酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法

摘要

本发明涉及葡萄酒、果酒酿造技术领域，具体涉及一种酿造酵母Bei‑29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法。通过将优选胶红酵母与酿酒酵母进行混菌发酵，提高发酵原酒中类胡萝卜素（虾青素、β‑胡萝卜素、玉米黄素及番茄红素）的含量，改善去甲类异戊二烯、萜烯类香气物质及果香酯类物质的组分和含量。本发明采用的方法为：1）将优选胶红酵母Bei‑29进行活化培养；2）将活化培养后的胶红酵母Bei‑29进行扩大培养；3）将扩大培养后的胶红酵母Bei‑29与酿酒酵母进行混菌发酵；然后进行类胡萝卜素及去甲类异戊二烯类香气化合物的检测。

说明书

一、技术领域：

本发明涉及葡萄酒、果酒酿造技术领域，具体涉及一种酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法。

二、背景技术：

果酒是以新鲜水果或果汁为原料,经全部或部分发酵酿制而成的发酵酒。我国是酒精饮料消费大国，近年来果酒行业发展前景广阔，果酒类产品以其低酒度、高营养、口感佳等特点越来越被消费者认同和接受。据《中国果酒市场前景调查分析报告》显示，2013～2017年，我国果酒产量平均增长15％。然而，基于果酒市场由导入期向成长期过渡的现状，面对果酒市场的多元性需求，果酒行业面临着产品风格单一、技术基础薄弱、缺乏标准、文化缺失等诸多问题。

类胡萝卜素是一类由植物和某些光合微生物产生的亲脂性萜类化合物，是食品中重要的功能性化学物质。对于人体而言，类胡萝卜素不仅是维生素A、视黄醇的合成前体，还具有清除内源性活性氧、清除自由基、防止低密度脂蛋白氧化的功能，是人体内重要的抗氧化剂。同时，类胡萝卜素可裂解衍生出香气阈值较低的去甲类异戊二烯类香气物质，有效改善果酒香气典型性，塑造果酒的香气特征与风格特色。

在果酒发酵中，酿酒酵母单一发酵常常会造成产品风格的同质化，越来越多研究发现，一些优选非酿酒酵母菌株具有提高葡萄酒风味复杂性的作用。胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)酒精发酵能力较弱，却可以根据培养基成分及培养环境合成不同种类胡萝卜素。此外，胶红酵母中还富含虾青素、不饱和脂肪酸、维生素E、核苷酸等多种生物活性物质。

三、发明内容

本发明提供一种酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法，通过将优选胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行混菌发酵，提高发酵原酒中类胡萝卜素(虾青素、β-胡萝卜素、玉米黄素及番茄红素)的含量，改善去甲类异戊二烯、萜烯类香气物质及果香酯类物质的组分和含量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

1)将优选胶红酵母Bei-29进行活化培养；

2)将活化培养后的胶红酵母Bei-29进行扩大培养；

3)将扩大培养后的胶红酵母Bei-29与酿酒酵母进行混菌发酵。

所述的具体步骤为：

所述步骤1)将胶红酵母Bei-29进行活化培养：将优选胶红酵母菌株Bei-29 的甘油保藏液接种于5mL YPD培养基，接种浓度10％，28℃活化培养48h；

所述步骤2)将活化培养后的胶红酵母Bei-29进行扩大培养：将步骤1) 活化培养液以5％的浓度接种于100mL YPD培养基，28℃180rpm/min扩大培养72h；

所述步骤3)将扩大培养后的胶红酵母Bei-29与酿酒酵母进行混菌发酵：取成熟的水果，低温快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/L SO

进一步，水果含糖量≥150g/L，以葡萄糖计；含酸量≥4g/L，以酒石酸计。

一种酿造酵母Bei-29的健康营养型果酒的检测方法：其特征在于：方法步骤为：

步骤1)发酵果酒中类胡萝卜素的提取：取10mL果酒至15mL离心管，在4℃下8000r/min离心5min，去上清液，用0.9％的氯化钠溶液在上述离心条件下清洗沉淀两次，去上清液，在沉淀中加入10mL丙酮和5mL玻璃珠，利用细胞破碎仪破碎3min，取出离心管放于冰上冷却30s，重复该操作3～5 次，显微镜镜检至细胞完全破碎，4℃下10000r/min离心10min，取上层深色清液，用5mL丙酮清洗沉淀和玻璃珠，重复破碎后的离心操作至萃取完全，收集所有上层清液于15mL离心管，加入0.2g Tween-80，将萃取收集的上层溶液放入真空旋蒸仪中富集浓缩，低温旋蒸至干燥，复溶于2mL无菌蒸馏水混匀，用0.22μm有机系针头过滤复溶液即得类胡萝卜素提取液，放于4℃冰箱备用，所有操作应在避光条件下完成；

步骤2)HPLC-DAD分析：将步骤1)类胡萝卜素提取液进行HPLC-DAD 分析，色谱分析条件：色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18(5μm，4.6×250mm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：460 nm；上样量：20μL；流动相A为甲醇：纯水：甲基叔丁基醚＝30：10：1；流动相B为甲醇:甲基叔丁基醚＝1：1，即得总类胡萝卜素含量≥2.45±0.1mg/L；

步骤3)果酒中去甲类异戊二烯类香气化合物含量的检测：采用 SPME-GC-MS技术，取8ml果酒于棕色顶空瓶，加入2.000g NaCl和20μg内标物2-辛醇，将顶空瓶置于岛津A0C-6000上进行自动进样操作，进样口温度 220℃，离子源温度220℃，质谱扫描范围为30-350amu，扫描频率0.02s/ 次，即得总降异戊二烯类香气化合物含量≥39±5μg/L。

上述步骤3)中2-辛醇的浓度为0.016g/L。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1)本发明集成优选胶红酵母Bei-29与酿酒酵母的顺序接种混菌发酵、冷浸渍等先进果酒生产工艺技术，促进品种香气的释放，并提高发酵原酒中类胡萝卜素和去甲类异戊二烯类香气化合物的组分及含量，从而塑造果酒的香气典型性；

2)本发明采用AHP层次分析方法，综合评价不同接种方案下，类胡萝卜素及去甲类异戊二烯类香气化合物的组分及含量变化，优化集成混菌发酵健康营养型果酒的最佳接种方案；

3)本发明结合低温细胞破壁法及HPLC-DAD技术检测果酒中类胡萝卜素的含量，少时多次的低温研磨破壁同时丙酮萃取，大幅减小了样品浸入和提取时间差，有效防止了酶促氧化，表面活性剂Tween-80通过降低类胡萝卜素分子的表面张力，抑制了类胡萝卜素间的异构化。

四、附图说明：

图1为本发明的技术流程图；

图2为优选胶红酵母Bei-29菌株WL培养基菌落形态(28℃下72h培养) 和细胞显微形态(10×100倍)，其中(a)胶红酵母北-29细胞形态(b)扩大培养72h培养液(c)胶红酵母北-29菌落形态；

图3为优选酵母胞外提取物中糖苷酶和酯酶酶活；

图4为模拟葡萄汁混合发酵中胶红酵母与酿酒酵母的生长趋势；

图5为胶红酵母发酵果酒中的类胡萝卜素的液相色谱出峰图(1～4依次为：虾青素，玉米黄质，番茄红素，β-胡萝卜素)。

五、具体实施方式：

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用胶红酵母的生物特性，同时采取混菌发酵的手段调控发酵进程中类胡萝卜素的含量，不仅最终产品的香气特征及其强度有所改善，同时类胡萝卜素等生物活性物质将成为果酒中重要的健康营养功能性成分。

本发明采用人工筛选的优良胶红酵母Bei-29菌株，(该菌株保藏名称为胶红酵母北29(Rhodotorula mucilaginosa北29)；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号：CCTCC NO:M2013660，保藏日期为：2013年12月13 日)，保藏地址：中国武汉。

如图2(a)所示，在YPD培养基中28℃培养24h，取菌液稀释制成临时装片用于显微镜观察，如图2(a)所示，胶红酵母细胞呈圆形或卵圆形，其大小为(2.7～5.3)×(2.8～6.4)μm。在显微镜下观察，胶红酵母细胞单个或成对出现，大多数为出芽生殖，未观察到子囊孢子。如图2(b)所示，扩大培养 72h后可观察到胡萝卜色发酵液及粉红色粘稠菌泥沉淀。如图2(c)所示，该菌株在WLAN培养基上菌落呈圆形，边缘全缘整齐，表面光滑有光泽，切面隆起，质地较粘稠，易于挑起，其表面颜色在菌落生成72h内随生长时间逐渐由白色显色为粉红色。同时该菌株具有较高的产番茄红素能力，是量产类胡萝卜素的潜力菌株。

本发明采用AHP层次分析方法，在研究优选野生酵母与酿酒酵母混合发酵，提高类胡萝卜素及去甲类异戊二烯类化合物组成含量的基础上，结合混菌发酵、冷浸渍等先进果酒生产工艺技术，综合评价并优化集成一种酿造酵母 Bei-29的健康营养型果酒的制备方法及检测方法，生产具有重要健康营养功能性成分的果酒产品，丰富我国酒类饮料产品市场。

本发明一种添加酿造酵母Bei-29的果酒的制备方法的步骤为：

1)优选胶红酵母Bei-29进行活化培养；

2)将活化培养后的胶红酵母Bei-29进行扩大培养；

3)将扩大培养后的胶红酵母Bei-29与酿酒酵母进行混菌发酵。

本发明以前期优选的一株胶红酵母菌株Bei-29为材料(其胞外提取物糖苷酶活性及酯酶活性图，如图3所示)，采取混菌发酵的手段调控发酵进程中类胡萝卜素的含量，研究比较了1:1生物量同时接种与1:1顺序接种两种接种方案对最终果酒产品中类胡萝卜素等生物活性物质含量及香气特征的影响，同时分析了不同接种方案下酿酒酵母及胶红酵母生长趋势。结果表明，提前接种是延长胶红酵母生存时间，提高其生长量的主要手段，如图4所示；提前48h接种胶红酵母可以显著提高葡萄酒的品种香气含量(1549±24μg/L)及果香酯类物质含量(8178±131μg/L)，尤其是萜烯类香气物质中橙花叔醇(125±2μg/L) 及去甲类异戊二烯类香气物质中TDN的含量(14±1μg/L)，如表1所示；研究检测了优选胶红酵母Bei-29扩大培养液中虾青素、玉米黄素、番茄红素、β- 胡萝卜素的含量，其中番茄红素含量高达1764.64μg/L，如图5所示。

本发明一种添加酿造酵母Bei-29的果酒的制备方法，应用于生产，具体实施步骤如下(选用爱格丽葡萄)，如图1所示：

(1)优选胶红酵母Bei-29进行活化培养：将优选胶红酵母菌株Bei-29的甘油保藏液接种于5mL YPD培养基(葡萄糖2％、蛋白胨2％、酵母浸粉1％)，接种浓度10％，28℃活化培养48h；

(2)将活化培养后的胶红酵母Bei-29进行扩大培养：将步骤1)活化培养液以5％的浓度接种于100mL YPD培养基，28℃180rpm/min扩大培养72h；

(3)将扩大培养后的胶红酵母Bei-29与酿酒酵母进行混菌发酵：取成熟度良好的爱格丽葡萄(调整含糖量≥150g/L(以葡萄糖计)、含酸量≥4g/L(以酒石酸计))，低温(≤10℃)快速除梗破碎，在破碎的同时添加50mg/L SO

本发明制备出的葡萄酒原酒中类胡萝卜素及去甲类异戊二烯类香气化合物的检测：

步骤1)发酵果酒中类胡萝卜素的提取：取10mL果酒至15mL离心管，在4℃下8000r/min离心5min，去上清液，用0.9％的氯化钠溶液在上述离心条件下清洗沉淀两次，去上清液，在沉淀中加入10mL丙酮和5mL玻璃珠，利用细胞破碎仪破碎3min，取出离心管放于冰上冷却30s，重复该操作3～5 次，显微镜镜检至细胞完全破碎，4℃下10000r/min离心10min，取上层深色清液，用5mL丙酮清洗沉淀和玻璃珠，重复破碎后的离心操作至萃取完全，收集所有上层清液于15mL离心管，加入0.2g Tween-80，将萃取收集的上层溶液放入真空旋蒸仪中富集浓缩，低温旋蒸至干燥，复溶于2mL无菌蒸馏水混匀，用0.22μm有机系针头过滤复溶液即得类胡萝卜素提取液，放于4℃冰箱备用，所有操作应在避光条件下完成；

步骤2)HPLC-DAD分析：将步骤1)类胡萝卜素提取液进行HPLC-DAD 分析，色谱分析条件：色谱柱为Welch Ultimate AQ-C18(5μm，4.6×250mm)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：460 nm；上样量：20μL；流动相A为甲醇：纯水：甲基叔丁基醚＝30：10：1；流动相B为甲醇:甲基叔丁基醚＝1：1，即得总类胡萝卜素含量≥2.45±0.1mg/L；

步骤3)果酒中去甲类异戊二烯类香气化合物含量的检测：采用 SPME-GC-MS技术，取8ml果酒于棕色顶空瓶，加入2.000g NaCl和20μg 内标物2-辛醇(2-辛醇浓度为0.016g/L)，将顶空瓶置于岛津A0C-6000上进行自动进样操作，进样口温度220℃，离子源温度220℃，质谱扫描范围为30-350 amu，扫描频率0.02s/次，即得总降异戊二烯类香气化合物含量≥39±5μg/L。

本发明采用AHP层次分析方法综合评价各项指标，最终优化集成胶红酵母菌株Bei-29与酿酒酵母菌株的混菌发酵健康营养型果酒的使用方法。

本发明优选胶红酵母发酵果酒样品中类胡萝卜素的回收率，如表1所示：

表1优选胶红酵母发酵液样品中类胡萝卜素的回收率

实验测定了胶红酵母发酵果酒中，优选胶红酵母产生的β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄素、虾青素4种类胡萝卜素组分的含量，以番茄红素和虾青素为主，含量均超过350μg/L，占4种总类胡萝卜素含量的82.20％～86.95％。番茄红素含量最高(1764.64μg/L)，占4种总含量的71.32％～72.2％；β-胡萝卜素含量最小(43.94μg/L)，占1.72％～1.85％。

本发明不同接种方案下爱格丽干白葡萄酒主要香气物质的SPME-GC-MS 分析结果，如表2所示：

表2不同接种方案下爱格丽干白葡萄酒主要香气物质的SPME-GC-MS分析结果(μg/L)

备注：**四个酿造处理之间极显著差异(p<0.01)；数据为平均值±标准差(n＝2)。

由不同接种方案(包括发酵菌种、接种顺序2个因素)样品中挥发性成分的GC-MS分析结果可得，与单一酿酒酵母发酵相比，优选胶红酵母与酿酒酵母的混菌发酵有效提高了爱格丽干白葡萄酒样品中品种香气成分的含量，如 C6-化合物类、萜烯类和C13-去甲类异戊二烯类，果香酯类物质中乙酸酯类香气物质含量显著提高，样品香气的组成含量更均衡。因此，优选胶红酵母Bei-29 与酿酒酵母的顺序接种混菌发酵在提升果酒健康营养功能性成分及塑造果酒的香气风格上效果更好。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。