干石斛醇提物在制备治疗脂类代谢障碍药物中的应用

摘要

本发明属于制药技术领域，涉及干石斛醇提物在制备治疗脂类代谢障碍药物中的应用。实验结果证明，本发明制备的干石斛醇提物不仅能够明显增加清道夫受体B类I型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型、低密度脂蛋白受体以及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的mRNA表达水平，从而有效调节胆固醇的代谢，而且能够有效抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平，从而有效调节胆固醇的合成，同时还能够明显抑制微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)的表达水平，从而有效调节甘油三酯(TG)的合成代谢。因此，本发明提供的干石斛醇提物能够用于制备治疗脂类代谢障碍的药物，在治疗脂类代谢障碍方面具有良好的发展前景。

说明书

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及干石斛醇提物在制备治疗脂类代谢障碍药物中的应用。

背景技术

脂类是脂肪、胆固醇、磷脂、脂蛋白、糖脂的总称。脂类代谢障碍包括脂酸、胆固醇、脂蛋白和鞘脂类等的代谢过程中由于酶缺陷所造成的各种疾患。血液中主要两种脂类为：胆固醇和甘油三酯。脂肪和某些蛋白结合形成脂蛋白在血循环中运转。主要的脂蛋白有乳糜微粒(CM)，极低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。每种脂蛋白都有不同的用途，分解和排除的途径也稍有不同。如乳糜微粒来源于肠并从肠道携带某些消化的脂肪进入血液。然后通过一系列酶的作用，乳糜微粒中的脂肪移出作为能量使用或储存在脂肪细胞。最后，失去大部分脂肪(甘油三酯)的残余乳糜微粒通过肝从血液中清除。

机体调节脂蛋白水平的途径主要有两种：一是减少脂蛋白合成并让它们进入血液循环。另一种是加快或减慢脂蛋白从血中移出的速度。在血液中循环的脂肪，特别是胆固醇的水平异常，能导致长远影响。随着个体总胆固醇水平增高，动脉粥样硬化及冠状动脉或颈动脉疾患的危险性增高(因而，发生血管疾病或中风的危险性增加)。但不是所有的胆固醇都会增加心血管疾病的危险。低密度脂蛋白(LDL)携带的胆固醇(所谓坏胆固醇)升高可增加危险性；高密度脂蛋白(HDL)携带的胆固醇(所谓好胆固醇)很少有危险，常常是有益的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干石斛醇提物在制备治疗脂类代谢障碍药物中的应用，是石斛提取物的一种新用途。目前没有任何报道表明石斛提取物应用于脂类代谢障碍的治疗。

本发明提供了干石斛醇提物在制备治疗脂类代谢障碍药物中的应用，所述干石斛醇提物由石斛药材经提取得到。进一步的，所述石斛为霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛和鼓槌石斛中的一种或者两种以上的组合。

进一步的，所述干石斛醇提物的制备步骤为：将石斛干粉，用18-20倍重量份的75％乙醇于55-60℃下进行提取，重复提取，合并提物，然后减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，冷冻干燥至恒重。

进一步的，所述干石斛醇提物可制成一切药学可接受口服和非口服制剂形式，例如可以为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、膏剂、口服液剂中的一种。

本发明的有益效果是：

本发明制备的干石斛醇提物不仅能够明显增加清道夫受体B类I型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型、低密度脂蛋白受体以及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的mRNA表达水平，从而有效调节胆固醇的代谢，而且能够有效抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平，从而有效调节胆固醇的合成，同时还能够明显抑制微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)的表达水平，从而有效调节甘油三酯(TG)的合成代谢。因此，本发明提供的干石斛醇提物能够作为药物应用于脂类代谢障碍的治疗。

附图说明

图1为干石斛醇提物增加HuH7细胞中动脉粥样硬化清道夫受体B类I型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型、低密度脂蛋白受体及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的基因表达；其中，数据以means±SD表示，SRB1：动脉粥样硬化清道夫受体B类I型，

图2为干石斛醇提物抑制胰岛素诱导基因的mRNA的基因表达；其中，数据以means±SD表示，INSIG2：胰岛素诱导基因，

图3为干石斛醇提物抑制HuH7细胞中微粒体三酰甘油转运蛋白的基因表达；其中，数据以means±SD表示，MTTP：微粒体三酰甘油转运蛋白，

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

一般来说，通过以下途径调节脂蛋白水平：一是减少脂蛋白合成并让它们进入血液循环；另一种是加快或减慢脂蛋白从血中移出的速度。

在机体内，胆固醇与蛋白质结合，主要以脂蛋白的形式存在，主要以高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)两种形式在体内进行转运。其中，HDL-C被称为好胆固醇。

高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)具有将胆固醇逆转运回肝脏的作用。这一过程中，卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(Lecithin-CholesterolaCyltransferase，LCAT)对HDL的合成及胆固醇的逆转运发挥至关重要作用，LCAT是由肝脏合成释放进入血液循环的，是一种在血浆中发挥其催化作用的酶，LCAT的作用是将HDL的卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇酯，血浆胆固醇几乎70％-80％是胆固醇酯，均是LCAT催化生成所致。

低密度脂蛋白受体(Low Density Lipoprotein Receptor，LDLR)作为低密度脂蛋白受体家族中的主要成员之一，能够与低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)结合，对体内胆固醇的代谢起到重要的作用。LDLR几乎在所有的细胞中都有表达，但以肝脏中的数量最多。LDL与细胞膜表面的LDLR结合，被吞入细胞，LDLB被溶酶体酶水解释放出游离胆固醇和脂肪酸供细胞利用。胆固醇可以通过一个负反馈调控机制来调控LDLR的转录，当细胞内胆固醇水平升高时，LDLR的转录就下降；当细胞内胆固醇被消耗时，LDLR的转录就被激活。

前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)，也称神经细胞凋亡调节转化酶(NeuralApoptosis-RegulatedConvertase1，NARC-1))，其抑制剂已获监管机构批准，用于治疗LDL-C下降不充分的患者。PCSK9是由PCSK9基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏产生，PCSK9与肝细胞表面的LDL受体(LDL-R)结合，能够使LDL-R降解，血液中LDL-C水平升高。

PCSK9的抗体能干扰其与LDL-R的结合，使肝脏表达更多的LDL-R，降低血液LDL-C水平。动脉粥样硬化清道夫受体B类I型(scavenger receptor class type I，SRBI)对高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)介导的胆固醇和胆固醇酯的摄取起着重要的调节作用，它可促进″胆固醇的逆向转运″，清除血及组织中过多的胆固醇，保护血管，防止动脉粥样硬化的形成或改善已形成的动脉粥样硬化。SRB1是公认的HDL的受体，是介导胆固醇逆转运的关键受体，能够引起胆固醇的双向转运。一方面，SRBI可以介导外周细胞内过剩的游离胆固醇流出，防止游离胆固醇过多堆积造成动脉粥样硬化；另一方面，SRBI可以与HDL结合，促进肝细胞摄取HDL中的胆固醇，使过剩的胆固醇回到肝脏进一步代谢。

胆固醇的代谢由一共同转录因子家族-固醇调节元件结合蛋白(sterolregulating element binding protein，SREBP)所调控，而受细胞内胆固醇水平调节的SREBPs又由SREBP裂解活性蛋白(cleavage-activating protein SCAP)和胰岛素诱导基因(insulin induced gene，INSIG)两种蛋白介导。INSIG基因有两种亚型，即INSIG1和INSIG2，其序列同源性为59％。两者都参与了胆固醇调节因子结合蛋白的转运。SREBP家族的作用广泛，对参与脂肪酸代谢、甘油三脂合成和胆固醇平衡调节的30多个基因有直接的激活作用。SREBP家族包括三个成员：即SREBP-IC、SREBP-la和SREBP-2c；其中，SREBP2是胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins，SREBPS)的存在亚型之一，SREBPS含有三种亚型，即SREBP1a，SREBP1c和SREBP2。SREBP1a和SREBP1c易于激活脂肪酸和三酰甘油合成过程中的基因，而SREBP2则能够与固醇调节元件1(Sterolregulatory element-1，SRE-1)特异性结合，SRE-1是低密度脂蛋白受体(Low-densitylipoprotein receptor，LDLR)和HMG-CoAR这些基因的增强子，SREBP2刺激含有SRE-1的基因表达增强，从而激活HMGCR基因表达。因此，INSIG2蛋白通过影响SREBPs的活化调节脂肪细胞的分化与脂质合成所需的酶转录。

甘油三酯(TG)为生物能量储存的主要形式，当人体摄入的能量超过其消耗的能量时，过剩的能量便以TG的形式储存在脂肪组织。在机体内，胆固醇可以与蛋白质结合，以脂蛋白的形式存在。

微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)是一种主要存在于肝细胞和肠上皮细胞的内质网及微粒体中的蛋白复合物，其主要生理功能是将内质网外的甘油三酯(TG)、胆固醇酯、磷脂酰胆碱转运至内质网腔，参与含有载脂蛋白B(apoB)的脂蛋白合成，是肝细胞内极低密度脂蛋白(VLDL)及肠上皮细胞内乳糜微粒(CM)的合成及分泌不可或缺的脂质转运蛋白。研究表明，MTTP活性显著降低，细胞内TG积聚被抑制。MTTP表达水平的高低能够直接影响脂类和脂蛋白的代谢，从而导致脂类代谢障碍等疾病。

本发明通过对上述胆固醇合成、代谢以及甘油三酯合成代谢相关mRNA的表达水平进行检测，来研究干石斛醇提物作为药物在治疗脂代谢障碍方面的应用效果。

由于现有药用石斛的种类很多，这里本发明实施例以霍山石斛为例，研究石斛醇提物在治疗脂代谢障碍方面的应用效果，但本发明中的石斛并不仅限于霍山石斛，也可以是其他同属的药用石斛，例如铁皮石斛、金钗石斛、流苏石斛或者鼓槌石斛等。

霍山石斛，原产于我国安徽霍山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种，是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为″中华九大仙草之首″、″健康软黄金″，《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖能大幅度提高人体内SOD(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健益寿的功效。

实施例1

制备干石斛醇提物，具体如下：

干石斛醇提物的制备：称取20g霍山石斛干粉，用400mL的75％乙醇于55-60℃下进行提取，提取2次，每次提取24h，合并2次提取液，将合并后的提取液减压浓缩至原体积的1/6-1/8后，进行冷冻干燥至恒重，得到质量体积浓度为100mg/mL的干石斛醇提物。将上述实施例1中制备质量浓度为100mg/mL的干石斛醇提物，在试验前用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后稀释，制备成质量浓度依次为10μg/mL、100μg/mL的一系列干石斛醇提物药液，进行冷藏保管来用于实验，备用。

(I)检测干石斛醇提物对体外HuH7细胞中与胆固醇合成、代谢以及甘油三酯合成相关基因的mRNA的表达分组：HuH7细胞复苏后，用DMEM培养液转入培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养，细胞同步化12h，随机分成2大组，即：①空白对照组：不给药(0μg/ml)；②给药组：干石斛醇提物中剂量组(DEE：100μg/mL)、干石斛醇提物低剂量组(DEE：10μg/mL)，给药作用12h，荧光定量PCR：使用RNAiso Plus提取HuH7细胞的总RNA，通过Oligo dT18将1μg总RNA逆转录为cDNA通过定量PCR技术，使用Toyobo公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix试剂按照说明书对引物进行PCR扩增。每组样品3个复孔，以保证实验数据的有效性。使用GAPDH为内参，检测目的基因清道夫受体B类I型(SRBI)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)、胰岛素诱导基因(INSIG2)以及微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)的mRNA分别相对于内参基因(GAPDH)的表达变化来定量。采用Graphpad7分析数据(即实验组目的基因相对于空白对照组的表达量的变化倍数)。所用引物为：SRB1(hSRBI-f：CTGTGGGTGAGATCATGTGG；hSRBI-r：

GCTCAGCTGCAGTTTCACAG)、PCSK9(hPCSK9-f：AGTTGCCCCATGTCGACTAC；hPCSK9-r：GAGATACACCTCCACCAGGC)、LDLR(hLDLR-f-2：

AGGAGACGTGCTTGTCTGTC；hLDLR-r-2：CTGAGCCGTTGTCGCAGT)、LCAT(hLCAT-f：ACGGGGCCCTACTGTAATAA；hLCAT-r：AGATGCAGCACTGGAAGGAG)、INSIG2(h-INSIG2-f：GTCCAGTGTAATGCGGTGTG；h-INSIG2-r：

TACTCCAAGGCCAAAACCAC)以及MTTP(hMTTP-f：GAGCTTGTACAGCCGGTCAT；hMTTP-r：CAGTTGAGGATTGCTGGTCA)。

结合附图1的实验结果可知，由本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，低剂量干石斛醇提物的给药能够明显增加清道夫受体B类I型(SRBI)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(PCSK9)、低密度脂蛋白受体(LDLR)以及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)的mRNA表达水平，中剂量干石斛醇提物的给药能够明显增加卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)的表达水平。由此可知，干石斛醇提物能够有效调节胆固醇的代谢。因此，干石斛醇提物可以作为治疗脂类代谢障碍的药物使用。

结合附图2的实验结果可知，本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，低剂量和中剂量干石斛醇提物的给药均能够明显抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平。由此可知，干石斛醇提物能够有效调节胆固醇的生物合成。

结合附图3的实验结果可知，本发明制备的干石斛醇提物相对空白对照组(给药浓度为0μg/mL)，低剂量干石斛醇提物的给药能够明显抑制微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)的表达水平。由此可知，干石斛醇提物能够有效调节甘油三酯(TG)的合成代谢。

综上所述，本发明提供的干石斛醇提物不仅能够明显增加清道夫受体B类I型、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型、低密度脂蛋白受体以及卵磷脂胆固醇脂酰转移酶的mRNA表达水平，有效调节胆固醇的代谢，而且能够有效抑制胰岛素诱导基因(INSIG2)的表达水平，有效调节胆固醇的合成，同时还能够明显抑制微粒体三酰甘油转运蛋白(MTTP)的表达水平，有效调节甘油三酯(TG)的合成代谢。因此，本发明提供的干石斛醇提物能够作为药物应用于脂类代谢障碍的治疗。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。