一种端粒相对长度检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种端粒相对长度检测试剂盒。所述试剂盒包括：端粒基因引物序列，如SEQ ID NO.1‑2所示；内参基因引物序列，如SEQ ID NO.3‑4所示；探针序列，如SEQ ID NO.5所示；内参基因：多拷贝序列作为内参基因序列；标准品：永生化细胞系DNA。该试剂盒进行端粒长度检测效果稳定，原料廉价易得，实验操作简单、易行。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和医学检测技术领域，特别涉及一种端粒相对长度检测试剂盒。

背景技术

端粒是真核染色体末端的特殊末端封端结构，由TTAGGG重复序列和多种蛋白(如庇护素和端粒酶)组成。端粒可确保染色体稳定性，并保护末端免于降解以及与其他染色体融合。由于DNA聚合酶不能将DNA复制到线性染色体的末端，它们起到防止DNA复制过程中重要遗传信息丢失的保护作用。

真核端粒通常以3'单链DNA突出端终止，这对于端粒的维持和加帽至关重要。该3'单链重复DNA回环并退火为双链，形成一个大的物理环结构，称为端粒环(T环)。T环可能提供一种掩盖端粒末端免受细胞活动的一般机制，而细胞活动可以作用于DNA末端并调节端粒的延长和缩短。在T环结构中，在与C链配对并置换G链的基础上，提出了3'突出端侵入双链端粒DNA，形成D环(置换环)。链侵入发生在距端粒物理末端一定距离的地方，因此导致大的T环结构。

目前，常用的端粒长度检测方法主要包括：端粒末端限制性片段分析(TRF)、荧光定量PCR(qPCR)、定量荧光原位杂交(Q-FISH)、流式荧光原位杂交(Flow-FISH)等。其中，TRF方法通过限制性内切酶消化基因组DNA而端粒片段不会被切割，消化产物通过Southernblotting方法检测端粒长度。虽然TRF分析被视为TL测量的“黄金标准”，可测量端粒涂片的强度，从而通常确定平均TL，可以在Southern印迹上成像各种端粒大小，但最短的端粒无法显示。Q-FISH与FLOW FISH均采用荧光标记探针(CCCTAA)3与细胞悬液杂交，通过检测端粒荧光信号进行端粒长度分析。其中，FLOW-FISH技术通过流式细胞仪进行端粒荧光信号分析，能精确获得每个细胞的平均端粒长度，敏感性、重复性较好。但是，由于探针杂交的限制，Q-FISH方法无法在端粒重复低于PNA探针杂交阈值的染色体末端的端粒上检测荧光信号(所谓的无端粒末端)。所有Q-FISH技术的另一个缺点是，该探针还可能与一些间质端粒序列(ITS)结合，该序列由脊椎动物中远离染色体末端的端粒重复序列组成，从而产生一定的假阳性结果。也有人担心某些非常明亮的Q-FISH信号可能代表非常接近的几个端粒的簇，并且不知道它们如何在定量分析中反映出来。

qPCR方法因具备DNA用量少，操作简单、仪器设备易得等优点，特别适用于端粒长度的检测分析。现有的qPCR方法通过设计引物，扩增端粒基因片段与内参基因片段，通过T/S比值来计算端粒相对长度。实验中，由于不同人员、或使用不同批次试剂进行操作，会造成检测结果的批间差异，很难做到对端粒长度的持续动态监测与准确对比分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种端粒相对长度检测试剂盒，以克服现有技术中对端粒长度检测准确性不高等缺陷。

本发明提供一种端粒相对长度检测试剂盒，所述试剂盒包括：

端粒基因引物序列，如SEQ ID NO.1-2所示：

正向引物：GTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，

反向引物：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；

内参基因引物序列，如SEQ ID NO.3-4所示，所述内参基因为YH-1：

正向引物：CGCACAGAGTAGTAAG-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC，

反向引物：GTGCTGGGATTACAGGCGTGAG；

探针序列，如SEQ ID NO.5所示：

VIC-ATGGACAGTGAGATCTGTCCAT-BHQ1-CGCACAGAGTAGTAAG；

内参基因：多拷贝序列作为内参基因序列；

标准品：永生化细胞系(例如293T，Hela细胞等)DNA。

所述端粒基因通过SYBRgreen检测，所述内参基因通过分子信标探针法检测，所述端粒基因和内参基因检测在同一管内进行。

所述内参基因的筛选：通过Blast在人类全基因组序列中，筛选出200BP多拷贝序列作为内参基因序列。

所述内参基因单拷贝序列，如SEQ ID NO.6所示：

GCCCAGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCACCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGGGCCTGGC。

所述试剂盒还包括内部质控标准品及阴性对照，其中阴性对照为超纯水。

所述试剂盒还包括计算得到各检测样本的T/S值的计算系统。

所述试剂盒内部质控体系的建立方法如下：

(1)选取浓度为15-20ng/μL(确认)永生化细胞系DNA为标准品DNA，完成内参qPCR反应与端粒qPCR反应，至少重复三次实验，记录每次实验中的内参CT值及端粒CT值。

(2)分别计算标准品样本在每次实验中的△CT值；

(3)取所有标准品样本△CT值的平均值作为标准品样本的△CT值，即△CT

(4)样品的△CT值为CT(端粒)-CT(内参)，即△CT

(5)计算T/S＝2

所述内参基因的qPCR反应体系包含：

2×SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

内参基因正向引物0.1μL；

内参基因反向引物1μL；其中，所述内参基因的正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

Uniprimer探针1uL，探针浓度为10umol/L；

H

基因组DNA 4μL，其中基因组DNA的浓度为15ng/μL。

所述端粒基因的qPCR反应体系包含：

2×SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

端粒基因正向引物0.1μL；

端粒基因反向引物0.1μL；其中，所述端粒基因的正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

Uniprimer探针1uL，探针浓度为10umol/L；

H

基因组DNA 4μL，其中基因组DNA的浓度为15ng/μL。

所述内参基因和端粒基因的qPCR反应条件如下：

95℃预变性2min；95℃变性15s，50℃退火1s，72℃延伸45s，在50℃退火时采集荧光。本发明还提供一种端粒相对长度检测试剂盒在生物学年龄评价中的应用。

(1)本发明采用校准T/S比作为端粒长度评价标准，可实现端粒相对长度的准确检测及动态评价分析。

(2)本发明中两种基因在同一管内进行，相较以往内参基因和端粒基因分管检测方案，本方案可以消除不同基因检测造成的孔间差干扰，提高实验结果准确度；同时利用多拷贝内参基因替代单拷贝内参基因，可以减少内参基因与端粒基因的拷贝数量差，提升检测结果的稳定性，也使测得结果更加准确。

(3)在标准品的选择上，本发明选用了永生化细胞系DNA作为标品，细胞系端粒长度不随细胞传代而缩短，稳定。

(4)本发明进行端粒长度检测效果稳定，原料廉价易得，实验操作简单、易行。

附图说明

图1为本发明实施例1以不同浓度内参基因的稳定性检测结果。

图2为本发明实施例1中永生化细胞系和正常分化细胞DNA端粒长度随细胞传代的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例提供一种用于端粒长度检测的试剂盒，包括：

端粒基因引物序列，如SEQ ID NO.1-2所示：

正向引物：GTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，

反向引物：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；

内参基因引物序列，如SEQ ID NO.3-4所示，所述内参基因为YH-1：

正向引物：CGCACAGAGTAGTAAG-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC，

反向引物：GTGCTGGGATTACAGGCGTGAG；

探针序列，如SEQ ID NO.5所示：

VIC-ATGGACAGTGAGATCTGTCCAT-BHQ1-CGCACAGAGTAGTAAG；

双色荧光PCR体系建立：

端粒基因通过SYBRgreen检测，内参基因通过分子信标探针法检测，两种基因检测在同一管内进行。

内参基因的筛选：通过Blast在人类全基因组序列中，筛选出约200BP多拷贝序列作为内参基因序列，该基因单拷贝序列，如SEQ ID NO.6所示：

GCCCAGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCACCCGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCGGGCCTGGC；

标准品的筛选：选取永生化细胞系(293T)DNA作为本试剂盒的标准品。

应用本实施例试剂盒进行1例人类白细胞端粒长度检测及生物学年龄计算：

(1)全血基因组DNA抽提后用分光光度计检测浓度，Sample 1浓度为51.14ng/μL；将样本DNA浓度稀释到15ng/uL；

(2)配置qPCR反应液，样本DNA与3个质控品分别进行内参qPCR反应与端粒qPCR反应，每个反应均做3个重复；

其中，内参基因的qPCR反应体系包含：2×SYBR Green I qPCR Mi×10μL；内参基因正向引物0.1μL；内参基因反向引物1μL；其中，内参基因正向引物和内参基因反向引物的浓度均为10μmol/L；50×ROX Reference DyeII 0.4μL；Uniprimer探针1uL，探针浓度为10umol/L；H

内参基因的qPCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s，50℃退火1s，72℃延伸45s。在50℃退火时采集荧光。

端粒基因的qPCR反应体系包含：2×SYBR Green I qPCR Mix10μL；端粒基因正向引物0.1μL；端粒基因反向引物0.1μL；其中，端粒基因正向引物和端粒基因反向引物的浓度均为10μmol/L；50×ROX Reference DyeII 0.4μL；Uniprimer探针1uL，探针浓度为10umol/L；H

端粒基因的qPCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s，50℃退火1s，72℃延伸45s。在50℃退火时采集荧光。记录每次实验中的内参CT值及端粒CT值。

(3)分别计算标准品样本在三次重复实验中的△CT值。

(4)取三次标准品样本△CT值的平均值作为标准品样本的△CT值，即△CT

(5)样品的△CT值为CT(端粒)-CT(内参)，取平均值，即△CT

(6)计算T/S＝2

表1

表2

表3

选取15例血液样本，以20ng/ul的浓度和10ng/ul浓度分别按照上述步骤检测(上样4ul，所以样本含量80ng和40ng)；

实验过程：用不同的内参基因：YH-1和36B4来判断检测结果的稳定性。

理论上，同一血液样本，在不同样本浓度下，检测结果应该相对一致，证明检测体系稳定性强。本发明发现，用36B4作为内参时，在不同浓度下，检测结果会发生明显波动，即△CT不一致。而用YH-1时，检测结果高度一致，证明检测结果稳定性好，检测结果不受样本浓度影响。如图1所示，通过比较不同模板浓度检测结果稳定性，可以看出，YH-1作为内参结果更加稳定。

Hela细胞，293T细胞是同一类细胞，都是永生化细胞。即细胞的端粒长度不随细胞传代发生变化，体现在△CT不发生明显改变。Hela细胞的端粒长度在6.7左右。293T细胞在7.5左右。分别按照上述步骤检测了10代.20代.30代.40代细胞的端粒长度，发现确实不发生明显变化，因此本发明选用了2937T细胞作为标准品，Huvec细胞是正常分化细胞，作为对照组，所以△CT发生变化。由图2可知，Hela、293T为永生化细胞系，Huvec为正常分化细胞(对照组)，可以看出，永生化细胞系DNA端粒长度(△CT)不随细胞传代而发生改变。

以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 东华大学

<120> 一种端粒相对长度检测试剂盒

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttgggttt gggtttgggt ttgggtttgg gtt 33

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcacagagt agtaaggaaa gtgaagtagg ccgggc 36

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgctgggat tacaggcgtg ag 22

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggacagtg agatctgtcc atcgcacaga gtagtaag 38

<210> 6

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcccagctaa ttttttgtat ttttagtaga gacggggttt caccgtgtta gccaggatgg 60

tctcgatctc ctgacctcgt gatccacccg cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag 120

gcgtgagcca ccgggcctgg c 141