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无血清培养基中的载体生产

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本公开的一方面在于一种在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约每40小时至约每56小时收获病毒滴度的方法，其中所述病毒滴度至少部分地在无血清培养基中收获。本公开的另一方面在于一种收获载体上清的方法，其包括：产生稳定的生产者细胞系细胞；从所产生的稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及在所述病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40至约56小时从经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞重复收获所述病毒载体。

著录项

公开/公告号CN112639109A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-04-09

原文格式PDF
申请/专利权人 CSL贝林基因治疗股份有限公司;
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申请/专利号CN201980055424.9
发明设计人 C-L·李;J·巴特利特;
展开▼

申请日2019-08-23
分类号C12N15/86(20060101);
代理机构11757 北京市奋迅律师事务所;
代理人李斌馨;李翼
地址美国加利福尼亚州
入库时间 2023-06-19 10:32:14

说明书

本申请要求于2018年8月24日提交的美国临时专利申请号62/722,784的申请日的权益，其公开内容在此整体援引加入本文。

技术领域

本公开总体涉及生物制造方法和收获病毒滴度的方法。

背景技术

在离体培养条件下生长的细胞系和原代细胞需要特殊的生长和维持培养基，其可以支持(i)对数期的细胞复制和(i)细胞一旦不再分裂后(即当细胞处于静止期)的细胞维持。常用的细胞培养基包括丰富的盐溶液，其含有维生素、氨基酸、必需微量元素和糖。支持细胞生长和维持所需的生长激素、酶和生物活性蛋白，通常以动物血液来源的血清产品的形式作为补充剂添加到培养基中。动物血液来源的血清产品的实例有胎牛血清、鸡血清、马血清和猪血清。这些血清衍生自分级血，血红细胞和白细胞已从中去除。

动物血清不仅包含细胞生长所需的因子，而且还包含使自然生长为贴壁细胞的细胞贴附到培养容器的细胞支持表面上的因子。因此，对于贴壁细胞至关重要的是，将足够的血清添加到培养基中以使其生长并形成单层。

不幸的是，牛/胎牛血清以及其他动物的血清可能含有外来的病原物质，例如病毒或朊病毒蛋白。有潜在的风险，这些病原物质可能会被传播到要用在细胞培养中产生的疫苗或其他药品进行治疗或接种的动物/人中。如果将细胞培养产品给药于免疫缺损的人，则这尤其重要。考虑到在细胞培养中使用动物血清可能带来的风险，很明显，未使用动物产品的生产工艺是高度期望的。

大规模地生产自失活载体(“SIN载体”)来支持临床试验是本领域内的重要挑战。虽然γ-逆转录病毒载体可以通过瞬时转染或产生稳定的生产者细胞系来生产，慢病毒需要表达多种细胞毒性的辅助基因，这使得生产者细胞的产生更加复杂(Greene et al.，Transduction of Human CD34+ Repopulating Cells with a Self-InactivatingLentiviral Vector for SCID-Xl Produced at Clinical Scale by a Stable CellLine，HGTM，23，297-308(October 2012)，其内容整体援引加入本文)。而瞬时转染是慢病毒试生产的当前技术，从安全性、成本和可重复性的角度来看，其对于非常大规模的应用是不切实际的。事实上，这种技术昂贵，难以标准化和扩大规模，并且受批次间差异和低逆转录酶保真度所累(Stornaiuolo et al.，RD2-MolPack-Chim3，a Packaging Cell Line forStable Production of Lentiviral Vectors for Anti-HIV Gene Therapy，HGTM，24：228-240(August 2013)，其内容整体援引加入本文)。

发明内容

虽然可以利用每日收获(例如每24小时收获)的生产方案来小规模生产各种测试载体，但每日收获和培养基更换通常是不经济的。作为每日收获的替代，申请人开发了”两天收获”的方案，其中，在病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40小时至约56小时重复收获病毒载体。申请人出乎意料地发现，这种使用无血清培养基的”两天收获”方案允许产生与较为传统的每日收获约相同数量的病毒载体，同时还提供需要较少培养基的优点。考虑到含血清培养基与无血清培养基相比较高的成本，据信使用无血清培养基和所公开的”两天收获”方案对于大规模生物制造尤为重要。此外，当使用无血清培养基时，使可能存在于含血清培养基中的病原物质传播到用收获的病毒载体治疗的受试者的风险最小化或消除。这些优点满足降低大规模生物制造成本和增强安全性的行业未满足的需求，同时提供了可回收大量病毒载体滴度的生物制造方案。

本公开的一方面在于一种收获载体上清的方法，其包括：产生稳定的生产者(producer)细胞系细胞；从所产生的稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及在所述病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40至约56小时从经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，所述重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜无血清培养基，而不引入另外的所产生的稳定的生产者细胞系细胞。

在一些实施方案中，在每次重复收获后替换用于收获的无血清培养基。在一些实施方案中，在每次单独收获期间，不向所产生的稳定的生产者细胞系细胞引入另外的无血清培养基。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含生长因子和脂质。在一些实施方案中，所述脂质包括胆固醇、磷脂和脂肪酸。

在一些实施方案中，在所述诱导后(即诱导病毒载体产生之后)约40小时至约56小时之间进行所述病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，在所述诱导后不到48小时进行所述病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，每约44至约52小时进行所述病毒载体的重复收获。在一些实施方案中，每约46至约50小时进行所述病毒载体的重复收获。在一些实施方案中，每约48小时进行所述病毒载体的重复收获。

在一些实施方案中，所述方法在重复收获的每次单独收获期间提供约0.5x10

在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系细胞衍生自包装细胞系细胞。在一些实施方案中，所述包装细胞系细胞衍生自选自以下的细胞：CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211 A细胞。在一些实施方案中，所述包装细胞系细胞选自GPR、GPRG、GPRT、GPRGT和GPRT-G细胞系细胞。

在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系细胞通过以下产生：(a)通过将一个或多个基因克隆入重组质粒来合成载体；(b)由(i)从所合成的载体切下的表达盒和(ii)从抗生素抗性盒质粒获得的表达盒形成多联阵列；(c)用所形成的多联阵列转染GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G包装细胞系细胞；以及(d)分离所述稳定的生产者细胞系细胞。在一些实施方案中，所述合成的载体是慢病毒载体，例如自失活慢病毒载体。在一些实施方案中，所述抗生素抗性盒质粒是博来霉素抗生素抗性盒。在一些实施方案中，从合成的载体切下的表达盒与从博来霉素抗生素抗性盒获得的表达盒的摩尔比为约50∶1至约1∶50。在一些实施方案中，所述摩尔比为约25∶1至约1∶25。在一些实施方案中，所述摩尔比为约15∶1至约1∶15。在一些实施方案中，所述摩尔比为约10∶1至约1∶10。

在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：1具有至少约90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：1具有至少约95％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：1具有至少约99％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：2具有至少约99％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含多克隆位点，其具有BstBI、MluI、NotI和/或ClaI限制性核酸内切酶位点。在一些实施方案中，编码所述多克隆位点的核苷酸序列与SEQ ID NO：7具有至少约90％的序列相同性。在一些实施方案中，编码所述多克隆位点的核苷酸序列与SEQ ID NO：7具有至少约95％的序列相同性。在一些实施方案中，所述重组质粒进一步包含编码包装信号的核苷酸序列；编码中央多嘌呤束(central polypurine tract)的核苷酸序列；编码Rev应答元件的核苷酸序列；以及编码自失活长末端重复的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体盒侧翼有至少两个另外的限制性核酸内切酶位点，所述至少两个另外的限制性核酸内切酶位点独立地选自sfiI和Bsu36I。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含编码治疗基因(包括本文列举的任何基因)的核酸序列。在一些实施方案中，所述治疗基因纠正镰刀细胞病或至少减轻镰刀细胞病的一种症状。在一些实施方案中，所述治疗基因是γ-珠蛋白基因。在一些实施方案中，所述治疗基因是Wiskott-Aldrich综合征蛋白。在一些实施方案中，所述治疗基因是C1酯酶抑制剂蛋白。在一些实施方案中，所述治疗基因是布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosinekinase)。在一些实施方案中，所述合成的载体包含用于敲低次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(“HPRT”)的核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含：(i)用于敲低HPRT的第一核酸序列，以及(ii)编码治疗基因(包括此处列举或上文所述的任何治疗基因)的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含(i)用于敲低HPRT的第一核酸序列，以及(ii)编码γ-珠蛋白基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含(i)用于敲低HPRT的第一核酸序列，以及(ii)编码Wiskott-Aldrich综合征蛋白的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含用于敲低CCR5的核酸序列。

在一些实施方案中，在含血清培养基中进行所述病毒载体生产的诱导。在一些实施方案中，所述方法包括在所述诱导后约18小时至约28小时之间用另外的含血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述方法包括在所述诱导后约24小时用另外的含血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述方法包括在所述诱导后约18小时至28小时用无血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述方法包括在所述诱导后约24小时用无血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述无血清培养基可以包含脂质和/或生长因子。

本公开的第二方面在于一种从稳定的生产者细胞系细胞生产病毒载体的方法，其包括：(a)通过将一个或多个核酸序列插入重组质粒来合成载体；(b)由从所合成的载体切下的表达盒和从抗生素抗性盒质粒获得的DNA片段形成多联阵列；(c)用所形成的多联阵列转染GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、GPRT-G包装细胞系或其衍生物来提供稳定的生产者细胞系细胞；(d)从所述稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及(e)在所述病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40小时至约56小时重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，在诱导后约40小时至约56小时之间进行所述首次收获。在一些实施方案中，每约44小时至约52小时重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，每约48小时重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含生长因子和脂质，例如，包含一种或多种生长因子和/或一种或多种脂质的混合物。在一些实施方案中，所述重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜无血清培养基，而不引入另外的所产生的稳定的生产者细胞系细胞。

在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系基于GPRG包装细胞系。在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系基于GPRT包装细胞系。在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系基于GPR包装细胞系。在一些实施方案中，所述来自合成的载体的DNA片段和所述来自抗生素抗性盒的DNA片段的比例为约25∶1至约1∶25。在一些实施方案中，所述抗生素抗性盒质粒是博来霉素抗生素抗性盒。

在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：1具有至少90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：1具有至少95％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：2具有至少90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重组质粒包含与SEQ ID NO：2具有至少95％相同性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，在含血清培养基中进行所述病毒载体生产的诱导。在一些实施方案中，所述方法进一步包含在所述诱导后约24小时用另外的含血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述方法进一步包含在所述诱导后约24小时用无血清培养基替换所述含血清培养基。在一些实施方案中，所述无血清培养基可以包含脂质和/或生长因子。在一些实施方案中，所述脂质包括胆固醇、磷脂和脂肪酸。

在一些实施方案中，插入重组质粒的一个或多个核酸序列是治疗基因。合适的治疗基因的实例在本文列举。在一些实施方案中，插入重组质粒的一个或多个核酸序列是γ-珠蛋白基因。在一些实施方案中，插入重组质粒的一个或多个核酸序列包含用于敲低HPRT的RNA干扰剂(“RNAi剂”)。在一些实施方案中，所述RNAi剂为shRNA、microRNA或其杂合体。在一些实施方案中，插入重组质粒的一个或多个核酸序列包含用于敲低CCR5的RNAi。

在一些实施方案中，所述方法在所述重复收获的每次单独收获期间提供约0.5x10

本公开的第三方面在于一种从稳定的生产者细胞系细胞收获载体上清的方法，其包括：从所述稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及在所述病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40至约56小时从经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞重复收获病毒载体。在一些实施方案中，所述重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜无血清培养基，而不引入另外的所产生的稳定的生产者细胞系细胞。在一些实施方案中，在所述诱导后约40小时首次收获所述病毒载体。在一些实施方案中，在所述病毒载体的首次收获后，每约48小时重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，所述方法在重复收获的每次单独收获期间提供约0.5x10

在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种添加剂。在一些实施方案中，所述添加剂包含一种或多种生长因子。在一些实施方案中，所述添加剂包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，所述脂质包括胆固醇、磷脂和脂肪酸。

在一些实施方案中，将所述稳定的生产者细胞系细胞在含血清培养基中传代；并且其中将所述细胞在无血清培养基中培养。在一些实施方案中，将所述稳定的生产者细胞系细胞在含血清培养基中传代；并且其中将所述细胞在含血清培养基中培养。

在一些实施方案中，所述病毒载体包含编码治疗基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述治疗基因纠正镰刀细胞病或至少减轻镰刀细胞病的一种症状。在一些实施方案中，所述病毒载体包含编码γ-珠蛋白基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒载体包含用于敲低HPRT的核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒载体包含：(i)用于敲低HPRT的第一核酸序列，以及(ii)编码治疗基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒载体包含用于敲低CCR5的核酸序列。在一些实施方案中，所述病毒载体包含编码的CRISPR/Cas组件的核酸序列。

本公开的第四方面在于一种包含病毒载体的组合物，所述病毒载体包含编码用于敲低HPPRT的第一核酸序列，其中所述病毒载体通过以下产生：从产生的稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及在所述病毒载体的首次收获后，每约40至约56小时从经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞重复收获所述病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体的重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜培养基，而不引入另外的所产生的稳定的生产者细胞系细胞。在一些实施方案中，所述重复收获在无血清培养基中进行。

在一些实施方案中，所述病毒载体进一步包含第二核酸序列。在一些实施方案中，所述第二核酸序列编码治疗基因，包括本文列举的任何基因。在一些实施方案中，治疗基因是γ珠蛋白基因。在一些实施方案中，治疗基因是Wiskott-Aldrich综合征蛋白。在一些实施方案中，治疗基因是C1酯酶抑制剂蛋白。在一些实施方案中，治疗基因是布鲁顿酪氨酸激酶。在一些实施方案中，所述第二核酸编码核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶选自归巢核酸内切酶、转录激活因子样效应物核酸酶、锌指核酸酶、II型规律成簇的间隔短回文重复(Type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats)和megaTAL核酸酶。在一些实施方案中，所述第二核酸序列编码CRISPR/Cas组件。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas组件选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。

本公开的第五方面在于包含本公开的第四方面的病毒载体的组合物在转导宿主细胞中的用途。合适的宿主细胞包括但不限于：人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是造血细胞，例如造血祖/干细胞(例如CD34阳性的造血祖/干细胞(HPSC))、单核细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞在转导后基本上缺乏HPRT，例如HPRT表达降低至少50％。

本公开的第六方面在于一种重复收获病毒滴度的方法，其包括：(a)传代阶段，其中将稳定的生产者细胞系细胞在含血清培养基中传代，(b)培养阶段，其中将所述稳定的生产者细胞系细胞在第一无血清培养基中处理，以及(c)生产阶段，其中将所述稳定的生产者细胞系细胞在第二无血清培养基中处理。在一些实施方案中，从经诱导的稳定的生产者细胞系细胞中重复收获病毒载体，其中在无血清培养基中进行所述重复收获。在一些实施方案中，在所述病毒载体的首次收获后，每约40小时至约56小时进行所述重复收获。在一些实施方案中，所述重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜无血清培养基，而不引入另外的稳定的生产者细胞系细胞。

在一些实施方案中，所述第一无血清培养基包含一种或多种添加剂。在一些实施方案中，所述第二无血清培养基包含一种或多种添加剂。在一些实施方案中，所述第一无血清培养基和所述第二无血清培养基相同。在一些实施方案中，所述第一无血清培养基和所述第二无血清培养基不同，例如每个包含不同的添加剂组分。例如，所述第一无血清培养基可以包含一种类型的生长因子，而所述第二无血清培养基可以包含不同类型的生子因子。同样，所述第一无血清培养基可以包含一种或多种生长因子，而所述第二无血清培养基包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，在任何无血清培养基中添加剂的量为培养基体积的约0.05％至约10％。在一些实施方案中，所述方法在重复收获的每次单独收获期间提供约0.5x10

在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系细胞通过以下产生：(a)通过将一个或多个基因克隆入重组质粒来合成载体；(b)由(i)从所合成的载体切下的表达盒和(ii)从抗生素抗性盒质粒获得的表达盒形成多联阵列；(c)用所形成的多联阵列转染GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G包装细胞系中的一个；以及(d)分离所述稳定的生产者细胞系。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含编码治疗基因的核酸序列。合适的治疗基因的实例在本文列举。在一些实施方案中，所述治疗基因纠正镰刀细胞病或至少减轻镰刀细胞病的一种症状。在一些实施方案中，所述合成的载体包含编码γ-珠蛋白基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含用于敲低次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(“HPRT”)的核酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体包含：(i)用于敲低HPRT的第一核酸序列，以及(ii)编码治疗基因的第二核酸序列(例如γ-珠蛋白基因)。在一些实施方案中，所述合成的载体包含用于敲低CCR5的核酸序列。

本公开的第七方面在于一种收获载体上清的方法，其包括：产生稳定的生产者细胞系细胞，其中所述稳定的生产者细胞系细胞衍生自GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G包装细胞系或其衍生物中的一个；从所产生的稳定的生产者细胞系细胞诱导病毒载体产生；以及在所述病毒载体的首次收获后，在无血清培养基中，每约40至约56小时从经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞重复收获所述病毒载体，其中所述重复收获包括向经诱导的所产生的稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜无血清培养基，而不引入另外的所产生的稳定的生产者细胞系细胞。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含一种或多种脂质。在一些实施方案中，在诱导后约40小时至约56小时之间进行所述病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，在诱导后不到48小时进行所述病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，所述重复收获进行至少两次。在一些实施方案中，每约44至约52小时进行所述重复收获。在一些实施方案中，每约48小时进行所述重复收获。

在一些实施方案中，在每次重复收获后替换所述无血清培养基。在一些实施方案中，所述方法在重复收获的每次单独收获期间提供约0.5x10

附图说明

图1示出通过按照既定程序对HEK293T/17细胞瞬时转染或使用基于GPRG的稳定的生产者细胞系产生了相同的慢病毒载体。通过超速离心100x浓缩含有载体的培养基(VCM)并通过基因转导测定确定慢病毒(LV)滴度。

图2为流程图，示出产生稳定的生产者细胞系和用于收获从所产生的稳定的生产者细胞系生产的慢病毒载体的方法。

图3示出在连续传代3个月的时间段对两种不同细胞系MWCB的生产者细胞系的稳定性的评估。每隔一定间隔，通过移除四环素(TET)来诱导慢病毒载体，并通过基因转导测定评估VCM的慢病毒载体滴度。两种细胞系都是稳定的，并且能够在3个月的时间段(约90天)生产超过1x10

图4示出通过移除TET进行诱导后，生产慢病毒载体的动力学。通过基因转导测定在VCM中评估载体滴度。在所有情况下，基于GPRG的稳定的生产者细胞系能够在诱导后将慢病毒载体生产维持在约1x10

图5A和5B示出从稳定的细胞系生产慢病毒载体的动力学。(图5A)载体生产期间，每天(■)或每两天(□)用新鲜培养基替换培养基。(图5B)在293T细胞上滴定收获的培养基中的慢病毒载体总量。所示数据为平均值±SD(N＝2)。TUs，转导单位。

图6A示出在无强力霉素(Dox)培养基中诱导GPRG和293T细胞。用抗VSVG抗体染色经诱导的细胞来检测VSVG表达并通过流式细胞术测定。

图6B示出即使在长时间的培养后，GPRG包装细胞系生产慢病毒载体的能力。

图7A和B示出在不同培养条件下的慢病毒生产。(A)在含血清培养基中培养/生产。(B，左)在含血清培养基中培养/在无血清培养基中生产；(B，右)在无血清培养基培养/生产。D10：500mL DMEM/GlutaMAX

图8给出用新鲜培养基(无载体)或LVsh5/C46载体孵育的293T或TF-1a细胞的FACS分析。

图9示出在感染的细胞中慢病毒载体拷贝数的定量。在两个剂量(MOI＝1或0.3)的转导后，使用C46 qPCR确定每个宿主基因组的载体拷贝数。

图10示出用LVsh5/C46载体转导的ghost-CCR5细胞。通过FACS测定CCR5表达的降低水平。

图11给出pUC57-TL20的示意图。

图12示出根据本公开的一些实施方案的基于HIV-1的慢病毒转移载体。这种特定的转移载体编码与HIV-1融合抑制剂(C46)组合的短发卡RNA(shRNA)，所述短发卡RNA用于下调HIV-1共受体CCR5。

图13示出使用本文公开的方法在有血清和无血清的情况下的慢病毒诱导。在无血清培养基中培养的细胞生产的病毒几乎与在10％PBS中培养的细胞一样多。相信本文公开的方法可以适应于无血清培养环境。

图14为流程图，示出产生DNA片段的方法。

图15为流程图，示出合成多联阵列的方法。

图16为流程图，示出将多联阵列引入包装细胞系的方法。

图17为流程图，示出选择转染的克隆的方法。

图18为流程图，示出进行单克隆分离的方法。

图19为流程图，示出评估病毒生产的方法。

图20A、20B和20C，总体上描述用于合成TL20-Cal1-wpre和TL20-Unc-GFP载体的生产者细胞。图20A示出293T细胞的流式细胞术分析，所述293T细胞与新鲜培养基(左：无载体)或从最强的生产者克隆收获的TL20-Cal1-WPRE(右)孵育。图20B示出293T细胞的流式细胞术分析，所述293T细胞与新鲜培养基(深灰色柱：无载体)或从最强的生产者克隆收获的TL20-UbcGFP(浅灰色柱)。图20C示出测定的上清的载体滴度的分布，所述上清来自用于制备TL20-Cal1-WPRE(左)或TL20-Ubc GFP(右)载体的独立的生产者克隆。在293T细胞上滴定所述载体并用流式细胞术分析。用虚线指示出使用多克隆生产者细胞(单克隆选择之前)制备的载体达到的最高的滴度。图例：Ubc：泛素C启动子；GFP：增强型绿色荧光蛋白。

图21A和21B示出生产者细胞系可以在无血清培养基中产生病毒。图21A示出动力学研究中的GFP病毒的感染滴度(连续收获至诱导后第7天)。图21B示出LVsh5/C46载体(诱导后第3天收获)的转导效率。

如在37 C.F.R.1.822中定义的，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码示出本文提供的核酸和氨基酸序列。序列表以ASCII text文档提交，名为“2016-05-09_Cal-0013WO_ST25.txt”于2016年5月9日生成，5KB，其内容援引加入本文。

具体实施方式

如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。类似地，除非上下文另外明确指出，否则词语“或”意图包括“和”。

术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等互换使用并且具有相同含义。类似地，“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等互换使用并且具有相同含义。具体地，每个术语的定义均与美国专利法中常见的“包含”定义一致，因此应理解为一个开放术语，表示“至少以下内容”，并且还应解释为不排除其他特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的设备”表示所述设备包括组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法″表示所述方法至少包括步骤a、b和c”。此外，虽然本文以特定顺序概述步骤和过程，本领域技术人员会认识到，步骤和过程的排序可以变化。

如本文在说明书好和权利要求书中所用的，“或”应当理解为具有与以上定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或者“和/或”应理解为包含性的，即，包括多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，并且任选地包括其他未列出的项目。仅明确指出相反含义的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者，当在权利要求书中使用时，“由...组成”会指仅包括多个元素或元素列表中的一个。一般而言，本文所用的术语″或″仅应在排他性术语(例如“之一”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”)之后时，才会解释为表示排他性替代方案(即，“一个或另一个，但不同时包含两者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由...组成”应具有在专利法领域所使用的普通含义。

如本文在说明书好和权利要求书中所用的，关于一个或多个元素的列表，短语“至少一个”应理解为表示选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中明确列举的每一个元素中的至少一个并且不排除元素列表中元素的任何组合。这个定义也还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指代的元素列表中具体确定的元素之外的元素，无论与那些具体确定的元素相关还是无关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或，等同的“A或B中的至少一个”或，等同的“A和/或B中的至少一个”)可以指，在一实施方案中，至少一个，任选地包括多于一个，A，并且B不存在(并且任选地包括除B以外的元素)；在另一实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，B，并且A不存在(并且任选地包括除A以外的元素)；在又一实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，A，以及至少一个，任选地包括多于一个，B(并且任选地包括其他元素)等。

如本文所用，术语“克隆”指将核酸分子连接到质粒中并将它转移到合适的宿主细胞中以在宿主繁殖期间复制的过程。

如本文所用，术语“片段”指多肽，并且定义为给定多肽的任何离散部分，其对那个多肽是独特的或特征性的。如本文所用，该术语还指给定多肽的任何离散部分，其保留全长多肽的活性的至少一部分。

如本文所用，术语“基因”指任何核苷酸序列，DNA或RNA，其至少一些部分编码离散的终产物，通常，但不限于在细胞过程中的一些方面起作用的多肽。该术语不意图仅指编码多肽或其他离散终产物的编码序列，而是还可以涵盖调节基本表达水平的编码序列之前和之后的区域，以及各个编码区段(“外显子”)之间的中间序列(“内含子”)。在一些实施方案中，基因可以包括调节序列(例如，启动子、增强子、多聚腺苷酸化序列、终止序列、Kozak序列、TATA盒等)和/或修饰序列。在一些实施方案中，基因可以包括核酸参照(references tonucleic acids)，其不编码蛋白但编码功能性RNA分子(例如tRNA、RNAi诱导剂等)。

如本文所用，术语“HIV”不仅包括HIV-1，而且还包括HIV-1的各种毒株(例如BaL毒株或SF162毒株)和HIV-1的各种亚型(例如A、B、C、D、F、G、H、J和K亚型)。

如本文所用，术语“相同性”指聚合物分子之间，例如，核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。两个核酸序列的百分比相同性的计算，例如，可以通过比对两条序列以达到最佳比较目的来进行(例如，可以在第一和第二核酸序列中之一或两者都引入缺口以实现最佳比对，并且出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在那个位置相同。两个序列之间的百分比相同性是序列共享的相同位置数目的函数，考虑了缺口数和每个缺口的长度，需要引入其来实现两个序列的最佳比对。

如本文所用，术语“慢病毒”指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括1型HIV和2型HIV)，人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；维斯纳-梅迪(visna-maedi)，其在绵羊中引起脑炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊关节炎脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)；其在牛中引起淋巴结病、淋巴细胞增多以及可能的中枢神经系统感染；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其在亚人类灵长目动物中引起免疫缺陷和脑病。

如本文所用，术语“慢病毒载体”用于表示衍生自慢病毒的任何形式的核酸，并用于通过转导将遗产物质转移到细胞中。该术语涵盖慢病毒载体核酸，例如DNA和RNA，这些核酸的包封形式，以及其中已经包装有病毒载体核酸的病毒颗粒。

如本文所用，术语“多克隆位点”或“MCS”指包含限制性位点的核苷酸序列，所述限制性位点用于将核酸片段克隆至载体质粒。MCS也称为多接头(polylinker)或多克隆位点，其是克隆位点簇，使得许多限制性酶可以在该位点内运作。在一些实施方案中，克隆位点是已知序列，限制性酶在其上运作线性化或切割质粒。

如本文所用，术语“生产者细胞”指一种细胞，其中含有生产慢病毒载体颗粒所必需的所有元件。

如本文所用，术语“包装细胞”指一种细胞，其中含有用于生产感染性重组病毒的所必需的那些元件，所述元件在重组病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒转移载体质粒中缺失。通常，这类包装细胞含有一个或多个表达盒，其能够表达病毒结构蛋白(例如gag、pol和env)但它们不含有包装信号。包装细胞系细胞通常是哺乳动物细胞系，其含有生产病毒颗粒所必需的编码序列，其缺乏包装RNA和生产可复制的辅助病毒的能力。当在细胞系中提供包装功能时(例如，反式)，包装细胞系生产重组逆转录病毒(或慢病毒)，从而成为“生产者细胞系”。

如本文所用，术语“限制性核酸内切酶”或“限制性酶”指与核酸分子(例如DNA)的同源序列结合并在那个序列内的精确位置切割的一类催化分子中的一个或多个成员。

如本文所用，术语“逆转录病毒”指具有RNA基因组的病毒，所述RNA基因组被逆转录病毒逆转录酶逆转录成整合到宿主细胞基因组中的cDNA拷贝。逆转录病毒载体和制备逆转录病毒载体的方法是本领域已知的。简而言之，为构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣的基因的核酸代替某些病毒序列插入病毒基因组中，以产生复制缺陷型病毒。为生产病毒体，构建含有gag、pol和env基因而不含有LTR和包装组件的包装细胞系(Mann et al.，Cell，Vol.33：153-159，1983)。当含有cDNA的重组质粒，与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入这个细胞系时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物包装入病毒颗粒，然后将其分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩并用于基因转移。在一些实施方案中，术语“逆转录病毒”指任何已知逆转录病毒(例如，c型逆转录病毒，例如莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维(Harvey)鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))。本发明的“逆转录病毒”也包括人T细胞白血病病毒、HTLV-1和HTLV-2，以及逆转录病毒的慢病毒家族，例如人免疫缺陷病毒(HIV-1，HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)和其他类别的逆转录病毒。

如本文所用，“RNA干扰剂”或“RNAi剂”是抑制性或沉默性核酸。如本文所用，“沉默性核酸”指能够与特定序列相互作用以抑制基因表达的任何多核苷酸。沉默性核酸的实例包括RNA双链体(例如siRNA、shRNA)、锁核酸(“LNA”)、反义RNA、编码所述siRNA或shRNA的正义序列和/或反义序列的DNA多核苷酸、DNA酶或核酶。本领域技术人员会领会，基因表达的抑制不一定来自列举的特定序列的基因表达，并且，可以是，例如，来自那个特定序列控制的序列的基因表达。

如本文所用，术语“接种”指为生物反应器或其他容器提供细胞培养物以生产细胞或载体培养物的过程。

如本文所用，短语“无血清培养基(serum-free media)”或“无血清培养基(serum-free medium)”指不含血清的培养基，即，不含动物或人来源的血清的细胞培养基。在一些实施方案中，无血清培养基不含蛋白并且也不含水解物或未知组成的组分。合适的细胞培养基是本领域技术人员已知的。这些培养基可以任选地包含盐、维生素、缓冲液、能量来源、氨基酸和其他物质。适合无血清培养细胞的培养基的一个实例为培养基199(Morgan，Morton and Parker；Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1950，73，1；obtainable inter alia from10 Life Technologies)。

如本文所用，术语“shRNA”指RNA分子，所述RNA分子包含反义区、环部分和正义区，其中所述正义区具有与反义区配对的互补核苷酸以形成双链体茎。在转录后

如本文所用，术语“治疗基因”指出于治疗或预防疾病目的可以给药于受试者的基因。“生物学功能等同物”治疗基因涵盖在“治疗基因”定义之内。如本领域技术人员会理解的，术语“治疗基因”包括基因序列、cDNA序列和较小的工程化基因区段，其表达或可以适合于表达蛋白、多肽、结构域、融合蛋白和突变体，其维持治疗基因编码的全长多肽的一些或全部治疗功能。因此，只要多肽的生物学活性得以维持，这样具有约70％序列同源性至约99％序列同源性以及其中可衍生的任何范围或量(例如约70％至约80％，更优选约85％和约90％；或更优选地，在约95％至约99％之间)的同源性的序列；与治疗基因的氨基酸相同或功能上等同的氨基酸序列是生物学功能等同物序列。

如本文所用，术语“转导”或“转导”指通过感染而非转染的方式使用病毒或逆转录病毒载体递送基因。例如，逆转录病毒载体(修饰的逆转录病毒用作将核酸导入细胞的载体)携带的抗HPRT基因可以通过感染和前病毒整合转导入细胞中。因此，“转导的基因”是这样的基因，其已经通过慢病毒或载体感染和前病毒整合导入细胞。病毒载体(例如，“转导载体”)将基因转导入“靶细胞”或宿主细胞。

如本文所用，术语“载体”指一种核酸分子，其能够介导另一核酸分子进入细胞，例如，转移，转运等。转移的核酸通常连接至，例如，插入载体核酸分子。载体可以包括指导复制的序列或可以包括足以整合进宿主细胞DNA的序列。如对于本领域普通技术人员显而易见的，除介导转移的核酸的进入的核酸之外，病毒载体可以包含多种病毒成分。许多载体是本领域已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)等。

如本文所用，术语“载体拷贝数目”或“VCN”指细胞基因组中载体或其部分的拷贝数目。可以由细胞群或单个细胞克隆确定平均VCN。用于确定VCN的示例性方法包括聚合酶链式反应(PCR)和流式细胞术。

如本文所用，术语“病毒滴度”或“滴度”在本文中互换使用，指来自被感染个体的体液样品中(例如，血、血清、血浆、唾液、尿液)感染性病毒颗粒的数目。

慢病毒基因组通常组织为5′长末端重复(LTR)、gag基因、pol基因、env基因、辅助基因(nef、vif、vpr、vpu)和3′LTR。病毒LTR分为称作U3、R和U5的三个区。U3区含有增强子和启动子元件。U5区含有多腺苷酸化信号。R(重复)区分隔U3和U5区，并且R区转录的序列出现在病毒RNA的5′和3′端。参见，例如，“RNA Viruses：A Practical Approach”(Alan J.Cann，Ed.，Oxford University Press，(2000))；O Narayan and Clements(1989)J.Gen.Virology，Vol.70：1617-1639；Fields et al.(1990)Fundamental Virology RavenPress.；Miyoshi H，Blamer U，Takahashi M，Gage F H，Verma I M.(1998)J Virol.，Vol.72(10)：8150 7；以及美国专利号6,013,516。

慢病毒载体是本领域已知的，包括已经用于感染造血祖/干细胞(HPSC)的几种。这类载体可以在例如以下出版物中找到，其内容援引加入本文：Evans et al.，Hum GeneTher.，Vol.10：1479-1489，1999；Case et al.，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.96：2988-2993，1999；Uchida et al.，Proc Natl Acad Sci USA，Vol.95：11939-11944，1998；Miyoshi et al.，Science，Vol.283：682-686，1999；以及Sutton et al.，J.Viral.，Vol.72：5781-5788，1998。在一实施方案中，所述表达载体是修饰的慢病毒，因此能够感染分裂和非分裂细胞。进一步地，修饰的慢毒基因组优选地缺乏病毒复制所需的慢病毒蛋白的基因，从而防止不期望的复制，例如在靶细胞中的复制。优选在重组逆转录病毒(或特别是慢病毒)生产期间在包装细胞系中反式提供用于修饰的基因组复制所需的蛋白。在一实施方案中，包装细胞系是293T细胞系。慢病毒载体优选包含来自慢病毒5′和3′长末端重复(LTR)的序列。在一实施方案中，病毒构建体包含来自慢病毒的5′LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3′LTR。LTR序列可以是来自任何慢病毒(包括来自任何毒种或毒株)的LTR序列。例如，LTR可以是来自HIV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)或牛免疫缺陷病毒(BIV)的LTR序列。优选地，LTR序列是HIV LTR序列。

由于其稳定转导分裂和非分裂细胞的效率和能力，慢病毒载体(LV)是基因转移的重要工具。结果，研究者将它们用作多种临床应用中的基因递送媒介。然而，随着更多使用慢病毒载体的临床试验获得监管批准，使用现行良好生产规范(cGMP)方法的大规模的临床生产面临必须考虑的一系列挑战。在设计与cGMP兼容的工艺中，一个重要的考量是将监管方面的考量整合进制造工艺中的需求，其能够为多个cGMP制造生产一致的慢病毒。临床上使用的绝大多数慢病毒载体是由瞬时转染生产的。然而，基于瞬时转染的生产往往需要大量劳动力并且容易发生变化。由于这个原因，最近已经开发了几种稳定的包装细胞系系统。尽管将这些细胞系用于逆转录病毒和慢病毒载体的生物制造对于可扩展性和一致性特别有吸引力，但开发这类细胞系耗时并且使用这些细胞系的cGMP的监管路径尚未牢固确立。

鉴于前述，本公开阐述了用于逆转录病毒载体(包括自失活慢病毒载体(SIN-LV))的临床生产的方法。据信，通过一起使用包装细胞系(例如GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G或者由其衍生的衍生物或类似物包装细胞系)和新型慢病毒转移载体质粒，可以产生稳定的生产者细胞系细胞，从而能够生产逆转录病毒载体，包括自失活慢病毒载体(例如LVgGsh7；载体，其包含设计为敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)表达的组件；载体，其包含设计为敲低HPRT表达的第一组件并且还包含用于表达治疗基因(例如γ-珠蛋白基因)的第二组件)。虽然本文描述的某些实施方案和示例涉及LVsh5/C46的生产，其是一种自失活慢病毒载体，编码与HIV-1融合抑制剂(即C46)组合的短发卡RNA(shRNA)，所述短发卡RNA用于下调HIV-1共受体CCR5。本领域技术人员会认识到，本文描述的方法适用于产生能够生产任何SIN-LV(包括任何期望的或客户提供的基因或序列(例如SIN-LIV，其设计为表达编码γ-珠蛋白基因的核酸序列，例如美国专利申请号2017/0145077中公开的那些核酸序列，其公开内容在此整体援引加入本文；或者SIN-LIV，其设计为表达编码Wiskott-Aldrich综合征蛋白的核酸序列))的稳定的生产者细胞系细胞。

申请人已经证明，与通过瞬时转染生产的SIN-LV相比，本公开的方法(i)能够产生相似质量和数量的SIN-LV；(ii)产生可能具有更好效力的SIN-LV；并且(ii)使工艺在维持产量的同时，大大降低瞬时转染所见的制备间的差异。

pUC57-TL20c

在一些实施方案中，本公开提供基于1型人免疫缺陷(HIV-1)的三代、自失活(SIN)慢病毒转移载体质粒(以下简称“pUC57-TL20”)，其包含新颖、通用的多克隆位点(MCS)(参见图11)。

在一些实施方案中，所述慢病毒载体转移质粒包含载体骨架(“TL20c”)，所述载体骨架本身不包含内部启动子(因此，它是“无启动子的”)。在一些实施方案中，所述慢病毒载体转移质粒包含一个启动子，例如四环素阻遏型启动子，在载体骨架的上游(参见图12)。不希望受任何特定理论的束缚，据信载体骨架的无启动子设计允许产生慢病毒转移载体质粒，其能够由用户确定的启动子递送和随后表达感兴趣的基因。

图11给出基因图谱，阐明慢病毒载体转移质粒的组成元件。在一些实施方案中，所述慢病毒载体转移质粒包含约6500个核苷酸至约6750个核苷酸。在其他实施方案中，所述慢病毒载体转移质粒包含6600个核苷酸至约6700个核苷酸。在一些实施方案中，所述慢病毒转移载体质粒的载体骨架包含约3850个核苷酸至约3950个核苷酸。在一些实施方案中，所述慢病毒转移载体质粒的载体骨架包含约3901个核苷酸。

如图11所示，该质粒包含5′侧翼HIV LTR、包装信号或ψ+、中央多嘌呤束(cPPT)、Rev-应答元件(RRE)、多克隆位点(MCS)和3′侧翼HIV LTR。LTR区进一步包含U3和U5区以及R区。

根据本公开的某些实施方案，所述转移质粒包含自失活(SIN)LTR。如本领域已知的，在逆转录病毒生命周期中，在逆转录和病毒DNA合成过程中，3′LTR的U3区被复制以形成5′LTR的相应区域。通过失活3′LTR的U3区(优选地，通过删除其部分，例如移除TATA序列)来实现SIN LTR的创建。该改变在逆转录后转移至5′LTR，从而消除前病毒中LTR的转录单元，据信其阻止可复制型病毒的动员(mobilization)。通过用异源启动子代替5′LTR的U3区来提供额外的安全性增强，以在病毒颗粒生产期间驱动病毒基因组的转录。

在一些实施方案中，所述包装信号包含野生型HIV(例如HIV01 HXB2_LAI_IIIB)的Gag序列的约361个碱基对和Pol序列的约448个碱基对。在一些实施方案中，cPPT包含野生型HIV的Vif序列的约85个碱基对。在一些实施方案中，HIV多嘌呤束(pPu)包含野生型HIV的Nef序列的约106个碱基对。在一些实施方案中，RRE包含野生型HIV的Rev序列的约26个碱基对、tat序列的约25个碱基对，和Env序列的约769个碱基对。在一些实施方案中，转移质粒包含染色质绝缘子和/或β珠蛋白多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，编码包装信号的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的序列或与SEQID NO：3具有至少85％相同性的序列。在一些实施方案中，编码包装信号的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的序列或与SEQ ID NO：3具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码包装信号的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3的序列或与SEQ ID NO：3具有至少95％相同性的序列。

在一些实施方案中，编码中央多嘌呤束(cPPT)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：4具有至少85％相同性的序列。在一些实施方案中，编码中央多嘌呤束(cPPT)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：4具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码中央多嘌呤束(cPPT)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：4具有至少95％相同性的序列。

在一些实施方案中，编码Rev应答元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的序列或与SEQ ID NO：5具有至少85％相同性的序列。在一些实施方案中，编码Rev应答元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的序列或与SEQ ID NO：5具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码Rev应答元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5的序列或与SEQ ID NO：5具有至少95％相同性的序列。

在一些实施方案中，编码自失活长末端重复的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的序列或与SEQ ID NO：6具有至少85％相同性的序列。在一些实施方案中，编码自失活长末端重复的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的序列或与SEQ ID NO：6具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码自失活长末端重复的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6的序列或与SEQID NO：6具有至少95％相同性的序列。

在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：10具有至少85％相同性的强力霉素阻遏型启动子。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：10具有至少90％相同性的强力霉素阻遏型启动子。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：10具有至少95％相同性的强力霉素阻遏型启动子。

在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：11具有至少85％相同性的HIV LTR R5区。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQID NO：11具有至少90％相同性的HIV LTR R5区。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：11具有至少95％相同性的HIV LTR R5区。

在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：12具有至少85％相同性的HIV LTR U5区。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQID NO：12具有至少90％相同性的HIV LTR U5区。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：12具有至少95％相同性的HIV LTR U5区。

在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：13具有至少85％相同性的染色质绝缘子。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQID NO：13具有至少90％相同性的染色质绝缘子。在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：13具有至少95％相同性的染色质绝缘子。

在一些实施方案中，所述质粒包含核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：14具有至少85％相同性的β-珠蛋白多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码与SEQID NO：14具有至少90％相同性的β-珠蛋白多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：14具有至少95％相同性的β-珠蛋白多腺苷酸化信号。

在一些实施方案中，所述质粒包含与SEQ ID NO：15具有至少85％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包含与SEQ ID NO：15具有至少90％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包含与SEQ ID NO：15具有至少95％相同性的核苷酸序列。

本公开提供慢病毒转移载体质粒，其包含用于多种不同限制性酶的MCS。根据本公开的某些实施方案，所述MCS包含具有约20个至40个核苷酸的序列。在一些实施方案中，本公开的质粒的MCS包含至少两个限制性酶切割位点。在其他实施方案中，本公开的质粒的MCS包含至少三个限制性酶切割位点。在其他实施方案中，本公开的质粒的MCS包含至少四个限制性酶切割位点。在另外的其他实施方案中，本公开的质粒的MCS包含约2个至约10个限制性位点。在进一步的实施方案中，本公开的质粒的MCS包含约3个至约8个限制性位点。在一些实施方案中，所述MCS内的限制性位点选自BstBI、MluI、NotI、ClaI、ApaI、XhoI、XbaI、HpaI、NheI、PacI、NsiI、SphI、Sma/Xma、AccI、BamHI和SphI，或者其任何衍生物或类似物。

在一些实施方案中，慢病毒转移载体质粒的MCS区携带有四个独特的限制性酶切割位点，据信其有助于容易地亚克隆期望的转基因盒。在一些实施方案中，所述多克隆位点包含BstBI、MluI、NotI和ClaI限制性核酸内切酶位点。在一些实施方案中，编码所述多克隆位点的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7的序列或与SEQ ID NO：7具有90％相同性的序列。限制性位点可以以任何顺序排列。

在一些实施方案中，转移质粒包含在载体骨架两侧的一个或多个另外的限制性酶切割位点(参见图11)。在一些实施方案中，转移质粒包含在载体骨架两侧的两个另外的限制性酶切割位点。不希望受任何特定理论的束缚，据信所述另外的侧翼限制性酶切割位点允许生产定向的(“头到尾”)多联阵列。在一些实施方案中，所述限制性酶切割位点选自Sill和Bsu36I。在一些实施方案中，慢病毒载体包含衍生自所述质粒的一个或多个基因。

在一些实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列。在其他实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ IDNO：1的序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。在另外的其他实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少95％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少96％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少97％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQID NO：1的序列具有至少98％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：1的序列具有至少99％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含SEQ ID NO：1的序列。在一些实施方案中，慢病毒载体转移质粒的序列与SEQ ID NO：1所示序列相差不超过100个核苷酸。

在一些实施方案中，慢病毒转移载体质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少80％相同性的核苷酸序列。在其他实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少85％相同性的核苷酸序列。在另外的其他实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少95％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少96％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少97％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQID NO：2的序列具有至少98％相同性的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少99％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，慢病毒载体转移质粒包含SEQ ID NO：2的序列。在一些实施方案中，慢病毒载体转移质粒的序列与SEQ ID NO：2所示序列相差不超过100个核苷酸。

在一些实施方案中，根据本领域技术人员已知的方法合成慢病毒转移载体质粒。例如，可以使用本领域普通技术人员已知的传统限制性消化和连接技术合成。例如，可以将包含TL20c载体骨架的供体质粒亚克隆至pU57C受体质粒(例如，例如可从Genescript商购获得的那些)，使用本领域普通技术人员已知的标准消化和连接程序(参见，例如，Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor，N.Y.，其公开内容在此整体援引加入本文)。

本公开还包括生产逆转录病毒载体的方法，所述逆转录病毒载体包括慢病毒载体，例如LVgGsh7，其是包含设计为敲低HPRT的组件的慢病毒载体，或包含第一组件和第二组件的慢病毒载体，所述第一组件设计为敲低HPRT，并且所述第二组件编码治疗基因，例如γ珠蛋白基因(参见，例如，WO/2019/018383中公开的载体和核酸序列，其公开内容在此整体援引加入本文)。在一些实施方案中，所述方法包括合成基因(包括本文公开的任何基因)的cDNA，并将合成的cDNA克隆入重组质粒(例如pUC57-TL20c)的限制性位点。可以使用本领域技术人员已知的技术将任何治疗基因插入合适的克隆位点。在一些实施方案中，可以通过聚合酶链式反应(“PCR”)扩增基因，然后克隆到包含期望的启动子或基因表达控制元件的重组质粒中(合适的启动子的实例在WO/2019/018383中公开，其公开内容在此整体援引加入本文)。

在一些实施方案中，并且仅作为示例，所述方法包括合成基因的cDNA，所述基因表达能够阻止HIV融合到细胞或者阻止HIV复制的蛋白；然后将合成的cDNA克隆到如本文所述的质粒的限制性位点中。

本公开的一些实施方案是形成稳定的生产者细胞系细胞，并收获由产生的稳定的生产者细胞系细胞生产的逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)的方法。在一些实施方案中，重复收获由产生的生产者细胞系细胞生产的慢病毒载体，例如每约40至约56小时重复收获。参考图2，在产生稳定的生产者细胞系中的第一步骤包括从第一质粒和第二质粒产生DNA片段(10)，其中所述质粒之一是抗生素抗性盒质粒。例如，可以从慢病毒载体转移质粒和抗生素抗性盒质粒产生DNA片段。在产生DNA片段后(10)，使用所述DNA形成多联阵列(20)。

随后，将多联阵列导入包装细胞系(30)(例如GPR、GPRG、GPRT、GPRG、GPRT-G或其衍生物包装细胞系)，例如通过转染导入。在导入阵列(30)和随后的转染之后，选择(40)并分离(50)克隆以产生稳定的生产者细胞系(60)。然后可以收获包含慢病毒载体的载体上清，例如每约40至约56小时在无血清培养基中重复收获。

多联阵列的形成和纯化

“多联体(concatemer)”或“多联阵列(concatemeric array)”在本文中互换使用，指长的连续的DNA分子，其含有直接或间接连接的相同DNA序列的多个拷贝。在一些实施方案中，产生多联阵列并用于包装细胞系细胞的转染。在一些实施方案中，多联阵列是连接的载体基因组表达盒的大阵列，其中穿插着抗生素抗性盒。

参考图14，产生来自慢病毒转移载体质粒的DNA片段(步骤100)和来自抗生素抗性盒质粒的DNA片段(步骤110)以形成多联阵列。在一些实施方案中，可以根据本领域普通技术人员已知的程序通过消化各个质粒来制备DNA片段然后连接消化的片段。在一些实施方案中，使用电泳和琼脂糖凝胶获得期望的DNA片段(步骤120)。在一些实施方案中，可以使用NanoDrop分光光度计确定DNA片段的浓度(步骤130)。连接DNA片段的策略多种多样，其选择取决于DNA片段末端的性质，并且本领域技术人员可以轻易地进行选择。

在一些实施方案中，慢病毒转移载体质粒基于pUC57-TL20c。在一些实施方案中，抗生素抗性盒质粒由PGK启动子驱动。在一些实施方案中，抗生素抗性盒质粒包含侧翼位点，其用于与慢病毒转移载体质粒中的慢病毒盒多联。在一些实施方案中，抗生素抗性盒质粒是PGK-ble(博来霉素(bleomycin)抗性)。在一些实施方案中，PGK-ble质粒包含与SEQ IDNO：9的序列具有至少90％相同性的核苷酸序列。在其他实施方案中，PGK-ble质粒包含与SEQ ID NO：9的序列具有至少95％相同性的核苷酸序列。在其他实施方案中，PGK-ble质粒具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列。在一些实施方案中，通过体外连接衍生自慢病毒转移载体质粒和PGK-ble质粒的产生的DNA片段来形成多联阵列。

图15概述用于形成多联阵列的一般步骤。在步骤200，将产生的DNA片段混合并且使连接反应中的片段的体积最大化以维持期望的比例(步骤210)。在一些实施方案中，慢病毒转移载体质粒DNA的量与抗生素抗性盒质粒DNA的量的比例为约100∶1至约1∶100。在一些实施方案中，慢病毒转移载体质粒DNA的量与抗生素抗性盒质粒DNA的量的比例为约75∶1至约1∶75。在其他实施方案中，慢病毒转移载体质粒DNA的量与抗生素抗性盒质粒DNA的量的比例为约50∶1至约1∶50。在另外的其他实施方案中，慢病毒转移载体质粒DNA的量与抗生素抗性盒质粒DNA的量的比例为约25∶1至约1∶25。在进一步的实施方案中，慢病毒转移载体质粒DNA的量与抗生素抗性盒质粒DNA的量的比例为约10∶1至约1∶10。

在一些实施方案中，在室温下(例如，在约20℃至约25℃的温度下)孵育多联反应混合物过夜(步骤220)。随后，可以使用NanoDrop分光光度计(可从ThermoFisherScientific获得)测定每个样品的DNA片段的浓度(步骤230)。

在一些实施方案中，形成定向多联阵列并用于包装细胞系的转染。在一些实施方案中，通过利用慢病毒转移载体质粒内慢病毒载体骨架侧翼的一个或多个限制性酶位点实现定向阵列的形成。在一些实施方案中，限制性消化利用TL20c载体盒侧翼的限制性酶位点，并允许形成核苷酸非回文突出端，其仅可用于头至尾的连接。在一些实施方案中，根据本文描述的方法的定向连接允许产生主要包含头至尾DNA产物的多联阵列。

在一些实施方案中，根据本文实施例3所述的方法形成多联阵列。当然，本领域技术人员会认识到，实施例3提供的程序可以适应于形成具有不同比例的第一质粒与第二质粒的多联阵列以及除LVsh5/C46以外的转移质粒，例如设计为表达γ-珠蛋白基因或任何其他感兴趣的基因的转移质粒。

在一些实施方案中，在转染到包装细胞系中之前，通过苯酚提取和乙醇沉淀纯化多联阵列。虽然这种传统技术便宜且有效，但是该程序耗时并且可能无法产生可再现的产量。据信，使用这种特定的方法时，苯酚/氯仿可能残留到最终样品中。此外，据信该程序涉及其他危险化学品并可能产生有毒废物，必须小心并按照危险废物准则处置。

或者，在其他实施方案中，在连接后，使用基于二氧化硅的方法纯化新合成的多联阵列。据信，这种方法为分离高质量转染级多联阵列提供简单、可信、快速和方便的途径。在一些实施方案中，使用DNeasy迷你旋转柱(可从Qiagen获得)纯化多联阵列，例如使用实施例6中所述的方法。

转染/单克隆分离

在纯化多联阵列之后，将该阵列用于转染包装细胞系细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”意图指用于将外来核酸(例如，DNA或RNA)导入细胞的各种本领域公认的技术。如从本文提供的示例中显而易见的，当用产生的多联阵列感染容许生产慢病毒颗粒的宿主细胞时，该细胞成为生产者细胞，即生产感染性慢病毒颗粒的细胞。

通常，可以通过常规转染技术将形成的多联阵列或形成的定向多联阵列导入细胞。例如，并且参考图16，在一些实施方案中，在转染前约20至约24小时收获并接种细胞(步骤300)，然后用合成的多联阵列(步骤310)转染(步骤320)。本文实施例4提供了转染包装细胞系细胞的方法。

一种适合用形成的多联阵列或定向多联阵列转染的包装细胞系是GPR包装细胞系。GPR系是基因HIV-1的包装细胞系，衍生自293T/17细胞，具有必需的病毒成分，包括gagpol和rev(参见，Throm et al.，Efficient construction of producer cell linesfor a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric arraytransfection.Blood 113：5104-5110，其公开内容在此整体援引加入本文)。

另一种适合用形成的多联阵列或定向多联阵列转染的包装细胞系是GPRG包装细胞系。在一些实施方案中，GPRG包装细胞系包含gagpol、rev和VSV-G。

另一种适合用形成的多联阵列或定向多联阵列转染的包装细胞系是GPRT包装细胞系(gagpol、rev和tat)。GPRG和GPRT包装细胞系以及形成其的方法也在Throm et.al中有公开，其公开内容再次在此整体援引加入本文。Wielgosz et al.″Generation of alentiviral vector producer cell clone for human Wiskott-Aldrich syndrome genetherapy，″Molecular Therapy-Methods&Clinical Development 2，Article number：14063(2015)描述了其他合适的包装细胞系(例如GPRT-G)，其公开内容在此整体援引加入本文。

本领域技术人员会领会，还可以利用适合与本公开的方法一起使用的其他包装细胞系。在一些实施方案中，其他包装细胞系可以衍生自GPR、GPRG、GPRT或GPRT-G包装细胞系中的任何一种。不希望受任何特定理论的束缚，据信，GPRT-G细胞系在CD34+细胞中具有更高的转导效率(参见Wielgosz)。如本文所用，术语“衍生自”指克隆自单个细胞并具有某些选择性质的细胞群，例如以给定的滴度生产活性蛋白的能力，或增殖到特定密度的能力。

在一些实施方案中，包装细胞系细胞是293T细胞。293T细胞(或HEK 293T)是人细胞系细胞，衍生自HEK 293细胞系，其表达SV40大T抗原的突变形式。其他合适的包装细胞系细胞描述于美国专利公开号2009/0187997，PCT公开号WO/2012/170431以及美国专利号8,034,620，其公开内容整体援引加入本文。PCT公开号WO/2012/170431描述包装细胞，其可以从CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY i、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211 A细胞制备。

图17示出选择转染的细胞的一般步骤。在一些实施方案中，在转染后约72小时后，用选择性培养基(zeocin和强力霉素)培养GPRG细胞(步骤400)。然后每约3至约4天向细胞供给选择性培养基(zeocin和强力霉素)，直至鉴定出细胞灶为止(步骤410)。随后，扩增和评估细胞系(步骤420)。

在一些实施方案中，在转染后，利用单个灶(foci)选择/筛选方法来鉴定具有良好制造潜力的单细胞克隆。根据这种方法，在一些实施方案中，将选择的细胞稀疏地接种在150×25mm皿中，并使其扩增并形成可辨别的克隆约2至约3周。然后可以将各个克隆转移到另一个较小的培养容器中进行单克隆扩增。据信，这种方法是经济有效且经常采用的技术；但是，由于单个灶选择技术的自然局限性，实现好的生产细胞系的高概率单克隆性可能具有挑战性。

图18示出单克隆分离。在步骤500，利用流式细胞术进行单细胞分选。然后将细胞铺在(步骤510)条件培养基中并扩增(步骤520)。

在其他实施方案中，为了产生高滴度的慢病毒载体稳定的生产者细胞系，使用荧光激活细胞分析仪(FACS)分离单克隆(参见，例如图8)。还可以在分选过程中添加条件培养基(例如Zeocin(50μg/mL)和强力霉素(1ng/mL))以增加细胞附着力和活力，并促进克隆形成。据信，使用条件生长培养基和FACS系统的高通量能力能够筛选大量克隆，因此据信使发现高滴度的慢病毒载体生产者克隆的可能性增加。

在一些实施方案中，测试具有良好生长率和病毒生产能力的克隆约20次以上传代的稳定性。

在选择和扩增选择的克隆之后，诱导选择的克隆来生产病毒载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体。在一些实施方案中，可以根据本领域普通技术人员已知的方法进行诱导。

图19阐明诱导和评估的过程。在步骤600，诱导病毒载体，然后进行细胞(例如293T细胞)的离心接种(spinoculation)以确定转导效率(步骤610)。在一些实施方案中，筛选(步骤620)并扩增(步骤630)排名前三的克隆。在一些实施方案中，然后将克隆存储(例如在液氮下)(步骤640)。在一些实施方案中，然后可将储存的细胞库用于如本文所述的病毒上清的重复收获。

虽然可以利用每日收获的生产方案(例如每约24小时收获)来小规模生产各种测试载体，但是当大规模进行生物制造时，每日收获和培养基更换是不经济的。当使用比无血清培养基更贵的含血清培养基时，这种成本被放大。作为每日收获的替代方案，涉及了如本文所述的“两天收获”方案。申请人出乎意料地发现，“两天收获”允许产生于更传统的每日收获约相同数量的病毒载体，同时还提供需要较少培养基的益处。每日收获和根据“两天收获”方案的载体滴度产量的比较示于图5A和5B。在一些实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约30％的培养基。在其他实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约35％的培养基。在其他实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约40％的培养基。在其他实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约45％的培养基。在另外的其他实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约50％的培养基。在另外的其他实施方案中，与传统的每日收获方法相比，“两天收获”方法使用至少少约55％的培养基。

申请人进一步证明，与使用含血清培养基相比，虽然当在无血清培养基中重复收获时(在培养阶段和/或生产阶段或这两个阶段都)，病毒载体滴度可能降低，但是认为病毒载体滴度的降低是不显著的(参见图21A和21B)，尤其是当考虑到使用无血清培养基减轻或防止了可能存在于含血清培养基中的病原物质污染的风险时。另外，申请人已证明，当进行从含血清培养基向无血清培养基的切换时，“两天收获”方案减轻病毒滴度的降低。实际上，申请人发现与无血清培养基中的每日收获相比，细胞对于在无血清培养基中的“两天收获”更加耐受。最后，与使用无血清培养基进行生物制造操作的相关成本比使用含血清培养基进行生物制造操作时的成本低得多，因此，考虑到公认的成本节省(比较文本的表A和B)，切换到无血清培养基时，病毒载体滴度的任何损失都是可接受的。

如上所述，本公开的方法利用“两天收获”方案，其中在病毒载体的首次收获后，每约两天重复收获病毒载体。在一些实施方案中，在诱导后(即，诱导病毒载体生产后)约24小时至约56小时之间进行病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，在诱导后(即，诱导病毒载体生产后)约30小时至约56小时之间进行病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，在诱导后(即，诱导病毒载体生产后)约40小时至约56小时之间进行病毒载体的首次收获。在其他实施方案中，在诱导后约42小时至约54小时之间进行病毒载体的首次收获。在另外的其他实施方案中，在诱导后约44小时至约52小时之间进行病毒载体的首次收获。在进一步的实施方案中，在诱导后约46小时至约50小时之间进行病毒载体的首次收获。在进一步的实施方案中，在诱导后约47小时至约49小时之间进行病毒载体的首次收获。在进一步的实施方案中，在诱导后约48小时进行病毒载体的首次收获。在一些实施方案中，在诱导后至少30小时进行首次收获。在一些实施方案中，在诱导后至少35小时进行首次收获。在一些实施方案中，在诱导后至少40小时进行首次收获。在一些实施方案中，在诱导后至少45小时进行首次收获。

在一些实施方案中，根据本公开的“两天收获”方案的重复收获包括在病毒载体的首次收获后，每约40小时至约56小时重复收获病毒载体。在其他实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后每约42至约55小时重复收获。在另外的其他实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后每约44至约52小时重复收获。在进一步的实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后每约46至约50小时重复收获。在更进一步的实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后每约48小时重复收获。申请人发现可以在诱导后约48小时收获病毒载体，并且在诱导后约72小时时可以产生最大量的病毒滴度。申请人还发现，重复的病毒收获方案可以也可以增加病毒载体的终产量。

在一些实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后至少每约40小时重复收获。在一些实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约40至约56小时之间进行首次收获，然后此后至少每约42小时重复收获。在一些实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约44至约56小时之间进行首次收获，然后此后至少每约40小时重复收获。在一些实施方案中，在诱导稳定的生产者细胞系细胞之后约46至约56小时之间进行首次收获，然后此后至少每约40小时重复收获。

在一些实施方案中，每次重复收获后，替换用于收获的无血清培养基。在一些实施方案中，在每次单独收获期间，不向所产生的稳定的生产者细胞系细胞引入另外的无血清培养基。在一些实施方案中，重复收获包括向稳定的生产者细胞系细胞添加新鲜培养基，而不引入另外的稳定的生产者细胞系细胞。

在一些实施方案中，根据本公开的方法(在无血清培养基中的“两天收获”)允许在重复收获的每次单独收获期间收获约0.5x10

在一些实施方案中，根据本公开的方法(在无血清培养基中的“两天收获”)允许在重复收获的每次单独收获期间收获至少约0.5x10

在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约90天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约80天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约70天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约60天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约50天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约40天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约30天。在一些实施方案中，生产阶段持续约5天至约20天。在一些实施方案中，生产阶段持续约10天至约90天。在一些实施方案中，生产阶段持续约10天至约60天。在一些实施方案中，生产阶段持续约10天至约45天。在一些实施方案中，所述生产阶段持续至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85或至少约90天。在一些实施方案中，所述生产阶段持续约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90天。

在一些实施方案中，收获进行至少两次。在其他实施方案中，收获进行至少3次。在其他实施方案中，收获进行至少4次。在其他实施方案中，重复收获进行至少5次。在其他实施方案中，收获进行至少6次。在其他实施方案中，收获进行至少7次。在其他实施方案中，收获进行至少8次。在其他实施方案中，收获进行至少9次。在其他实施方案中，收获进行至少10次。在一些实施方案中，收获进行至少11次。在其他实施方案中，收获进行至少12次。在其他实施方案中，收获进行至少13次。在其他实施方案中，收获进行至少14次。在其他实施方案中，收获进行至少15次。在其他实施方案中，收获进行至少16次。在其他实施方案中，收获进行至少17次。在其他实施方案中，收获进行至少18次。在其他实施方案中，收获进行至少19次。在其他实施方案中，收获进行至少20次。在其他实施方案中，收获进行至少25次。

申请人发现，与使用同样的收获方案但在含血清培养基中回收的病毒载体滴度数量相比，每约2天在无血清培养基中重复收获病毒载体允许收获基本上相同数量的病毒载体滴度(参见，例如，表A和B；还参见图21A和21B)。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(遵循“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(遵循“两天收获”方案)的至少约65％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约70％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约75％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约80％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约85％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约90％之内。在一些实施方案中，在无血清培养基中生产的感染性颗粒的数量(使用“两天收获”方案)是在含血清培养基中生产的感染性颗粒的总数量(使用“两天收获”方案)的至少约95％之内。

在一些实施方案中，在每个重复收获步骤结束后，可以通过过滤纯化收获的病毒载体。在一些实施方案中，通过确定病毒滴度、每细胞基因组的病毒拷贝和/或p24浓度中的一个或多个来表征收获的载体。

在第一示例性方法中，在每个步骤中都使用含血清培养基，即在培养阶段、在生产阶段以及在细胞传代期间。在一些实施方案中，所述含血清培养基是D10含血清培养基。在一些实施方案中，所述D10含血清培养基包含Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)和热灭活的(10％)胎牛血清(即，使用前已经热灭活的胎牛血清)。

在一个实施方案中是使用根据本公开的两天收获产生病毒载体的第一方法，所述第一方法包括以下步骤：

(1)尽可能完全去除生产者系培养皿的旧培养基，并用1×PBS洗涤细胞。

(2)向培养皿添加TrypLE

(3)在约37℃的培养箱中放置约2分钟。

(4)通过添加D10培养基(不含任何药物)洗出细胞，并通过上下吹打将细胞簇解离成单个细胞(D10培养基：具有高葡萄糖、GlutaMAX

(5)在约4℃以约1200rpm(或125×g)离心细胞约5分钟。

(6)吸出培养基并将形成的细胞团(pellet)轻轻悬浮在新鲜D10培养基(无药物)中。

(7)以培养皿中约95％的汇合度接种细胞(通过铺大约4×10

(8)然后可以在约24小时后(诱导后第1天)向接种的细胞补充新鲜、预热的D10培养基。

(9)在第一次培养基更换后约48小时(诱导后第3天)，第一次收获病毒载体。

(10)向培养皿添加新鲜、预热的培养基。

(11)在第二次培养基更换后约48小时(诱导后第5天)，进行第二次病毒载体收获。

(12)向培养皿添加新鲜、预热的培养基。

(13)在第三次培养基更换后约48小时(诱导后第7天)，进行第三次病毒载体收获。

在第二示例性方法中，在每个步骤中都使用含血清培养基，即在细胞传代期间、在培养阶段以及在生产阶段。在一些实施方案中，所述含血清培养基是D10。

(1)尽可能完全去除生产者系培养皿的培养基，并用1×PBS洗涤细胞。

(2)对于100mm培养皿，将3mL1×TrypLE Express轻轻移液到经洗涤的细胞单层上。

(3)旋转瓶使得单层被TrypLE Express覆盖。

(4)将瓶送回培养箱并放置约2分钟。

(5)轻轻敲击瓶的侧面来释放任何剩余的附着细胞。

(6)将细胞重悬于约2mL的新鲜D10培养基(无抗生素)中并转移至15mL锥形离心管中。

(7)在约1200rpm(或125×g)离心细胞约5分钟。

(8)吸出培养基并将细胞团轻轻悬浮于约5mL新鲜D10培养基中(无抗生素)。

(9)用TC10

(10)以培养皿中大于约95％汇合度接种细胞(通过在60-mm培养皿中铺约4×10

(11)每天向接种的细胞补充用新鲜、预热的D10培养基(每约24小时)。

申请人发现诱导后约48小时可从细胞中收获病毒载体，并且在诱导后72小时可产生最高的病毒滴度。申请人再次出乎意料地发现可以在诱导后约2至4天收获病毒载体。

在一些实施方案中，通过过滤纯化收获的载体。在一些实施方案中，通过确定病毒滴度、每细胞基因组的病毒拷贝以及p24浓度来表征收获的载体。

本公开还提供使用无血清培养基进行两天收获的方法。如在下面描述的第三和第四实施方案中详述的，可以在培养阶段或生产阶段中的至少一个用无血清培养基。

申请人发现通过将“两天收获”方法与无血清培养基的使用组合，以最小的滴度降低来重复收获病毒载体的经济有效的方法。据信，将无血清培养基和“两天收获”方案一起使用对于其中含血清培养基成本可能相当高的大规模生物制造至关重要。因此，在一些实施方案中，收获至少部分在无血清培养基中进行。例如，培养阶段或生产阶段中的至少一个使用无血清培养基。作为另一示例，培养阶段和生产阶段都使用无血清培养基。

在第三示例性方法中，在某些步骤中使用无血清培养基(例如在培养阶段和生产阶段都使用)，而在其他步骤中使用含血清培养基(例如在细胞传代期间)。在一些实施方案中，所述含血清培养基是D10含血清培养基；并且所述无血清培养基是UltraCULTURE

相应地，本公开提供使用两天收获产生病毒载体的第三方法，所述第三方法包括以下步骤：

(1)将细胞解冻(例如从冰冻中复苏)后传代至少4次，然后将它们用于病毒载体生产中。

(2)培养细胞至期望的数量(每隔一天将细胞传代)。

(3)尽可能去除生产者系培养皿的培养基，并用1×PBS洗涤细胞。

(4)将1×TrypLE Express轻轻移液到经洗涤的细胞单层上。

(5)旋转瓶使得单层被TrypLE Express覆盖。

(6)将瓶送回培养箱并放置约2分钟。

(7)轻轻敲击瓶的侧面来释放任何剩余的附着细胞。

(8)将细胞重悬于新鲜D10培养基(无抗生素)并转移至锥形离心管中。

(9)在约1200rpm离心细胞约5分钟。

(10)吸出培养基并将细胞团轻轻悬浮于新鲜D10培养基(无抗生素)中。

(11)用TC10

(12)将细胞以培养皿中＞95％的汇合度直接接种到UltraCULTURE

(13)在诱导后约24小时，用新鲜、预热的UltraCULTURE

(14)在诱导后约72小时，从经诱导的细胞收获病毒载体。

在第四示例性方法中，在生产阶段使用无血清培养基，而在培养阶段和细胞传代期间使用含血清培养基。在一些实施方案中，所述含有血清的培养基是D10含血清培养基；并且所述无血清培养基是UltraCULTURE

在另一实施方案中是使用根据本公开的两天收获产生病毒载体的第四方法，所述第四方法包括以下步骤：

(1)将细胞解冻后传代至少4次，然后将它们用于病毒载体的生产中。

(2)在载体诱导前至少2天将细胞每天传代(以维持对数期生长)。

(3)尽可能去除生产者系培养皿的培养基，并用1×PBS洗涤细胞。

(4)将1×TrypLE Express轻轻移液到经洗涤的细胞单层上。

(5)旋转瓶使得单层被TrypLE Express覆盖。

(6)将瓶送回培养箱并放置约2分钟。

(7)轻轻敲击瓶的侧面来释放任何剩余的附着细胞。

(8)将细胞重悬于新鲜D10培养基(无抗生素)并转移至锥形离心管中。

(9)在约1200rpm(或125×g)离心细胞约5分钟。

(10)吸出培养基并将细胞团轻轻悬浮于新鲜D10培养基(无抗生素)中。

(11)用TC10

(12)将细胞以培养皿中＞95％的汇合度接种到新鲜D10培养基(无抗生素)中。

(13)在诱导后约24小时，用新鲜、预热的UltraCULTURE

(14)在诱导后约72、约120和约168小时从经诱导的细胞收获病毒载体。

实施例1-通过瞬时转染生产的自失活慢病毒载体与通过所公开的稳定的细胞系方法生产的载体的详细比较

使用本文所描述的方法产生稳定的细胞系用于LVsh5/C46的生产，其是一种自失活慢病毒载体(SIN-LV)，编码与HIV-1融合抑制剂C46组合的短发卡RNA(shRNA)，所述shRNA用于下调HIV-1共受体CCR5。目前正在临床实验中在感染有HIV的个体中评估通过瞬时转染生产的这种慢病毒载体。在此，对通过瞬时转染生产的LVsh5/C46和使用本文所述的方法生产的LVsh5/C46进行了比较分析，以支持这个系统用于LVsh5/C46和其他SIN-LV的临床制造的应用。

本领域技术人员会领会，可以将本文所述的方法拓展到其他自失活慢病毒载体的生产。例如，SIN-LV可以包含：(i)第一核酸序列，其编码RNAi、反义寡核苷酸或靶向HPRT基因的外显子跳跃剂(exon skipping agent)；以及(ii)编码治疗基因的第二核酸序列。在一些实施方案中，编码治疗基因的第二核酸是这样的核酸，其可以从基因上纠正镰刀细胞病或β-地中海贫血；或减轻其症状(包括严重镰刀细胞病的症状)。在其他实施方案中，所述编码治疗基因的核酸是这样的核酸，其可以从基因上纠正免疫缺陷、遗传性疾病、血液病(例如血友病、血红蛋白病症)、神经系统疾病和/或溶酶体贮积病；或减轻其症状。在一些实施方案中，所述治疗基因是γ珠蛋白基因。在一些实施方案中，编码γ珠蛋白基因的第二核酸序列是杂合γ珠蛋白基因，其包含位点突变，所述位点突变赋予α-珠蛋白链竞争优势，扭曲四聚的HbF与HbS的形成。

通过使用4质粒系统(一个转移载体、两个包装载体和一个包膜载体)磷酸钙转染293T细胞生产慢病毒载体(LV)。转染后48小时收获含病毒培养基(VCM)并用超速离心通过20％蔗糖垫浓缩。

为生产细胞系，在没有强力霉素(Dox)的培养基中诱导生产者细胞系细胞，并且在约72小时收获VCM并通过超速离心类似地浓缩。参考表1和图8和9，比较通过每种方法生产的慢病毒载体的颗粒滴度，并使用三种独立的测定法在293T和TF-1a T细胞系上对基因转导效力进行比较。这些包括细胞表面C46表达的FACS测定和shRNA介导的CCR5表达的敲低，以及每个宿主细胞基因组的载体拷贝数(VCN)的qPCR测定。对于所有测定，在一系列的载体稀释度下确定滴度来定义线性关系。qPCR测定利用从转导的细胞中提取的基因组DNA并检测C46转基因和来自内源β-珠蛋白基因的序列。这样，可以将C46 VCN归一化至细胞基因组。

相对于瞬时转染方法，在通过生产者细胞系生产的VCM中观察到更高浓度的p24。然而，使用两种系统生产的LVsh5/C46的产量和效力相似。首先使用等体积的VCM通过FACS评估载体的C46滴度。尽管通过瞬时转染生产的载体的滴度略有增加，当将C46滴度归一化并使用qPCR测定或通过功能性敲除CCR5评估载体制备物的基因转导时，通过稳定的生产者细胞系生产的载体显示出更高的效力(参见表2)。与通过瞬时转染产生的载体处理的靶细胞相比，在通过本文公开的方法产生的LVsh5/C46处理的靶细胞中，CCR5表达的下调和基因组C46转基因(VCN)都显著更高(参见表3和图10)。

基于三个独立的测定，已证明本文所述的方法提供稳定的生产慢病毒载体的系统，其能够产生与瞬时转染方法相比相似的质量和数量的SIN-LV。转导的细胞(归一化至C46滴度)中更高的CCR5下调效率和C46 VCN表明生产者细胞产生的LVsh5/C46比使用传统的4质粒瞬时转染方法产生的那些载体具有更好的效力。通过去除繁琐的瞬时转染步骤，不希望受任何特定理论的束缚，据信，这种生产系统可以容易地适用于cGMP条件，以制造用于人类的临床级材料。

实施例2-基于GPRG的生产者细胞系的开发和表征，所述生产者细胞系用于生物制备用于HIV基因治疗的慢病毒载体

已建立GPRG细胞系系统用于自失活慢病毒载体(SIN-LV)的临床生产。在此，开发了用于生产LVsh5/C46的基于GPRG的生产者细胞系(LVsh5/C46是一种SIN-LV，目前在临床评估对感染有HIV的个体的治疗)。这种载体编码两种病毒入侵抑制剂：sh5，一种针对HIV共受体CCR5的短发卡RNA，以及C46，一种病毒融合抑制剂。此外，通过这个实验明确了GPRG包装细胞系、基于GRPG的LVsh5/C46生产者细胞系和四环素诱导后生产LVsh5/C46的稳定性，其是GPRG系统用于LVsh5/C46的生物制备的监管报备和临床应用所需的。

在具有强力霉素(Dox)和嘌呤霉素(Puro)的D10培养基中培养GPRG细胞。为产生LVsh5/C46生产者细胞，使用作为多联阵列的转移质粒TL20-LVsh5/C46和Zeocin抗性质粒转染GPRG细胞。评估单个克隆生产LVsh5/C46载体的能力，并将它们维持在具有Dox、Puro和Zeocin的D10培养基中。为评估亲本GPRG细胞系产生慢病毒(LV)的稳定性，在跨3个月的时间段中用转移载体每10次传代转染GPRG细胞(50+次总传代)(参见图3A和3B)。转染后48小时收获含有病毒的培养基(VCM)并通过互补基因转导试验评估载体滴度。为评估从稳定的生产者细胞克隆生产LV的稳定性，在没有Dox的D10培养基中诱导细胞。诱导后72小时收获VCM并类似地在一系列载体稀释度下评估滴度。为分析长期传代后诱导后VSV-G表达的稳定性，通过撤掉Dox诱导GPRG细胞，然后用生物素缀合的抗VSV-G抗体对细胞染色，然后用链霉亲和素-藻红蛋白进行二级染色。

GPRG细胞表现出严格的四环素调节的VSV-G表达。这种包装细胞系在用LV转移载体转染后能够生产多至10

一旦移除Dox，GPRG细胞系在细胞表面高效表达VSV-G。据信，这些细胞系能够在转染转移载体质粒后产生高LV滴度。此外，这种细胞系允许衍生用于SIN-LV的高滴度生产者细胞系。生产者细胞系证明在长时间的培养过程中稳定的载体生产，并且探索了对使载体生产适应于无血清和悬浮培养系统的能力的评估(参见图7A和7B)。

实施例3-用于产生多联阵列的方案

通过将490mL去离子水和10mL 50×TAE((Tris-醋酸-EDTA)缓冲液)组合来准备500mL 1×TAE电泳缓冲液。

通过向烧杯加入1g琼脂糖和100mL 1×TAE缓冲液(加入2mL 50×TAE和98mL高压灭菌水)配制1％琼脂糖凝胶，并微波混合物直至没有固体颗粒或气泡(约2.5分钟)。

允许混合物冷却3分钟。

向琼脂糖凝胶混合物中加入10μL GelRed

组装制胶盘架和制胶梳子。将混合物导入制胶模中让其冷却30分钟(容量：对于大梳子60μL)。

凝胶冷却后，用1×TAE缓冲液填充盒子直至凝胶完全被淹没。

在室温下准备消化反应混合物以将DNA线性化。

用限制性酶SfiI消化25μg载体质粒。在另外的反应中，用PflMI消化抗性盒质粒PGK-ble(10μg绰绰有余)。

轻轻混合并在37℃下在加热器中孵育15分钟。

将10μL GeneRuler 1kb plus DNA ladder混合物(2μL DNA ladder+8μL无核酸酶水)和50μL样品混合物添加到可用插槽中。

打开电泳仪并用150V跑胶1小时。

将凝胶转移到″UVP PhotoDoc-It″成像系统并获得结果图像。

从Eye-Fi网站下载凝胶图片。

使用NanoDrop 2000分光光度计确定每个样品DNA的浓度。

从琼脂糖凝胶切出DNA条带。

向1体积的凝胶中加入3体积的QG缓冲液(通常加入500μL QG)。

凝胶条完全溶解后，在50℃孵育10分钟。

将其应用到QIAquick柱，并在17,900rpm离心1分钟(可从Qiagen获得)。

丢弃流穿液并将QIAquick柱放回相同的收集管。

向QIAquick柱加入0.5mL QG缓冲液并离心1分钟。

向QIAquick柱加入0.75mL PE缓冲液并离心1分钟。

丢弃流穿液并在17,900rpm将QIAquick柱离心额外的1分钟。

将QIAquick柱放回干净的1.5mL离心管。

为洗脱DNA，向QIAquick膜的中央加入35μL EB缓冲液并在17,900rpm将柱离心1分钟(EB缓冲液是10mM Tris-cl，pH 8.5)。

使用NanoDrop 2000分光光度计测定DNA片段的浓度(使用EB缓冲液作为空白测量)。

在冰上的1.7mL Eppendorf离心管中建立连接反应。

使用预先构建的电子表格(Concatemeric Ligations.xlsx)来计算需要混合的每种片段的体积以产生载体比PGK-ble约25∶1的摩尔比。

使连接反应中的片段体积最大化并保持期望的摩尔比。

应当在室温下解冻并重悬T4 DNA连接酶缓冲液(T4DNA连接酶缓冲液包含以下组分：50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)。

移液连接反应。在上述示例中，通过加入10μL 10X连接缓冲液(NEB QuickLigation kit)和0.5μL连接酶(可从New England BioLabs获得)使用90μL DNA混合物。

在室温下准备含有以下的反应混合物：

上下吹打轻轻混合。

在室温下孵育过夜。

在转染进GPRG细胞前使用基于二氧化硅的膜(DNeasy Blood&Tissue Kit)收获和纯化多联阵列。

将多联阵列混合物移液至置于2mL收集管中的DNeasy迷你旋转柱。

在8000×g下离心1分钟。丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于新的2mL收集管中(已提供)(可从Qiagen获得)。

加入500μL AW1缓冲液，并在8000×g离心1分钟。

丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于新的2mL收集管中(已提供)。

加入500μL AW2缓冲液，并在20,000×g离心3分钟使DNeasy膜干燥。

丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于干净的1.7mL Eppendorf离心管中。

将200μL AE缓冲液直接加到DNeasy膜上。

在室温下孵育4分钟。

在8000×g离心1分钟来洗脱DNA混合物。

重复洗脱一次。

使用NanoDrop Lite分光光度计测定多联体DNA的浓度。

实施例4-使用多联阵列产生生产者细胞系的方案

将细胞解冻后传代至少4次，然后将它们用于病毒载体的生产中。

在载体诱导前，使用台盼蓝方法确保细胞健康并且活力大于95％(台盼蓝常用于进行活细胞计数的染料排斥方法。这种方法基于活(有活力的)细胞不摄取某些染料而死(没有活力)细胞会的原理。染色有助于细胞形态的可视化)。

培养期望数量的GPRG细胞。

将细胞至少每天传代两次，然后接种细胞。

第一天，去除GPRG细胞系培养皿的培养基并用1×PBS洗涤细胞。

将1×TrypLE Express轻轻移液到经洗涤的细胞单层上，对于T75瓶用3ml或者对于T25瓶用1ml。

旋转瓶使得单层被TrypLE Express覆盖。

将瓶送回培养箱并放置2分钟。

轻轻敲击瓶的侧面来释放任何剩余的附着细胞。

将细胞重悬于2mL新鲜D10培养基并转移至15mL锥形离心管中。

在约1200rpm离心细胞约5分钟。

吸出培养基并将细胞团轻轻悬浮于具有强力霉素(1ng/mL)的5mL新鲜D10培养基。

用TC10

在转染前20-24小时，将细胞以80％的汇合度接种在培养皿中(通过在具有强力霉素的60-mm培养皿中铺3.2×10

准备多联阵列的形成(参见，例如，实施例3)。

第二天，在转染前，使CalPhos

纯化多联体DNA并测定浓度(可以根据本文所述的方法纯化多联阵列)。

准备转染质粒DNA(4mL，60mm培养皿)。

对于每个转染，在分别的15mL锥形离心管中准备溶液A和溶液B。

用移液器使溶液B(2×HBS)起泡，并逐滴添加溶液A(DNA混合物)。

在室温下孵育转染溶液15分钟。

将转染溶液轻轻加到培养皿。

轻轻前后移动板以使转染溶液均匀分布。

在37℃CO

4小时后，用1mL预热的D10洗涤并更换为4mL预热的新鲜D10培养基。

在5％CO

在多联体转染后48小时，收获转染的GPRG细胞(进行一次细胞传代)。

用含有Zeocin(50μg/mL)和强力霉素(1ng/mL)的新鲜D10培养基将细胞重铺于T150或30mL、150mm培养皿中。

每3-4天向细胞补充具有强力霉素(1ng/mL)的选择性培养基(Zeocin，50μg/mL)直至鉴别到细胞灶(通常在1-2周内观察到)。

实施例5-对用来产生GPRG包装细胞系的细胞系和序列的说明

HEK-293T/17是HEK-293T的亚克隆。这些细胞稳定表达SV-40T抗原，并且因其高转染性而特别选择了一个克隆。产生了基于HEK-293T/17的主细胞库(HEK-293T/17 MCB)。

SFG-IC-HIVgp-Ppac2是一种γ逆转录病毒载体，其在CMV启动子控制下表达密码子优化的HIV gagpol，具有嘌呤霉素抗性。用来制备这个载体的质粒(pSFG-IC-HIVgp-Ppac2)通过以下组件构建：

(1)pSFG tcLuc ECT3是逆转录病毒载体骨架质粒(SFG)的一种衍生物，使用四环素调控的启动子系统适应于调控的基因表达(Lindemann，D.，Patriquin，E.，Feng，S.，&Mulligan.R.C.Versatile retrovirus vector systems for regulated geneexpression in vitro and in vivo.Mol.Med.3，466-476(1997))；

(2)CMV增强子/启动子驱动的密码子优化的HIV NL4-3 gagpol基因；

(3)PGK启动子驱动的从pMSCVpac衍生的嘌呤霉素抗性基因(Hawley，R.G.，Lieu，F.H.，Fong，A.Z.，&Hawley，T.S.Versatile retroviral vectors for potential use ingene therapy.Gene Ther.1，136-138(1994))。

用SFG-IC-HIVgp-Ppac2逆转录病毒载体感染HEK-293T/17 MCB产生GP细胞系。

SFG-tc-revco是一种γ逆转录病毒载体，其在四环素应答型启动子控制下表达密码子优化的HIV rev。用来产生这个载体(pSFG-tc-revco)的质粒通过以下组件构建：

(1)如上所述的基于NL4-3毒株序列的HIV rev基因以及

(2)pSFG tcLuc ECT3(如上所述)

SFG-tTA是一种γ逆转录病毒载体，其在逆转录病毒LTR控制下表达嵌合转录反式激活子(Lindemann，D.，Patriquin，E.，Feng，S.，and Mulligan，R.C.Versatileretrovirus vector systems for regulated gene expression in vitro and invivo.Mol.Med.3，466-476(1997))。它基于SFG逆转录病毒载体，并整合了来自质粒pUHD15-1的Tet启动子元件(Gossen M，and Bujard，H.(1992)PNAS 89 12：5547-5551)。

用SFG-tc-revco和SFG-tTA感染GP细胞系产生GPR细胞系。

SFG-tc-VSVG是一种γ逆转录病毒载体，其在四环素调控的启动子的控制下表达VSV糖蛋白G。用来制备这个载体(pSFG-tc-VSVG)的质粒的产生使用和另一个载体相同的pSFGtcLucECT3骨架和pMD.G质粒作为VSVG包膜蛋白的来源(参见Ory，D.S.，Neugeboren，B.A.，and Mulligan，R.C.A stable human-derived packaging cell line forproduction of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，11400-11406(1996)以及Rose，J.K.&Gallione，C.(1981)J.Virol.39，519-528)。

用SFG-tc-VSVG感染GPR细胞系产生GPRG细胞系。

Lee，Chi-Lin et al.“Construction of Stable Producer Cells to MakeHigh-Titer Lentiviral Vectors for Dendritic Cell-Based Vaccination.”Biotechnology and Bioengineering 109.6(2012)：1551-1560.PMC.Web.14 Apr.2016描述了用Retro-SVGmu感染GPR细胞系产生GPRS细胞系。

实施例6-多联阵列的纯化

在转染入GPRG细胞之前使用基于二氧化硅的膜收获和纯化多联阵列，然后(DNeasy Blood&Tissue Kit)。

将多联阵列混合物移液至置于2mL收集管中的DNeasy迷你旋转柱。

在6000×g下离心1分钟。丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于新的2mL收集管中(已提供)。

加入500μL AW1缓冲液，并在6000×g离心1分钟。

丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于新的2mL收集管中(已提供)。

加入500μL AW2缓冲液，并在20,000×g离心3分钟来将DNeasy膜控干。

丢弃流穿液和收集管。

将DNeasy迷你旋转柱置于干净的1.7mL Eppendorf离心管中。

将200μL AE缓冲液直接加到DNeasy膜上。

在室温下孵育4分钟。

在6000×g离心1分钟来洗脱DNA混合物。

重复洗脱一次(加入新的洗脱缓冲液)。

使用NanoDrop Lite分光光度计测定多联体DNA的浓度。

实施例7-TL20-UbcGFP&Cal1-WPRE生产者细胞系

以下表4总结了根据本文所述方法合成的两种稳定的生产者细胞系细胞。与TL20-Cal1-wpre和TL20-Unc-GFP载体相关的数据还示于图20A、20B和20C。

缩写：TU，转导单位。

通过使用USC流式细胞术核心设施的流式细胞仪进行单细胞分选。

条件培养基：具有GlutaMax、FBS(10％w/v)、Pen/Strep(1％w/v)、强力霉素(1ng/mL)的DMEM。

在一些实施方案中，所述合成的载体可以包括以下列举的任何治疗基因。例如，可以将编码以下列举的任何基因的核酸插入到本文所述的重组质粒中。在一些实施方案中，所述治疗基因纠正纠正单基因病症。在一些实施方案中，所述治疗基因用于治疗免疫缺陷、遗传性疾病、血液病(例如血友病、血红蛋白病症)、溶酶体贮积病、神经系统疾病、血管生成病症或癌症。

在一些实施方案中，所述治疗基因是编码腺苷脱氨酶的基因、编码α-1抗胰蛋白酶的基因、编码囊性纤维化跨膜传导调节因子的基因、编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因、编码凝血因子(例如人类因子IX)的基因、编码脂蛋白脂酶基因的基因、编码合成多巴胺所需的酶的一个或多个基因、编码胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的基因、编码白介素-2受体γ亚基(IL-2RG)的基因、编码Gp91phox的基因、编码Wiskott-Aldrich综合征蛋白的基因、编码珠蛋白的基因、编码突变珠蛋白的基因(例如具有抗镰细胞形成(antisickling)特性的基因、编码突变β-珠蛋白的基因、编码γ-珠蛋白的基因、编码抗CD19抗体的基因等。在其他实施方案中，所述治疗基因选自珠蛋白基因、鞘磷脂酶基因、α-L-艾杜糖苷酶基因、亨廷顿蛋白基因、神经纤维瘤蛋白1基因、MLH1基因、MSH2基因、MSH6基因、PMS2基因、囊性纤维化跨膜传导调节因子基因、氨基己糖苷酶A基因、肌营养不良蛋白基因、FMR1基因、苯丙氨酸羟化酶基因和低密度脂蛋白基因。

治疗基因的种类的实例包括但不限于，肿瘤抑制基因、诱导或防止细胞凋亡的基因、编码酶的基因、编码抗体的基因、编码激素的基因、编码受体的基因和编码细胞因子、趋化因子或血管生成因子的基因。治疗基因的具体的实例包括但不限于Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-I、zacl、scFV、ras、DCC、NF-I、NF-2、WT-I、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-I、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-11、IL-12、IL-15Rα、IL-15、IL-21、GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、FUS1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSl、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoATV、ApoE、RaplA、胞嘧啶脱氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zacl、ATM、HIC-I、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-I、zacl、DBCCR-I、rks-3、COX-I、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fins、trk、ret、gsp、hst、abl、ElA、p300、VEGF、FGF、血小板生成素、BAI-I、GDAIF、MCC、41BBL、CD80、CD86或OX40。

治疗基因的其他实例是肿瘤抑制基因，包括但不限于FUS1、基因26(CACNA2D2)、PL6、LUCA-I(HYAL1)、LUCA-2(HYAL2)、123F2(RASSFl)、101F6、基因21(NPRL2)、SEM A3、NFl、NF2和p53。

治疗基因的进一步实例是编码酶的基因，所述酶包括但不限于，ACP去饱和酶、ACP氢化酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophorylase)、PDE8A(camp磷酸二酯酶)、ATP酶、乙醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧化酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合酶(hyaluron synthase)、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、裂解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛缩酶、蛋白酶、肽酶、支链淀粉酶(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶或木聚糖酶。治疗基因的其他实例包括编码以下的基因：氨基甲酰基合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸酯合成酶(arginosuccinate synthetase)、精氨酸琥珀酸酯裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A突变酶、戊二酰辅酶A脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、Menkes病铜转运ATP酶、Wilson’s病铜转运ATP酶、胞嘧啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、α-L-艾杜糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶。

治疗基因的进一步实例包括编码激素的基因，所述激素包括但不限于，生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、促黄体生成素、卵泡刺激素、绒毛膜促性腺激素、促甲状腺激素(uiyroid-stimulating hormone)、瘦蛋白、促肾上腺皮质激素、血管紧张素I、血管紧张素II、α-内啡肽、β-黑素细胞刺激素、胆囊收缩素、内皮素I、甘丙肽、抑胃肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂解素、后叶激素运载蛋白、生长抑素、降钙素、降钙素基因相关肽、β-降钙素基因相关肽、高钙血症恶性因子(hypercalcemia of malignancy factor)、甲状旁腺激素相关蛋白、甲状旁腺素相关蛋白、胰高血糖素样肽、胰抑素、胰腺肽、肽YY、PHM、分泌素、血管活性肠肽、催产素、加压素、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkepha linamide)、metorphinamide、α黑素细胞刺激素、心房利钠因子、胰淀素、淀粉样P成分、促肾上腺皮质激素释放激素、生长激素释放因子、促黄体激素释放激素、神经肽Y、K物质、P物质或促甲状腺素释放激素。

还可将其他治疗基因包括在表达中，包括以下描述的那些基因。

腺苷脱氨酶-严重联合免疫缺陷(ADA-SCID)缺陷症导致有毒代谢产物的积累，破坏免疫系统，导致严重联合免疫缺陷(ADA-SCID)，通常称为“泡泡男孩”病。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人ADA cDNA序列。

严重联合免疫缺陷(SCID-X1)病是SCID最常见的形式，占全世界报告的SCID病例的40-50％。IL2RG基因中的突变导致共同γ链(γc)的缺陷表达，γ链是许多细胞因子受体(包括白介素(IL)-2、4、7、9、15和21受体复合物)共享的亚基，其在淋巴细胞发炎和功能中起至关重要的作用。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人γc cDNA序列。

慢性肉芽肿病(CGD)是由吞噬细胞源性的NADPH氧化酶的亚基(gp91phox、p22phox、p47phox、p40phox或p67phox)的缺陷引起的。CYBB基因(编码gp91phox亚基)中的突变导致X连锁形式的CGD，其占患者的大约70％。X连锁的CGD的特征是严重的、威胁生命的细菌和真菌感染，归因于嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的超氧阴离子和其他活性氧中间体生产受损。该疾病的另一个方面是影响器官(例如肠或肺)的无菌、慢性、肉芽肿性炎症，主要由促炎性细胞因子、炎症细胞的凋亡延迟和活化的中性粒细胞分泌的抗炎介质不足引起。预后不佳和侵袭性真菌感染、肝脓肿和慢性肉芽肿炎症的病史有关。可用的治疗策略包括终身抗生素预防、IFN-y给药和HCT。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人亚基cDNA序列。

异染性脑白质营养不良(MLD)是由芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突变引起的罕见的常染色体隐性溶酶体贮积病，该突变导致酶缺乏和未降解的底物脑苷脂3-硫酸(硫脂)在中枢神经系统和周围神经系统中的神经和胶质细胞中的积累。硫脂的这种积累导致进行性脱髓鞘和和神经退行性变。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人ARSAcDNA序列。

黏多糖贮积症I(MPS-I)或赫勒氏综合症是由α-L-艾杜糖苷酶(IDUA)缺乏引起的溶酶体贮积病。该疾病的特征在于糖胺聚糖(GAG)的不当存储，伴有器官增大和损伤，尿液中异常量的GAG排泄，以及特别是影响结缔组织的GAG周转破坏。临床表现包括骨骼畸形、肝脾肿大、精神发育迟滞以及心血管和呼吸功能障碍。IDUA缺乏症会导致广泛的表型表现，而MPS I Hurler(MPS IH)代表这个谱中最严重的疾病变异，表征为涉及多个器官和中枢神经系统的慢性、进行性和致残性疾病进程。如果不治疗，该疾病在儿童期是致命的，由于心肺功能衰竭，死亡通常在生命的头十年内发生。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码α-艾杜糖苷酶(IDUA)的人cDNA。

高雪氏病是最常见的溶酶体贮积病。它是一种常染色体隐性遗传溶酶体贮积病，由糖鞘脂降解所需的葡糖脑苷脂酶(GBA)缺乏引起。临床表现包括肝脾肿大、血小板减少症、骨病和出血性素质，使得经常向血液学专家进行咨询。基因治疗代表针对酶替代疗法的患者和缺乏合适的骨髓供体的患者的治疗选择。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码GBA基因的人cDNA。

溶酶体贮积病(LSD)是罕见的遗传性代谢紊乱，其特征在于溶酶体功能障碍。LSD包含大约70种遗传学上不同的疾病，总发病率为1∶5000活产。实例包括法布里病(α-半乳糖苷酶A缺乏症)、庞贝病(α-葡糖苷酶[GAA]缺乏症)、亨特综合征(艾杜糖-2-硫酸酯酶[I2S]缺乏症)、圣菲利波综合征(分解糖胺聚糖硫酸乙酰肝素所需的一种酶缺乏)和Krabbe病(半乳糖脑苷酯酶缺乏症)。同样，遗传性代谢紊乱是代谢紊乱的一种原因，并且在当缺陷基因导致酶缺乏症时发生。据信，本公开的表达载体可以适应于包括第二核酸序列，其编码适合用于治疗任何上述病症的基因。

丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是由PKLR基因中的突变引起的单基因代谢疾病，其导致可变症状的溶血性贫血，并且在新生儿期间可能致命。PKD隐性遗传特征及其同种异体骨髓移植的治愈性治疗为开发基因治疗方法提供了理想的情景。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人PKLR cDNA。

肾上腺脑白质营养不良(ALD)是由ABCD1基因中的突变引起的罕见的X连锁代谢紊乱，其导致肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)的缺乏和随后的极长链脂肪酸(VLCFA)的积累。VLCFA积累发生在血浆和所有组织类型中，但主要影响肾上腺皮质和脑白质以及脊髓，导致一系列临床结果。ALD的最严重形式是被称为脑ALD(CALD)的炎症性脑表型，涉及进行性髓鞘破坏，髓鞘是脑中神经细胞的保护鞘，负责思考和控制肌肉。CALD的症状通常发生在二酮早期，并且如果不治疗，进展较快，导致大多数患者神经功能丧失并最终死亡。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人肾上腺脑白质营养不良蛋白(ALDP)。

范可尼贫血(Fanconi anemia)(FA)是遗传学骨髓衰竭综合征。至少16个DNA修复基因中的1个中的缺陷导致发育不全并增加恶性肿瘤的风险，特别是AML和MDS。此外，腺瘤、腺癌和鳞状细胞癌的风险增加。大多患者还具有身材矮小、各种形态异常和发育障碍。由于FA患者中同时伴有的内分泌病变，支持性治疗包括定期输注血液产品和生长激素替代物。供体匹配的背景下的HSCT是唯一的治疗选择，因此对于基因治疗来说是具有吸引力的选项。尽管受影响的基因存在异质性，有超过60％的患者的FANCA基因中有突变。在一些实施方案中，本文描述的表达载体的第二核酸编码人FANCA cDNA。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含编码C1酯酶抑制剂蛋白的核苷酸序列。C1酯酶抑制剂蛋白描述美国专利号10,214,731和美国专利公开号2018/0334493，其公开内容在此整体援引加入本文。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含核苷酸序列，其编码用于治疗X连锁无丙种球蛋白血症的布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)。BTK是一种酶，在人类中其由BTK基因编码。BTK是一种激酶，其在B细胞发育中起关键作用。例如，BTK在B细胞成熟以及通过高亲和力IgE受体的肥大细胞激活中起关键作用。BTK基因中的突变与原发性免疫缺陷症X连锁无丙种球蛋白血症有关(布鲁顿无丙种球蛋白血症)。XLA患者在他们的骨髓中具有正常的前前B细胞群，但是这些细胞无法成熟并进入循环。在一些实施方案中，所述合成的载体包含恢复BTK表达的核苷酸序列。合适的载体描述于PCT公开号WO/2018/195297，其公开内容整体援引加入本文。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含一种或多种核苷酸序列，其编码用于纠正原发性免疫缺陷的基因或组件(参见Farinelli G.，et al.(2014)Lentiviral vectorsfor the treatment of primary immunodeficiencies.J Inherit Metab Dis.37：525-33，其公开内容在此整体援引加入本文)。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含编码核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述合成的载体可以包含这样的核苷酸序列，其编码归巢核酸内切酶(例如l-Scel、l-Ceul、Fl-Pspl、Fl-Sce、l-SceTV、I-Csml、l-Panl、l-Scell、l-Ppol、l-Scelll、l-Crel、l-Tevl和l-Tevll)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、II型规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)相关核酸酶(Cas)或megaTAL核酸酶，包括PCT公开号WO/2018/034523、WO/2017/156484、WO/2017/106528和WO/2015/089046或美国专利公布号US/2019/0169597中描述的那些中的任一种，其公开内容在此整体援引加入本文。

在一些实施方案中，所述合成的载体可以包含编码酶的核苷酸序列，所述酶可以至少表现出内切核酸酶活性。在一些实施方案中，所述合成的载体可以包含编码CRISPR/Cas组件的核苷酸序列，所述CRISPR/Cas组件例如Cas蛋白或CRISPR-相关蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包括Cas9蛋白、Cas9同源物编码的Cas9样蛋白、Cas9样合成蛋白、Cpf1蛋白、Cpf1同源物编码的蛋白、Cpf1样合成蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白、Cas12蛋白(例如，例如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e)及其变体和修饰形式。在一些实施方案中，所述Cas 9蛋白包括来自多种生物来源中的任一种的Cas9多肽，包括例如，原核来源例如细菌和古生菌。细菌Cas9包括放线菌门(Actinobacteria)(例如，内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))Cas9、产水菌门(Aquificae)Cas9、拟杆菌门(Bacteroidetes)Cas 9、衣原体(Chlamydiae)Cas9、绿弯菌门(Chloroflexi)Cas9、蓝藻细菌门(Cyanobacteria)Cas9、迷踪菌门(Elusimicrobia)Cas9、纤维杆菌门(Fibrobacteres)Cas9、厚壁菌门(Firmicutes)Cas9(例如，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9、无害李斯特菌(Listeria innocua)Cas9、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)Cas9、变异链球菌(Streptococcus mutans)Cas9以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)Cas9)、梭杆菌门(Fusobacteria)Cas9、变形菌门(Proteobacteria)(例如，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari))Cas9、螺旋体(Spirochaete)(例如，齿垢密螺旋体(Treponema denticola))Cas9等。古生菌Cas 9包括广古菌门(Euryarchaeota)Cas9(例如，海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)Cas9)等。

在一些实施方案中，所述合成的载体包含核苷酸序列，其编码哺乳动物β珠蛋白基因(HBB)、γ珠蛋白基因(HBG1)、B细胞淋巴瘤/白血病1 1A(BCL1 1A)基因、Kruppel样因子1(KLF1)基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS 1)基因、白蛋白基因和富含亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)基因。

本说明书中提到的所有出版物均整体援引加入本文。本领域技术人员会领会，可以如具体实施方案中所示对本公开做出多种变化和/或修改，而不脱离如广泛描述的本公开的精神或范围。因此，本发明的实施方案在所有方便都应被认为是说明性的而非限制性的。

虽然已经参考特定实施方案描述了本公开，但是应当理解这些实施方案仅仅是对本公开的原理和应用的说明。因此，应当理解在不脱离由所附权利要求书限定的本公开的精神和范围的情况下，可以对示例性实施方案进行多种修改，并且可以设计其他配置。

序列表

<110> C-L·李(LEE, Chi-Lin)

J·巴特利特(BARTLETT, Jeffrey)

<120> 慢病毒载体的生物制造

<130> Cal-0013WO

<150> US 62/161,133

<151> 2015-05-13

<150> US 62/161,152

<151> 2015-05-13

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6565

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: PUC57-TL20C

<400> 1

ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60

aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120

ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180

aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240

accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300

tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360

ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600

acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660

ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720

ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780

ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840

aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900

aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960

cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020

tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080

agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140

gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200

atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380

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gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500

tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560

aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040

tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340

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aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaaa gaagacaaga tccctgcagg 2520

cattcaaggc caggctggat gtggctctgg gcagcctggg ctgctggttg atgaccctgc 2580

acatagcagg gggttggatc tggatgagca ctgtgctcct ttgcaaccca ggccgttcta 2640

tgattctgtc attctaaatc tctctttcag cctaaagctt tttccccgta tccccccagg 2700

tgtctgcagg ctcaaagagc agcgagaagc gttcagagga aagcgatccc gtgccacctt 2760

ccccgtgccc gggctgtccc cgcacgctgc cggctcgggg atgcgggggg agcgccggac 2820

cggagcggag ccccgggcgg ctcgctgctg ccccctagcg ggggagggac gtaattacat 2880

ccctgggggc tttggggggg ggctgtcccc gtgagctccc cagatctgct ttttgcctgt 2940

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ccactgctta agcctcaata aagcttcagc tgctcgagct agcagatctt tttccctctg 3060

ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3120

aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3180

atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3240

atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3300

aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3360

tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3420

ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3480

tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 3540

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3600

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3660

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagcggatcc gcatctcaat tagtcagcaa 3720

ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 3780

ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 3840

ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 3900

tgtcgactgc agaggcctgc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 3960

gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 4020

agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 4080

tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 4140

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 4200

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 4260

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 4320

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 4380

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 4440

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 4500

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4560

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 4620

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 4680

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 4740

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 4800

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4860

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 4920

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 4980

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 5040

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 5100

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 5160

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 5220

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aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 5340

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 5400

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 5460

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 5520

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 5580

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 5640

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ttgtaaaacg acggccagtg aattc 6565

<210> 2

<211> 3901

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic: TL20C vector backbone

<400> 2