一种利用甲基化抑制剂提高浮萍总淀粉产量的方法

摘要

本发明属于水生能源植物生产领域，具体涉及一种利用甲基化抑制剂提高浮萍总淀粉产量的方法。具体包括一种浮萍培养液，由Zebularine和1/5浓度Hoagland溶液组成，所述Zebularine在1/5浓度Hoagland溶液中的浓度为20～320μM。使用该浮萍培养液培养浮萍，浮萍接种覆盖率≤100％，在16h光与8h暗交替进行的光周期、光照强度为100～110μmol/m

说明书

技术领域

本发明属于水生能源植物生产领域，具体涉及一种利用甲基化抑制剂提高浮萍总淀粉产量的方法。

背景技术

浮萍是世界上最小的开花植物，通常漂浮在水面上进行生长，适应性强，分布较广。浮萍的生长速度极快，在理想条件下16～48小时内其生物量即可翻倍。

作为表观遗传学领域研究重点之一的DNA甲基化具有多方面的生物学意义，是表观遗传的重要特点。在基因调控过程中，DNA甲基化的调控通常范围广、时效长，对甲基化的抑制作用往往是局部、短暂的。常见用于动物和植物研究的甲基化抑制物为胞嘧啶的化学结构类似物，如5-氮杂胞苷(5-aza)、Decitabine等，这些结构类似物均能诱导基因全局甲基化率降低，影响转录反应和发育，但是，这些物质在水溶液中均极不稳定，且具有高毒性和多种副作用。源于胞嘧啶脱氨酶抑制物的甲基化抑制Zebularine被发现具有更好的稳定性和更低的毒性。相较于5-氮杂胞苷(5-aza)、Decitabine，在相同的物理条件处理下，Zebularine具有更长的半衰期，且毒、副作用更小。

研究表明，相较于进化的关系，哺乳动物甲基化的作用相比其他动物的例子而言，与高等植物中甲基化的作用更相似。针对于Zebualrine的DNA甲基化抑制剂作用和反应情况，现有的关于植物的研究对象包括拟南芥、苜蓿、蒲公英、小麦等，主要是针对甲基化抑制剂(Zebularine)对全局甲基化的影响，尚未有文献研究关于利用甲基化抑制剂对浮萍基因全局甲基化的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用甲基化抑制剂提高浮萍总淀粉产量的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种浮萍培养液，由Zebularine和1/5浓度Hoagland溶液组成，所述Zebularine在1/5浓度Hoagland溶液中的浓度为20～320μM。

优选的，所述Zebularine在1/5浓度Hoagland溶液中的浓度为200μM。

相应的，所述浮萍培养液在提高浮萍淀粉产量中的应用。

相应的，一种提高浮萍淀粉产量的方法，使用添加浓度为20～320μM Zebularine的1/5浓度Hoagland培养液，浮萍接种覆盖率≤100％，在光暗交替、光照强度为100～110μmol/m²/s、室温条件下培养。

优选的，所述的Zebularine在1/5浓度Hoagland溶液中的浓度为200μM。

优选的，所述光暗交替条件为16h光与8h暗交替进行的光周期环境。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种能快速提高浮萍淀粉含量的新方法，在48h后就能检测到甲基化抑制剂(Zebularine)对浮萍总淀粉量积累促进作用的浓度效应。本发明不仅能快速提高浮萍淀粉积累，同时也提供了从表观遗传学和遗传学的角度研究浮萍积累淀粉机制的基础。

2、采用本发明的技术方案在富营养条件下培养少根紫萍，其浮萍淀粉增长速率达到了最高为2.21g/m²/d，明显高于相同培养时间不添加甲基化抑制剂(Zebularine)的淀粉增长速率0.19g/m²/d。

说明本发明的方法确实能快速有效提高浮萍的淀粉产量。

附图说明

图1为对比例1淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图2为实施例1组1淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图3为实施例1组2淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图4为实施例1组3淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图5为实施例1组4淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图6为实施例1组5淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图7为实施例1组6淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图8为实施例1组7淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图9为实施例1组8淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图10为实施例1组9淀粉含量随培养时间变化的趋势图。

图11为实施例1组1～9和对比例1中浮萍的淀粉含量随培养时间变化的对比图。

图12为实施例1组1～9和对比例1浮萍的淀粉增长速率随培养时间变化的对比图。

图13为实施例1组1～9和对比例1浮萍的生物量随培养时间变化的对比图。

图14为实施例2在培养0天和7天后细胞中淀粉含量的显微观察对比图。

图15为实施例2和对比例2在培养7天后细胞中淀粉的显微观察对比图。

图16为实施例3在培养0天和7天后细胞中淀粉含量的显微观察对比图。

图17为实施例3和对比例3在培养7天后细胞中淀粉的显微观察对比图。

具体实施方式

下面结合实施例和对比例，对本发明做进一步阐释。

1、下述各例中涉及的材料、溶液及条件说明：

(1)下述各例中采用的浮萍为少根紫萍(Landoltia punctata 0202)、多根紫萍(Spirodela polyrhiza 0196)、绿萍(Lemna minor 7753)，均保存于中国科学院成都生物研究所浮萍种子资源保存库。

(2)下述的按照光量子通量密度为100～110μmol/m²/s的光照条件光周期培养浮萍，所述光量子通量密度均是指对应的光源在接种了浮萍的水体表面的光密度。实验发现，光量子通量密度为100～110μmol/m²/s时，浮萍的生长情况无明显差异，下述各对比例及实施例中，为操作方便，全部选用光量子通量密度为110μmol/m²/s。

(3)Hoagland培养液

1)培养液的组分如表1所示。

表1 Hoagland培养液各组分

2)用蒸馏水按照表1所述，配制A、B、C、D、E、F六种母液，其中，配制母液A时，先用6N的HCl溶液将Ca(NO₃)₂·4H₂O、KNO₃、KH₂PO₄溶解，再加入蒸馏水配制成目标浓度；配制母液D时，先用6N的KOH溶液将EDTA溶解，再加入蒸馏水配制成目标浓度。

3)按照表1所述，将步骤2)配制的六种母液，用蒸馏水配制为Hoagland培养液；再通过HCl及NaOH调整Hoagland培养液的pH值为5.0。所配制的Hoagland培养液中，N元素的浓度为349.73mg/L，P元素的浓度为154.89mg/L。

(4)1/5浓度Hoagland培养液：将一定量的Hoagland培养液与4倍于其体积的蒸馏水混合均匀即得。

2、下述各例中涉及的测定及计算方法说明：

(1)浮萍鲜重的测定方法：将培养一定时间的浮萍取出，用蒸馏水清洗3遍，再在滤纸上放置5分钟，脱水机甩干(每次5min)，称重。

(2)浮萍干重的测定方法：将收获的浮萍用脱水机甩干(每次5min)，然后置于60℃的烘箱中烘干至恒重，称重。

(3)浮萍淀粉含量的测定方法：分别将干燥的浮萍叶状体磨碎成粉末，称取0.03～0.06g浮萍干粉置于250mL磨口锥形瓶中，加入30mL6mol/L的HCl溶液和100mL蒸馏水，装上冷凝管，置沸水浴中回流2h。回流完毕，立即用流动水冷却，待浮萍样品水解液冷却至室温后，加入NaOH调节水解液的pH值为7。然后加入20mL 20wt％醋酸铅溶液，摇匀后放置10min，转移至500mL容量瓶中，加蒸馏水定容至500mL，过滤，弃去初滤液，收集5mL滤液过预活化好的反相C18固相萃取小柱，弃去最初的1～2mL，收集后面的3～4mL，再用0.22μm的水系滤膜过滤。利用HPLC测定滤液中葡萄糖含量，根据淀粉含量＝葡萄糖含量/1.1，计算浮萍叶状体中的淀粉含量。

(3)浮萍的干物质产量(g/m²)＝取样时浮萍的干重/取样水面面积。

(4)浮萍淀粉增长速率(g/m²/d)＝(取样时浮萍的淀粉产量-初始浮萍淀粉产量)/培养时间。

(5)浮萍干物质增产率(％)＝(对应实施例干物质产量-对应对比例干物质产量)/对比例干物质产量×100％；

(6)淀粉含量提高率(％)＝(对应实施例浮萍淀粉含量-对应对比例浮萍淀粉含量)/对比例浮萍淀粉含量×100％；

(7)浮萍细胞中淀粉的显微观察，根据徒手切片叶状体组织的方法，用碘液碘染细胞后压片，用光学显微镜在1000倍油镜下观察细胞中被碘液碘染呈蓝色的淀粉的含量。

对比例1：在1/5浓度Hoagland培养液中培养少根紫萍

1、在表面积为38cm²的培养容器中加入200mL>2鲜浮萍0.9g，转入培养器中(覆盖率约为100％)，光周期(16h光与8h暗，交替进行)条件下培养，培养温度为25℃、光照强度为110μmol/m²/s。

2、培养期间分别在第0、3、7天收获浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，滤纸上放置5分钟，脱水机脱水甩干，继后将鲜浮萍放在60℃的烘箱中烘干至恒重，称取浮萍干重，再将浮萍粉碎成粉末，用HPLC测定葡萄糖含量，并计算淀粉含量。

3、由图1、图13可知，初始淀粉含量为2.49wt％时，浮萍生物量干重最高为34.46g/m²，浮萍淀粉含量最高达到4.48wt％。

实施例1：在添加甲基化抑制剂(Zebularine)的1/5浓度Hoagland培养液中培养少根紫萍

1、本实施例的9组，所采用的浮萍、实验条件及操作同对比例1，不同之处是培养液中还额外添加了甲基化抑制剂(Zebularine)，各组添加甲基化抑制剂(Zebularine)的浓度及初始淀粉含量如表2所示。

表2 各组实施条件

组别甲基化抑制剂浓度组120μM组240μM组380μM组4120μM组5160μM组6200μM组7240μM组8280μM组9320μM

2、由图2～13可知，在本实施例的条件下，添加浓度为20μM时，少根紫萍的淀粉含量随培养时间呈上升趋势。添加浓度为40μM时，浮萍的淀粉含量随培养时间呈持续上升趋势，淀粉含量最高在第7天为(7.87±0.09)％。添加浓度为80μM时，第0～3天，淀粉含量增加趋势平缓，第3～7天，淀粉含量增长迅速，淀粉含量最高在第7天为(12.23±0.05)％。添加浓度为120μM时，浮萍的淀粉含量随培养时间呈上升趋势，培养前期淀粉含量伴随培养时间延长而增加，第3至第7天增长迅速，淀粉含量最高在第7天为(20.27±0.16)％。添加浓度为160μM时，浮萍的淀粉含量随培养时间呈上升趋势，培养过程中淀粉含量伴随培养时间延长而增加，淀粉含量最高在第7天为(23.35±0.21)％。添加浓度为200μM时，浮萍的淀粉含量随培养时间呈上升趋势，培养过程中淀粉含量伴随培养时间延长而增加，淀粉含量最高在第7天为(29.14±0.21)％。

结果表明，在一定培养时间内，当甲基化抑制剂(Zebularine)浓度为20～320μM时，均能稳定、有效地促进浮萍淀粉积累，且该效果随着甲基化抑制剂(Zebularine)添加浓度的增加而增加，在使用浓度为200μM时，效果最佳。

对比例2：在1/5浓度Hoagland培养液中培养多根紫萍

在10mL干净的EP管中加入1/5浓度Hoagland培养液，初始接入5片生长状态良好的低淀粉含量(4.2wt％)的新鲜多根紫萍于EP管中(覆盖率约为100％)，光周期(16h光，8h暗，交替进行)条件下培养，培养温度为25℃、光照强度为110μmol/m²/s。培养期间分别在第0、7天收获浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，放入75％乙醇溶液中，60℃水浴处理10分钟脱色，通过碘浸染叶状体纵切薄片，在光学显微镜下1000倍观察细胞中叶绿体淀粉的含量。

实施例2：在添加甲基化抑制剂(Zebularine)的1/5浓度Hoagland培养液中培养多根紫萍

根据实施例1的结果，选用甲基化抑制剂浓度(Zebularine)为200μM，在10mL干净的EP管中加入10mL含有200μM甲基化抑制剂(Zebularine)的1/5浓度Hoagland培养液，初始接入5片生长状态良好的低淀粉含量(4.2wt％)的新鲜多根紫萍于EP管中(覆盖率约为100％)，光周期(16h光/8h暗)条件下培养，培养温度为25℃、光照强度为110μmol/m²/s。培养期间分别在第0、7天收获浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，放入75％乙醇溶液中，60℃水浴处理10分钟脱色，通过碘浸染叶状体纵切薄片，在光学显微镜下1000倍观察细胞中叶绿体淀粉的含量。

如图14所示，用200μM甲基化抑制剂(Zebularine)处理的第0天和第7天，多根紫萍叶状体细胞中叶绿体中淀粉含量差异显著，第7天能明显观察到细胞中被碘液浸染呈蓝色的淀粉颗粒增加。

如图15所示，对比第7天时对比例2和实施例2处理下，多根紫萍叶状体细胞中叶绿体中淀粉含量，能明显观察到实施例2中多根紫萍叶状体细胞中被碘液浸染呈蓝色的淀粉颗粒明显多于对比例2处理下多根紫萍叶状体细胞中叶绿体中淀粉含量。该结果表明，甲基化抑制剂(Zebularine)浓度为200μM时能有效促进多根紫萍淀粉积累。

对比例3：在1/5浓度Hoagland培养液中培养多根紫萍

在10mL干净的EP管中加入10mL 1/5浓度Hoagland培养液，初始接入10片生长状态良好的低淀粉含量(5.12wt％)的新鲜绿萍于EP管中(覆盖率约为100％)，光周期(16h光，8h暗，交替进行)条件下培养，培养温度为25℃、光照强度为110μmol/m²/s。培养期间分别在第0、7天收获浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，放入75％乙醇溶液中，60℃水浴处理10分钟脱色，通过碘浸染叶状体纵切薄片，在光学显微镜下1000倍观察细胞中叶绿体淀粉的含量。

实施例3：在添加甲基化抑制剂(Zebularine)的1/5浓度Hoagland培养液中培养绿萍

在10mL干净的EP管中加入10mL含有200μM甲基化抑制剂(Zebularine)的1/5浓度Hoagland培养液，初始接入10片生长状态良好的低淀粉含量(5.12wt％)的新鲜绿萍于EP管中(覆盖率约为100％)，光周期(16h光，8h暗，交替进行)条件下培养，培养温度为25℃、光照强度为110μmol/m²/s。培养期间分别在第0、7天收获浮萍样品，用蒸馏水清洗3遍，放入75％乙醇溶液中，60℃水浴处理10分钟脱色，通过碘浸染叶状体纵切薄片，在光学显微镜下1000倍观察细胞中叶绿体淀粉的含量。

如图16所示，用200μM甲基化抑制剂(Zebularine)处理的第0天和第7天，绿萍叶状体细胞中叶绿体中淀粉含量存在差异，但不如少根紫萍和多根紫萍结果显著，说明甲基化抑制的处理效果不仅具有浓度效应，同时具有种间差异。

如图17所示，对比第7天时对比例3和实施例3处理下绿萍叶状体细胞中叶绿体中淀粉含量，实施例3处理下绿萍细胞中被碘液浸染呈蓝色的淀粉颗粒较多。该结果表明，甲基化抑制剂(Zebularine)浓度为200μM时能有效促进绿萍淀粉积累。