－(第3天的对照样本的浓度值)

ΔConfluency＝(针对第3天的培养上清液样本所求出的细胞被覆率)－(针对第2天的培养上清液样本所求出的细胞被覆率)

此处，关于正常系的对照细胞样本，为对象细胞样本A、对象细胞样本B、对象细胞样本C的各ΔConc/ΔConfluency的平均值。

图22为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质苏糖酸(Threonic acid)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。纵轴为ΔConc/ΔConfluency。图23～图27中，纵轴表示相同内容。

图23为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质犬尿氨酸(Kynurenine)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图24为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质半胱氨酸(Cysteine)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图25为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质丙氨酸(Alanine)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图26为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质腐胺(Putrescine)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

图27为表示有关对照细胞(样本A、样本B、样本C)与被检验细胞(样本D)的、通过培养第3天的培养上清液的LC-MS分析所求出的指标物质脱氧胞苷(Deoxycytidine)的培养上清液中的ΔConc/ΔConfluency的图表。

这样，即便在以浓度比而非面积比进行比较的情况下，也同样地获得了正常系与异常系产生显著差的结果。

所述实施例中，表示了将细胞株A、细胞株B、细胞株C作为对照细胞且将细胞株D作为被检验细胞的示例。本发明也可适用于将其他细胞株作为对照细胞且将其他细胞株作为被检验细胞的情况。关于这一情况，本领域技术人员若参看所述实施例则可理解所述指标物质(即，标志物)可用于基因组异常的判定。而且，关于细胞的培养基，也不限于实施例所用的培养基，明显可使用各种培养基。

通过进行基于由本发明的方法所得的基因组异常评价结果来挑选所述被检验细胞的工序，从而可仅将正常细胞非侵袭性地继续培养。