水禽多种致病菌的多重PCR检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及水禽多种致病菌的多重PCR检测试剂盒及其应用，试剂盒包括：鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌DNA提取液，鸭疫里氏杆菌ompA‑F/R引物，巴氏杆菌kmt‑F/R引物，大肠杆菌phoA‑F/R引物，大金黄色葡萄球菌invA‑F/R引物，10×PCR反应缓冲液，Pfu PCR mix，ddH2O；本发明建立了一种能够同时检测鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种水禽源主要致病细菌的多重PCR检测方法，具有经济快捷、高效、特异性强、重复性好的特点，可用于快速检测水禽主要致病菌。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及水禽多种致病菌的多重PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

我国是水禽的养殖与消费大国，养殖量占世界总量的80％以上，由于养殖中依旧保留着放牧和游水的生活习性，同时受环境控制和养殖水平等因素影响,导致细菌性疾病高发,严重威胁着水禽产业的发展。

鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、葡萄球菌是目前引起水禽细菌性疾病的检出率最高的致病性细菌，发病率和致死率极高，均能引起水禽的共济失调、神经症状。鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌能引起纤维性心包炎和的症状，能进入血脑屏障引起脑膜炎和神经症状；鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌和葡萄球菌能引起水禽的关节肿胀、瘫痪。鸭疫里氏杆菌和巴氏杆菌能引起水禽的大量死亡，病程短。从近年水禽的流行病学调查表明多种病原的混合感染和继发感染普遍存在，因此临床剖检很难迅速确定病因。

在细菌分离鉴定上，鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌和葡萄球菌能在含血清的TSA培养基上生长，菌落形态相似不易辨别，而使用革兰氏染色法不能快速辨别鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌(上述3种细菌为革兰氏阴性菌)，传统生化试验周期较长。

因此精确、高效的病原学检测是对水禽常见细菌性疾病开展诊断和综合防治的关键环节。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中的问题，提供一种能同时检测鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌的葡萄球菌的检测试剂盒，利用该试剂盒进行四种致病菌的检测，具备节约成本、高效率的特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明的第一目的是提供能检测水禽多种致病菌的多重PCR检测试剂盒，所述多种致病菌为鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、葡萄球菌，所述试剂盒包括：鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌DNA提取液，鸭疫里氏杆菌ompA-F引物、鸭疫里氏杆菌ompA-R引物、巴氏杆菌kmt-F引物、巴氏杆菌kmt-R引物、大肠杆菌phoA-F引物、大肠杆菌phoA-R引物、金黄色葡萄球菌invA-F引物、金黄色葡萄球菌invA-R引物，10×PCR反应缓冲液，Pfu PCR mix，ddH

进一步的，所述试剂盒多重PCR反应体系为：DNA提取液各1μL、每个所述引物1μL、ddH

进一步的，所述试剂盒的多重PCR的反应条件为：95℃预变性5min，94℃30s，54℃40s，72℃50s扩增30个循环；72℃延伸10min。

本发明试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)提取待测样品DNA；

(2)利用上述试剂盒进行多重PCR；

(3)将PCR后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，进行结果判定，结果判定为：若出现770bp、543bp、428bp和231bp条带，则表明样品中含有鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌和葡萄球菌。其中未出现的条带片段长度则对应的致病菌未出现。

对本领域技术人员来说，本发明试剂盒应用于水禽多种致病菌中多重PCR检测也应该属于本发明保护的技术范围。

本发明的有益技术效果是：本发明建立了一种能够同时检测鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种水禽源主要致病细菌的多重PCR检测方法，具有经济快捷、高效、特异性强、重复性好的特点，可用于快速检测水禽主要致病菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中四种致病菌PCR扩增条带电泳图；图中M：DL2000；1：鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌多重PCR产物；2：鸭疫里氏杆菌单一PCR产物；3：巴氏杆菌单一PCR产物；4：大肠杆菌单一PCR产物:5：金黄色葡萄球菌单一PCR产物；N：多重PCR阴性对照。

图2是本发明实施例中PCR反应退火温度的优化电泳图；图中M：DL2000；1～6：退火温度依次分别为：50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃。N：阴性对照。

图3是本发明实施例中多重PCR特异性试验结果电泳图；M：DL2000；1：混合DNA(鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)；2.鸭疫里氏杆菌DNA；3.巴氏杆菌DNA；4.大肠杆菌DNA；5.金黄色葡萄球菌DNA；6.链球菌DNA；7.沙门氏菌DNA；8.支原体DNA；9.细小病毒DNA；10.圆环病毒DNA。

图4是本发明实施例中敏感性试验；M：DL2000；1:1～7：10

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

利用本发明试剂盒进行鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、葡萄球菌测定的方法步骤为：

1、设计引物

根据GenBank登录的鸭疫里氏杆菌ompA基因序列(登录号：KY399243.1)、巴氏杆菌kmt基因序列(登录号：LR134514.1)、大肠杆菌phoA基因序列(登录号：NC_000913.3)、金黄色葡萄球菌FemB基因序列(登录号：MG970610.1)经比对分析后，运用DNASTAR软件比对分析序列同源性，采用Primer Premier 5.0软件选择保守区域设计各基因的特异性引物，细菌的名称与各引物信息见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1：多重PCR引物信息

2、单一PCR扩增及产物鉴定

通过设计的特异性引物，分别对鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行单一PCR扩增，单一PCR扩增体系为25μL：2×Pfu MasterMix12.5μL，DNA 2μL，上、下游引物(10umol/L)各1μL，ddH2O加至25μL。反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，扩增30个循环；72℃延伸10min。电泳结果表明各引物特异性良好，OmpA、kmt、phoA和InvA基因的扩增片段大小与预期相符，分别为770bp、543bp、428bp和231bp，测序结果经BLAST比对分析证实均为各自细菌扩增的特异性目的条带。

3、阳性菌株DNA的制备

将测序比对无误的DNA片段连到PUC57载体上，构建同时携带三个基因的质粒，连接转化到DH5α感受态细胞中，作为阳性菌株保存，用试剂盒提取法和水煮法提取该菌株DNA。

4、多重PCR扩增反应条件的优化

对多重PCR反应条件进行优化，包括退火温度(50-60℃)和引物浓度(5-20μmol/L)进行优化，以确定最佳反应条件，以双蒸水作为空白对照。多重PCR扩增体系为50uL：2×PfuMasterMix 25μL，取阳性质粒DNA 4ul，4对上、下游引物各1μL，加ddH2O至50μL。对PCR产物进行1％核酸琼脂糖凝胶电泳，以电泳检测时目的条带亮度大、无非特异性扩增、引物二聚体少为标准确定最佳反应反应条件。

以鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌这4种细菌的单一模板和阳性质粒DNA都能准确扩增，目的片段分别为770bp(鸭疫里氏杆菌)、543bp(巴氏杆菌)、428bp(大肠杆菌)、231bp(金黄色葡萄球菌)，见图1，引物间无非特异性条带，以ddH

退火温度的优化情况见图2，退火温度在50℃至60℃都能扩增出目的片段，其中50℃和60℃条件下扩增的OmpA基因(770bp)片段条带较弱，54℃条件扩增效果较好，因此，确定多重PCR在50μL反应体系中的最佳反应条件为，退火温度54℃，引物浓度10μmol/L，最佳反应程序：95℃5min；95℃30s，54℃40s，72℃50s，扩增30个循环；72℃延伸10min。

5、多重PCR特异性试验

采用优化后的条件，在反应体系分别加入混合DNA(鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、支原体、细小病毒DNA、圆环病毒DNA。以DNA为模板进行多重PCR扩增，对PCR产物进行1％核酸琼脂糖凝胶电泳，以评价多重PCR的特异性。

结果显示，所建立的PCR方法能够从OmpA、kmt、phoA和InvA扩增得到预期大小的片段，而对其它细菌和支原体DNA则均无扩增(图3)，3次重复试验得到相同结果，表明该方法具有良好的特异性。

以不同病原微生物的DNA为模板进行PCR扩增。结果显示，所建立的PCR方法能够从OmpA、kmt、phoA和InvA扩增得到预期大小的片段，而对其它细菌和支原体DNA则均无扩增(图3)，3次重复试验得到相同结果，表明该方法具有良好的特异性。

6、多重PCR敏感性试验

提取阳性菌株的DNA并测定初始浓度，用去离子水进行10倍倍比稀释，采用建立的多重PCR方法进行检测。对PCR产物进行1％核酸琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带，以检测该方法的敏感性。

敏感性试验结果如图4，在多重PCR中，多重PCR的敏感性达到10

7、多重PCR重复性试验

为了评价所建立方法检测结果的可重复性，分别对鸭疫里氏杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及混合DNA进行检测，以ddH2O作为空白对照，重复3次，对3次检测结果进行比较。对PCR产物进行1％核酸琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带。结果表明，该方法可重复性强。

8、临床样品检测

将40份临床采集的样品采用试剂盒法、水煮法提取DNA，并采用建立好的多重PCR进行检测，结果试剂法和水煮法提取法均能检测到目的片段。对所有样品采用多重PCR进行两次重复检测，结果相同。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省畜牧兽医研究所

<120> 水禽多种致病菌的多重PCR 检测试剂盒及其应用

<130> 权利要求书、说明书

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> ompA-F

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