一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂及应用

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，其目的是提供一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，包括：Tris、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dUTP、dNTP、2×SYBR GreenⅠ、甘油和甘露醇与蔗糖的混合液。本发明的另一目的是提供一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂的应用，包括以下步骤：1)将2×SYBR qPCR Mix试剂12.5ul，模板DNA100ng，Primer F和Primer R分别添加1ul，用ddH2O补充反应体系至25ul；2)采用三步法进行qPCR扩增检测，即完成2×SYBR qPCR Mix试剂的应用。本发明的2×SYBR qPCR Mix试剂可以有效提高DNA聚合效率，减少PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，显著提高扩增率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂及应用。

背景技术

荧光定量PCR是1996年美国Roche公司推出荧光定量PCR检测试剂，用于临床疾病的诊断，实时荧光定量PCR是一种通过荧光染料或者探针在PCR反应过程中和DNA双链结合时产生荧光信号，通过对荧光信号的实时检测监控PCR反应过程，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

探针法因需要对探针进行设计和优化，所以实验成本较高，因而推广使用较少，而染料法因无需设计引物，成本较低，且操作简单，和常规PCR操作基本相同。但是染料法由于染料与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。

发明内容

基于上述背景技术，本发明的目的是提供一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，可以有效提高DNA聚合效率，显著降低引物二聚体含量，减少非特异性扩增产物的形成，提高扩增率。

本发明的另一目的是提供一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂的应用。

本发明采用以下的技术方案：

一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，包括：Tris、MgCl

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，所述甘油在体系中的质量百分数为0.0002％。

上述技术方案中，甘油可以提高Taq聚合酶酶活，提高qPCR聚合反应效率。优选地，甘油在体系中的质量百分数为0.0002％。

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，试剂体系中，所述MgCl

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，试剂体系中，所述Tris为50mM，Taq DNA聚合酶为0.15U/ml，dUTP为0.4mM，dNTP为0.2mM，甘露醇和蔗糖的混合液在体系中的质量百分数为20％。

上述技术方案中，Tris和MgCl

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，所述Tag DNA聚合酶为高度热稳定性聚合酶，来源于嗜热菌Thermus Aquaticus的PolA基因，且进行了多个关键位点的基因进化，经大肠杆菌表达，多种介质纯化而得到。

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，所述Tag DNA聚合酶的分子量为94kDa；具有5'-3'聚合酶活性和5'-3'核酸外切酶活性。

e Taq DNA Polymerase具有5'-3'聚合酶活性和5'-3'核酸外切酶活性。

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，所述2×SYBR GreenⅠ为根据发光量优化的预混液。

上述的高效型2×SYBR qPCR Mix试剂，进一步地，所述甘露醇与蔗糖的混合液中，甘露醇和蔗糖的质量比为4:1。

一种高效型2×SYBR qPCR Mix试剂的应用，包括以下步骤：

(3)将2×SYBR qPCR Mix试剂12.5ul，模板DNA 100ng，Primer F和Primer R分别添加1ul，用ddH

(4)采用三步法进行qPCR扩增检测：

即可完成2×SYBR qPCR Mix试剂的应用。

上述技术方案中，步骤(2)中95℃5min可以更好地将Taq DNA聚合酶启动利于PCR反应。

本发明的有益效果：

可以有效提高DNA聚合效率，减少PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，显著提高扩增率。

附图说明

图1为实施案例1中不同2×SYBR qPCR Mix试剂的PCR扩增效率；

图2为体系中不同MgCl

图3为体系中不同甘油浓度对Taq酶活性影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实验案例一：

对比例1：市售常规2×SYBR qPCR Mix试剂。

实施例1：Tris、MgCl

将对比例1和实施例1中的2×SYBR qPCR Mix试剂按照表1配方分别混合均匀：

表1

将按照表1混合好的实施例1和对比例1混合液按照三步法进行qPCR扩增检测：

实验结果见图1所示，结果显示，相比于市售常规2×SYBR qPCR Mix试剂，实施例1中2×SYBR qPCR Mix试剂可以显著提高PCR扩增率。

实验案例二：(Mg

1单位(U)Turbo e Taq DNA Polymerase活性定义为：在74℃，30分钟内，以大马哈鱼精子DNA作为模板引物，将10nmol dNTP掺入到酸不溶物质所需的酶量。

实施例2：TRIS-HCL(pH9.3)25mM；β-巯基乙醇1mM；活化鲑鱼DNA 0.75ml；dCTP、dATP、dGTP和dTTP各200um。

在反应体系中分别添加：

MgCl

再加入10ul预先测定酶活为5U/ulTurbo e Taq DNA Polymerase，74℃反应30min测定Turbo e Taq DNA Polymerase酶活性。

实施例3：TRIS-HCL(pH9.3)25mM；MgCl

在反应体系中分别添加：

0.0005‰甘油、0.001‰甘油、0.0015‰甘油、0.002‰甘油、0.0025‰甘油、0.003‰甘油、0.004‰甘油和0.005‰甘油；

再加入10ul预先测定酶活为5U/ulTurbo e Taq DNA Polymerase，74℃反应30min测定Turbo e Taq DNA Polymerase酶活性。

实验结果见图2和图3所示，结果显示，10mM的MgCL

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。