一种提高蛋清ACE抑制肽稳定性和生物利用度的方法

摘要

本发明涉及一种提高蛋清ACE抑制肽稳定性和生物利用度的方法，该方法属于纳米材料生物学领域，首先将氧化石墨烯加入水中，超声得到其分散液，加入氯化锰，过滤干燥后得到附着锰离子的氧化石墨烯片，加热后得到多孔四氧化三锰粉末。将所得粉末溶于水，超声处理，加入活性肽后搅拌离心，冷冻干燥即得四氧化三锰‑活性肽粉末。本发明方法对蛋清ACE抑制肽有持续稳定的释放效果，提高了蛋清ACE抑制肽的稳定性及生物利用度，克服了其在胃肠道中不稳定的缺点，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种提高蛋清ACE抑制肽稳定性和生物利用度的方法。

背景技术

生物活性肽因其能促进人类健康以及副作用小等优点而备受关注。有研究表明这些生物活性肽具有不同的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等活性，其中其中血管紧张素转化酶(angiotensin converting-I enzyme，ACE)抑制肽是一类重要的功能活性肽，通过抑制ACE活性而起到显著的降血压作用。然而大量的研究证实活性肽不稳定，易被体内的蛋白酶和肽酶降解，以某种方式克服胃肠降解、达到可持续释放，实现ACE抑制肽以活性形式能够被小肠有效的吸收和足够剂量运输到靶器官的部位是目前需要解决的瓶颈的问题。蛋清ACE抑制肽RVPSL在经模拟胃肠道体系后，其结构和活性都有所降低，为克服蛋清肽容易受胃肠道蛋白酶和肽酶的降解，从而达到可持续释放的目的，对ACE抑制肽的稳态化修饰成为解决该瓶颈的一个思路。

与传统的材料相比，纳米载体具有很多优势。首先，可以解决生物活性肽稳定性差和溶解度低的问题。纳米载体可以对溶解度低的生物活性肽进行包埋和封装，间接地避免了这一问题，使其能够直接被递送至靶点。同时，纳米载体还可以提高生物活性肽的稳定性，大多数生物活性肽在酸性条件及酶的作用下易降解，生物利用率低，而纳米载体在酸性条件下不易被腐蚀，且能够包埋生物活性肽，避免其被胃蛋白酶等降解而失去活性。其次，纳米载体可以帮助改善生物活性肽的分布和靶向。生物活性肽的分布是由其物理化学性质决定的，而纳米载体具有较高的比表面积，可负载较多的生物活性肽，使它们能够被递送至靶点，实现靶向递送。此外，纳米载体根据被包埋生物活性肽的的释放位置不同，可设计成在受到内部或者外部刺激时释放。

为了解决蛋清ACE抑制肽稳定性差、生物利用度低等问题，本发明基于氧化石墨烯的骨架制备多孔四氧化三锰纳米载体，通过非共价键作用负载蛋清ACE抑制肽，进而提高蛋清ACE抑制肽的稳定性和生物利用度。

发明内容

本发明的目的在于克服蛋清ACE抑制肽在胃肠道中酸性环境和消化酶的作用下易降解、生物利用度低的问题，提供一种提高蛋清ACE抑制肽稳定性和生物利用度的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将氧化石墨烯加入水中，超声处理后加入氯化锰，得到Mn

(b)将混合溶液磁力搅拌一段时间，真空抽滤后，干燥得到附着Mn

(c)将多孔四氧化三锰加入水中，超声分散后加入活性肽搅拌一段时间得到反应液，将反应液离心后冷冻干燥，得到四氧化三锰-活性肽复合物粉末。超声有助于多孔四氧化三锰分散在水中，增加与活性肽的接触，使其能够以非共价键的形式附着在四氧化三锰上以及其孔隙中。

按照上述方案，所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的质量浓度为0.1mg/mL-3mg/mL。

进一步的，所述超声处理的功率为40kHz-60kHz，处理时间为2-5h。

按照上述方案，所加入的氧化石墨烯与氯化锰的质量比为1∶5-1∶20。

按照上述方案，所述加热条件为450℃，加热时间为2-8h，升温的速率为2-20℃/min。

进一步的，溶液的离心条件为6000r/min-12000r/min，5-15min，并重复2-3次。

进一步的，所加入的活性肽序列为RVPSL。

本发明所涉及的原理是：附着Mn

由于附着Mn

本发明的有益效果是：本发明制备方法简单便捷，生产成本低；制备得到的四氧化三锰-活性肽复合物虽在酸性条件下缓慢降解，但对蛋清ACE抑制肽起到了一定的保护作用，提高了其在胃肠道中的稳定性，并且，在胃肠道中能够克服胃肠中消化酶的降解，使得蛋清ACE抑制肽能够以完整的活性形式存在，增加了蛋清ACE抑制肽的稳定性和生物利用率，具有良好的潜力和应用前景。

附图说明

图1为煅烧后的多孔四氧化三锰；

图2为四氧化三锰的X-射线衍射图；

图3为四氧化三锰的扫描电镜图；

图4为四氧化三锰的高分辨率透射电镜图；

图5为不同时间和pH下四氧化三锰-活性肽复合物的释放图；

图6为不同胃肠道消化时间下四氧化三锰-活性肽复合物的剩余量；

图7为不同胃肠道消化时间下四氧化三锰-活性肽复合物的ACE抑制活性；

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例作进一步的说明。

本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。

实施例1

(1)取150mg氧化石墨烯粉末于烧杯中，溶于150mL的去离子水，搅拌均匀后超声分散处理3h，得到氧化石墨烯的分散液，超声功率为50kHz。

(2)称取15mg氯化锰加入至上述所得氧化石墨烯分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌过夜。使用0.44μm水系滤膜真空抽滤后，得到附着Mn

(3)将附着Mn

(4)称取2mg四氧化三锰粉末于试管中，加入10mL去离子水，超声2h得到其分散液，称取2mg活性肽加入至分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌6h，将混合液液以9000r/min的速度离心10min，收集第一次离心的上清液(M)备用，重复3次，离心后冷冻干燥，得到四氧化三锰-活性肽复合物粉末。

(5)将步骤(4)反应液中的上清液移除，分别加入10mLpH为4的PBS缓冲液，置于磁力搅拌器上分别搅拌0，0.5，1，4，8，16，24，36，48，72，96，120h，离心后取1mL(加入1mL对应pH的PBS补齐体积)上清液(P)于228nm处检测其吸光度，重复三次。

(6)将步骤(4)反应液中的上清液移除，加入10mL pH为1.6的人工胃液(用6mol/L的HCl调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(W)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量；随后离心除去上清液，加入10mL pH为6.8的人工肠液(用1mol/L的NaOH调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(C)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量，取出后加入1mL对应胃液或肠液补足体积。

实施例2

(1)取150mg氧化石墨烯粉末于烧杯中，溶于150mL的去离子水，搅拌均匀后超声分散处理3h，得到氧化石墨烯的分散液，超声功率为50kHz。

(2)称取15mg氯化锰加入至上述所得氧化石墨烯分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌过夜。使用0.44μm水系滤膜真空抽滤后，得到附着Mn

(3)将附着Mn

(4)称取2mg四氧化三锰粉末于试管中，加入10mL去离子水，超声2h得到其分散液，称取2mg活性肽加入至分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌6h，将混合液液以9000r/min的速度离心10min，收集第一次离心的上清液(M)备用，重复3次，离心后冷冻干燥，得到四氧化三锰-活性肽复合物粉末。

(5)将步骤(4)反应液中的上清液移除，分别加入10mLpH为5.5的PBS缓冲液，置于磁力搅拌器上分别搅拌0，0.5，1，4，8，16，24，36，48，72，96，120h，离心后取1mL(加入1mL对应pH的PBS补齐体积)上清液(P)于228nm处检测其吸光度，重复三次。

(6)将步骤(4)反应液中的上清液移除，加入10mL pH为1.6的人工胃液(用6mol/L的HCl调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(W)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量；随后离心除去上清液，加入10mL pH为6.8的人工肠液(用1mol/L的NaOH调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(C)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量，取出后加入1mL对应胃液或肠液补足体积。

实施例3

(1)取150mg氧化石墨烯粉末于烧杯中，溶于150mL的去离子水，搅拌均匀后超声分散处理3h，得到氧化石墨烯的分散液，超声功率为50kHz。

(2)称取15mg氯化锰加入至上述所得氧化石墨烯分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌过夜。使用0.44μm水系滤膜真空抽滤后，得到附着Mn

(3)将附着Mn

(4)称取2mg四氧化三锰粉末于试管中，加入10mL去离子水，超声2h得到其分散液，称取2mg活性肽加入至分散液中，置于磁力搅拌器上搅拌6h，将混合液液以9000r/min的速度离心10min，收集第一次离心的上清液(M)备用，重复3次，离心后冷冻干燥，得到四氧化三锰-活性肽复合物粉末。

(5)将步骤(4)反应液中的上清液移除，分别加入10mLpH为7.4的PBS缓冲液，置于磁力搅拌器上分别搅拌0，0.5，1，4，8，16，24，36，48，72，96，120h，离心后取1mL(加入1mL对应pH的PBS补齐体积)上清液(P)于228nm处检测其吸光度，重复三次。

(6)将步骤(4)反应液中的上清液移除，加入10mL pH为1.6的人工胃液(用6mol/L的HCl调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(W)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量；随后离心除去上清液，加入10mL pH为6.8的人工肠液(用1mol/L的NaOH调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(C)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量，取出后加入1mL对应胃液或肠液补足体积。

对照组1

称取一定量的活性肽(包埋量)，加入10mL pH为1.6的人工胃液(用6mol/L的HCl调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h，每个时间点取1mL溶液(W)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量；随后离心除去上清液，加入10mL pH为6.8的人工肠液(用1mol/L的NaOH调节pH)于37℃搅拌0，0.5，1，1.5，2h。每个时间点取1mL溶液(C)检测其中蛋清肽的ACE抑制活性及剩余量，取出后加入1mL对应胃液或肠液补足体积。

为了充分了解本发明提高蛋清ACE抑制肽稳定性和生物利用度的效果，下面通过试验报告进一步说明。

1.对象和方法

(1)受试物：按本发明实施例1～实施例3所给方法制备得到的多孔四氧化三锰；第一次离心的上清液(M)；PBS缓冲液离心后的上清液(P)；每个时间点的人工胃液(W)和人工肠液(C)；实施例1～实施例3中仅PBS的pH不同。

(2)试验方法

对实施例1～实施例3中多孔四氧化三锰进行形貌测定：X-射线衍射、扫描电镜、高分辨率透射电镜测试；对实施例1～实施例3中第一次离心的上清液(M)进行包埋量计算，对实施例1～实施例3，对照组1中PBS缓冲液离心后的上清液(P)、每个时间点的人工胃液(W)和人工肠液(C)进行稳定性测试。

X-射线衍射表征：条件为Cu-Kα(λ＝0.154nm)，管压40Kv，管流40mA，2θ为20-80°扫描速度为2度/min，步长为0.02。

扫描电镜表征：条件为放大倍数18.0k，电压2Kv，图片比例3μm，镜头距离样品的距离0.5mm。

高分辨率透射电镜表征：条件为电压200Kv，图片比例100nm。

体外ACE抑制活性：采用高效液相色谱法对消化前后四氧化三锰-活性肽的ACE抑制活性进行测定。取马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL)底物溶液，加入复合物溶液混合均匀，在37℃恒温水浴中预热3～5min，然后加入ACE液充分混合，37℃保温30min后，再加入的1mol/L HCl终止反应，得到反应液。同时用硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈/水为25∶75等度洗脱，检测波长228nm。

2.试验项目结果与结论

形貌的测定：X-射线衍射结果如图2所示，通过对比四氧化三锰的XRD图谱，在30-40°以及60°的峰与四氧化三锰的特征峰一致；扫描电镜结果如图3所示，通过上述方法制备得到四氧化三锰具有多孔的特性，其孔径范围为30-300nm；高分辨率高分辨率透射电镜结果如图4所示，通过上述方法制备得到多孔四氧化三锰，其横向尺寸为30-200nm。一般来说，尺寸越小的物质在水中的溶解性越好。因此，可认为纳米级的多孔四氧化三锰对提高蛋清ACE抑制肽RVPSL的负载量及稳定性有一定的作用。

包埋量计算：在离心条件下，未吸附的蛋清ACE抑制肽RVPSL会溶于上清液中，而被吸附在多孔四氧化三锰上的蛋清ACE抑制肽RVPSL则会沉下来形成沉淀物，因此可以通过高速离心来分离未被吸附的蛋清ACE抑制肽RVPSL。根据以下公式计算包埋量：

包埋量＝被吸附的蛋清ACE抑制肽质量/载体质量。

计算得到上述制备的多孔四氧化三锰对蛋清ACE抑制肽RVPSL的包埋量为0.42mg/1mg。

稳定性测试：蛋清ACE抑制肽RVPSL的释放如图5所示，在pH为4的条件下，随着时间的增加，胃中的H

体外模拟胃肠道消化结果如图6，图7所示。图6中，在模拟胃中消化的1.5h时，蛋清肽RVPSL的剩余量较多，约为85.65％，与未被保护的RVPSL相比，剩余量约增加28.38％，说明多孔四氧化三锰保护蛋清肽RVPSL克服了胃中的酸性环境以及酶的降解，增强了其在胃中的稳定性。在模拟肠道消化时，蛋清肽RVPSL的剩余量仍高于未被保护的RVPSL剩余量，说明多孔四氧化三锰能够保护RVPSL以克服胃肠道中的酸性环境和消化酶的降解，增强了其稳定性和生物利用度。此外，图7中经过多孔四氧化三锰保护的蛋清肽RVPSL的ACE抑制活性活性也明显高于未被保护的RVPSL，因此，多孔四氧化三锰能够保护蛋清ACE抑制肽RVPSL，使其在胃肠道中能够克服胃肠中的酸性环境以及消化酶的降解，增强了其在胃肠道中的稳定性和生物利用率，使得蛋清ACE抑制肽RVPSL以完整的活性形式被小肠有效的吸收。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。