用于测定内毒素的改善的细菌内毒素测试

摘要

本文报道了一种测定抗体(使用细菌细胞产生的抗体)样品中低浓度的细菌内毒素的方法，其按照以下顺序包括以下步骤：i)向样品中加入镁离子，ii)稀释样品，iii)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7‑8.0的样品，和iv)使用细菌内毒素测试，特别是鲎变形细胞溶解物测定法，测定样品中的细菌内毒素。

说明书

技术领域

本文报导了细菌内毒素测试(BET)样品制备方法，其克服了由于内毒素屏蔽导致的低内毒素回收(LER)效应。

背景技术

蛋白质疗法(如单克隆抗体)通常使用遗传转化的真核和原核细胞(如细菌)产生。用于细菌生产的是快速生长的细菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)。然而，在重组蛋白的生长和培养期间，高毒性的脂多糖(LPS)分泌到培养基中。这些组分被称为细菌内毒素(简写内毒素)。革兰氏阴性细菌具有LPS作为其细胞壁的重要组分。革兰氏阴性细菌细胞含有约3.5x 10⁵个LPS分子，占据的总面积约4.9μm²(Rietschel,1994,FASEB>

为确保可注射的蛋白治疗剂(如单克隆抗体)对人使用是安全的，必须进行内毒素测试。内毒素测试通常使用美国药典<85>、欧洲药典2.6.14或日本药典4.01中的药典方法，用凝胶-凝结(gel-clot)、显色或浊度鲎血变形细胞溶解物(Limulus amoebocyte lysate，LAL)技术(也称为LAL测定试验或LAL测试)进行。LAL测定试验的药典名称是细菌内毒素测试(BET)。BET用于检测给定样品或物质中不安全水平的内毒素的存在，特别是革兰氏阴性细菌内毒素。

通常用稀释的测试样品与阳性对照一起进行LAL测定试验，阳性对照是具有已知量的掺入对照标准内毒素(CSE)的样品。CSE是商业上可获得的确定形式的内毒素(例如由Lonza,Associates of Cape Cod,Inc.(ACC),或Charles River LaboratoriesInternational,Inc.提供)。根据药典LAL测定试验的限定条件，CSE以非干扰浓度(NIC)掺入(spiked)到稀释样品中以实现50-200％的可接受的回收率。该方法未能认识到，药物制剂样品基质的组分以及存储条件潜在地影响未稀释产品样品中存在的内毒素的LAL反应性。当未稀释的产品样品中掺入内毒素如CSE后进行LAL测定时，对某些生物产品观察到低的内毒素回收率(<50％)。如果产品制剂含有两亲化合物如洗涤剂时，则尤其观察到这种低的内毒素回收。将洗涤剂加入到产品中以溶解治疗性蛋白。这种内毒素屏蔽导致内毒素检测的显著降低，特别是在LPS污染低的情况下。如果掺入后内毒素回收不能通过样品稀释而增加，这种现象被称为“内毒素屏蔽”。

已知用于LAL测定试验以克服测定试验的抑制和/或增强的不同样品预处理。但是，目前这些样品预处理并不能产生令人满意的结果。因此，仍然存在在药物制造期间发生由于内毒素屏蔽而不能被LAL测定试验检测到的内毒素污染的风险。根据目前的知识，有两种不同类型的内毒素屏蔽：

1)由样品中存在的内毒素结合蛋白引起的内毒素屏蔽(“蛋白屏蔽”，Petsch,Anal.Biochem.259,1998,42-47)。例如，众所周知，与例如人脂蛋白Apo A1、溶菌酶、核糖核酸酶A或人IgG形成蛋白-内毒素聚集体，降低内毒素的LAL反应性(Emancipator,1992；Petsch,Anal.Biochem.259,1998,42-47)。

2)由药物产品中经常存在的某些制剂成分或缓冲液组分引起的内毒素屏蔽。例如，由聚山梨醇酯加上柠檬酸盐或磷酸盐的组合特异地引起的内毒素屏蔽被称为“低内毒素回收(Low Endotoxin Recovery)”或LER(Chen,J.and Williams,K.L.,PDA Letter 10,2013,14-16,Williams,American Pharmaceutical Review,October 28,2013：Endotoxintest Concerns of Biologics)。内毒素屏蔽也可以由任何其它缓冲液组分和非离子型洗涤剂或其组合引起。

由于LER效应，当使用常规的LAL测定试验时，在制造期间发生的潜在内毒素污染仍然被低估或未被检测到。LER效应是对药物产品的一个持续挑战(Hughes,BioPharm.AsiaMarch/April 2015,14-25)。

因此，本发明的技术问题是提供克服LER效应的手段和方法。

发明内容

如下所述，通过本发明的方法已经克服了该技术问题。

本文报道了用于定量内毒素的改善LAL测定试验。这种改善的LAL测定试验特别可以用于两亲性基质屏蔽内毒素测定(低内毒素回收(Low-Endotoxin-Recovery)；LER)的情况。

特别是，在本发明的上下文中，令人惊奇地发现，通过向样品中加入镁离子(例如以MgCl₂形式)；稀释样品；和透析具有pH值5.7-8.0的样品的顺序，可以成功克服LER效应。或者换言之，本文报道的样品制备方法适用于克服LAL测定试验中的LER效应。

更具体地说，在本发明的上下文中，已经发现了用于包含抗体的样品(例如治疗性单克隆抗体样品)的样品制备方法。本发明的样品制备方法具有如下优点：如果进行LAL测定试验，其令人惊奇且意想不到地消除了LER效应。更具体地，本发明涉及制备包含抗体的样品用于BET(优选用于LAL测定试验)的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl>2形式，

(b)稀释样品，和

(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-9.0，优选5.7-8.0的样品。

因此，根据本发明，通过实施本发明样品制备方法的步骤(a)至(c)，加工包含抗体的样品(例如治疗性单克隆抗体的样品)。这些步骤及其组合令人惊奇地导致如下样品的提供，其中该样品在进行LAL测定试验时不出现LER效应。或者换言之，进行本文提供的样品制备方法的步骤(a)至(c)之后，包含抗体的样品对LAL酶促级联中的因子C具有反应性。因此，有益地，在通过LAL测定试验测定细菌内毒素之前，进行本发明的样品制备方法。因此，本发明还涉及用于测定(即检测和/或定量)样品中内毒素的方法。特别地，本文提供的内毒素测定方法允许测定(即检测和/或定量)包含抗体(例如治疗性单克隆抗体)的样品中的内毒素。具体地，本发明涉及用于测定包含抗体的样品(优选显示LER效应)中的细菌内毒素的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品(即包含抗体的样品)中加入镁离子，优选以MgCl₂形式，

(b)稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-8.0的样品，

(d)通过使用LAL测定试验测定样品中的细菌内毒素。

优选地，在本发明的样品制备方法或内毒素测定方法中，使用1.5-5ml的透明玻璃钳口平底容器。最优选地，容器是Macherey-Nagel GmbH的螺纹口玻璃瓶(1.5ml或4ml)。

内毒素污染是药物如单克隆抗体生产中的高风险。在现有技术中，通过使用常规的LAL测定试验进行内毒素测试，特别是针对治疗性抗体的内毒素测试。然而，如所附实施例所证实的，LAL测定试验无法检测/低估显示LER效应的抗体制剂中的内毒素污染。对于任何药物样品，特别是对于肌肉内或静脉内施用的药物，未检测到的/低估的内毒素都是极端的安全风险。然而，尽管其具有巨大的实际重要性，但对于LER效应的物理化学机制却一无所知。因此，现有技术未能提供正确测定显示LER效应的治疗性产品中的内毒素的方法。

在本发明的上下文中，已经发现了稳健的物理-化学设置(set-up),其可以消除LER效应并且导致从CSE掺入样品获得令人满意的回收率。特别地，如在举例说明性实施例中所证实的，本文报道的方法允许回收以限定浓度(0.5或5.0EU/ml)掺入到给定样品中的CSE。重要的是，文中提供的方法导致回收率范围在50％和200％之间，这样就满足了FDA的要求。因此，本发明有益地提供了能够去内毒素屏蔽并克服LER效应的方法。更具体地说，在本发明的上下文中令人惊奇地发现，步骤(a)至(c)的特定组合和顺序(即，(a)向待测样品中加入镁离子；(b)稀释待测样品；和(c)透析待测样品(其中样品具有pH值5.7-8.0))，消除待进行内毒素测试的样品的LER效应。或者，换言之，进行步骤(a)至(c)可以导致在样品中去内毒素屏蔽，从而使得可以使用LAL测定试验检测内毒素。实施例证实，本文提供的方法克服了LER效应，例如在配制的利妥昔单抗(rituximab)中。相比之下，相同的方案针对(其不包含抗体但是包含依泊汀-β)不能获得令人满意的结果。这表明，本文提供的方法对于消除抗体制剂中的LER效应是特别有用的，优选是在具有单克隆抗体、柠檬酸盐缓冲液和聚山梨醇酯80的制剂中。

因此，本文提供的样品制备方法和本文提供的内毒素测定方法有益地消除LER效应。因此，这些方法改善了药物中内毒素的检测。这导致具有较少不良反应的药品的生产。因此，本文提供的方法将改善消费者的健康状态，并可挽救危重病人的生命。

在本文提供的方法中，包含在样品中的抗体可以是已经在细菌或真核细胞中产生和/或从细菌或真核细胞纯化的抗体。例如，可以从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生和纯化抗体。在本发明的一个方面，样品(即包含抗体的样品)是溶解的固体样品。在本发明的另一方面，样品(即包含抗体的样品)是液体样品。在本文提供的样品制备方法和内毒素测定方法中，可以考虑抗体(即包含在样品中的抗体)是治疗性抗体。优选地，抗体(即包含在样品中的抗体)是单克隆抗体。然而，在本文提供的方法中，抗体(包含在样品中)也可以是多克隆抗体。文中，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或抗体片段也包括在术语“抗体”中，只要它们表现出期望的生物学活性。抗体可以是人、人源化或驼源化的(camelized)。

本文提供的方法有益地使LER倾向性的药物制剂样品对LAL酶促级联中的因子C具有反应性。已经报道了如下生物产品中的LER效应，所述生物产品用两亲化合物如非离子型洗涤剂配制，特别是当其与作为缓冲液的柠檬酸盐或磷酸盐组合时。实施例证明，本文提供的方法可靠地消除这种治疗性制剂中的LER效应。因此，可以想到，在本文提供的样品制备方法和内毒素测定方法中，所述治疗性抗体(即包含在样品中的治疗性抗体)用至少一种洗涤剂(优选聚山梨醇酯)配制。

然而，可以想到，所述治疗性抗体用聚山梨醇酯配制，所述聚山梨醇酯不包含LAL级联的C反应蛋白中的脂质A腔的结构基序。更具体地，直链脂肪酸如月桂酸可以模拟LAL级联的脂质A分子中的脂肪酸，因为该分子也含有具有12个碳原子且无双键的脂肪酸(即C:D是12:0)。这种直链脂肪酸可以负面地干扰LAL级联。因此，在本文提供的方法中，可以想到，所述治疗性抗体不用包含直链脂肪酸如月桂酸的洗涤剂配制。聚山梨醇酯20包含月桂酸。因此，设想在本文提供的方法中样品(特别是治疗性抗体的样品)不用聚山梨醇酯20配制。磷酸盐缓冲液，特别是磷酸钠缓冲液也可以干扰LAL级联。因此，这些缓冲液对于本文提供的样品制备方法来说是不太有用的。因此，本发明涉及本文提供的样品制备方法或内毒素测定方法，其中包含在样品中的(治疗性)抗体不用磷酸盐缓冲液稀释。在本发明的一个方面，样品不包含0.1mM以上的磷酸盐缓冲液，并且不包含浓度高于其临界胶束浓度(CMC)1/100的聚山梨醇酯20。在本发明的一个优选方面，样品不包含磷酸盐缓冲液和聚山梨醇酯20，或者包含的磷酸盐缓冲液和/或聚山梨醇酯20的量低于使用标准检测方法时的检测限。

如在实施例中通过使用本发明的方法所证明的，可以在配制的利妥昔单抗样品以及利妥昔单抗安慰剂样品中克服LER效应。利妥昔单抗安慰剂样品与利妥昔单抗样品的不同仅在于不存在该抗体。除了该不同之外，利妥昔单抗安慰剂样品含有利妥昔单抗制剂的所有其它组分，如洗涤剂和缓冲液。这表明本文提供的方法不依赖于包含特定单克隆抗体的制剂，而是可以用于例如在显示LER效应的每种制剂中消除该LER效应。这样的制剂包括含有聚山梨醇酯80和螯合缓冲液(如柠檬酸钠)的制剂。该制剂典型地用于抗体，特别是单克隆抗体。因此，预期上述方法可用于克服每种单克隆抗体制剂中的LER效应。利妥昔单抗用聚山梨醇酯80和柠檬酸钠缓冲液(即25mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.5；700mg/l聚山梨醇酯80和154mM NaCl)的混合物配制。设想在本发明的上下文中包含抗体的样品具有该配制。

实施例证实，在用聚山梨醇酯80和柠檬酸盐缓冲液配制的治疗性抗体的示例性样品中，通过使用本文提供的方法可以克服LER效应。因此，在本文提供的样品制备方法或内毒素测定方法中，优选将样品(即包含抗体的样品)用聚山梨醇酯80配制。因此，在本文提供的方法中，设想样品(即包含抗体的样品)包含聚山梨醇酯80。优选地，样品包含500-1000mg/l聚山梨醇酯80，更优选约700mg/l聚山梨醇酯80。进一步设想在本文提供的方法中样品(即包含抗体的样品)用螯合缓冲液(如柠檬酸盐缓冲液)配制。所述柠檬酸盐缓冲液可以是5-50mM柠檬酸盐缓冲液，pH6.0-7.0；优选25mM柠檬酸盐缓冲液，pH6.5。优选地，柠檬酸盐缓冲液是柠檬酸钠缓冲液。例如，在本文提供的方法中，样品(即包含抗体的样品)可以包含5-50mM柠檬酸钠，优选25mM柠檬酸钠。最优选地，样品包含聚山梨醇酯80和柠檬酸钠缓冲液。例如，样品可包含约700mg/l聚山梨醇酯80和5-50mM，优选约25mM柠檬酸钠缓冲液。最优选地，在本文提供的方法中，样品是抗体样品，其用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/l聚山梨醇酯80配制并且具有约6.5的pH值。

在本文提供的样品制备方法或内毒素测定方法中，优选所述抗体(即包含在样品中的抗体)是抗CD20抗体。更优选地，抗体是抗CD20抗体利妥昔单抗。利妥昔单抗的重链和轻链的氨基酸序列在本文中分别如SEQ ID NO：1和2所示。本领域技术人员很容易知道如何从给定的氨基酸序列获得编码核酸序列。因此，利用SEQ ID NO：1和2，可以容易地获得利妥昔单抗的编码核酸序列。利妥昔单抗可商购获得，例如作为和或获得。

在本文提供的样品制备方法或内毒素测定方法的步骤(a)中，镁离子(Mg²⁺)例如以MgCl₂形式加入到样品(即包含抗体的样品)中。文中，术语“氯化镁”或“MgCl₂”是指具有式MgCl₂的化学化合物以及其各种水合物MgCl₂(H₂O)_x(即，MgCl₂·xH₂O)。例如，在本文提供的方法的步骤(a)中，可以将MgCl₂六水合物(即，MgCl₂·6H₂O)加入到样品中。举例说明性的实施例证明，在步骤(a)中加入镁离子至终浓度10-100mM>2+显著降低了LER效应。而且，实施例还表明，两倍于样品缓冲液浓度的Mg²⁺浓度导致最好的内毒素回收率。例如，当使用利妥昔单抗作为样品时，当在步骤(a)中加入镁盐MgCl₂使得Mg²⁺的终浓度是柠檬酸钠浓度的两倍(即，50mMMg²⁺)时，获得最好的内毒素回收率。因此，设想在本文提供的方法的步骤(a)中加入盐形式的镁离子(例如MgCl₂)以使得最终Mg²⁺浓度为缓冲液(例如柠檬酸钠缓冲液)浓度的两倍。例如，在本文提供的方法中，优选将镁离子加入到样品中，使得Mg²⁺的终浓度[在步骤(a)中]为10-100mM>2+，更优选25-75mM>2+，甚至更优选40-75mM>2+，最优选约50mM>2+(即45-55mM>2+)。或者，如果样品已经包含镁离子，则调整Mg²⁺的加入量以使所得的Mg²⁺终浓度[在步骤(a)中]优选为10-100mM，更优选为25-75mM，甚至更优选为40-75mM，最优选为约50mM>2+(即45-55mMMg²⁺)。在步骤(a)之后，即在步骤(b)中，稀释样品。然而，在步骤(a)中，术语“加入镁离子至......的浓度”或其语法变化以及术语“加入镁离子至......的终浓度”或其语法变化指的是，在步骤(a)中的Mg²⁺终浓度。例如，在步骤(a)中加入MgCl₂至45-55mM>2的(终)浓度意味着，在步骤(a)中加入MgCl₂后，MgCl₂的浓度为45-55mM。因此，如果例如在步骤(b)中以1：10的比率(样品：缓冲液/水)稀释样品，镁离子的浓度以及同样地MgCl₂的浓度是4.5-5.5mM。

实施例证明，加入镁离子后的孵育步骤进一步改善了LAL测定试验中的回收率。因此，在本文提供的方法中，加入镁离子之后，优选将样品孵育30分钟至6小时，更优选1至4小时，最优选约1小时。在本文提供的方法的步骤(a)的一个优选方面，加入镁离子后，将样品在室温孵育约1小时。在所述孵育步骤之前和之后，可以振荡样品[例如，在HeidolphMultiReax摇床中，高速(2,037rpm)]。例如，孵育步骤之前和之后，样品可振荡30秒至10分钟，优选1分钟。

在本文提供的样品制备方法或内毒素测定方法的步骤(b)中，稀释样品(即包含抗体的样品)。样品可以用无内毒素的水稀释。实施例证实，如果透析期间样品具有pH值5.7-8.0，则可以获得良好的回收率。如果透析期间样品具有pH值6.0-8.0，则获得甚至更好的回收率。如果透析期间样品具有pH值6.5-7.5，则获得最好的回收率。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法，其中在步骤(b)中，样品用无内毒素的水稀释，并且其中在稀释之后和透析之前，将样品的pH值调整至5.7-8.0，更优选6.0-8.0，最优选6.5-7.5。因此，在本发明的一个方面，在本文提供的方法的步骤(b)中，将样品的pH值调整至pH 5.7-8.0，更优选调整至pH 6.0-8.0。最优选地，在本文提供的方法的步骤(b)中，将样品的pH值调整至pH6.5-7.5。例如，可将样品的pH值调整至pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9或pH7.0。然而，本文优选的是，在步骤(b)中通过用pH 6.0-9.0的10-50mM缓冲液(例如Tris/HCl缓冲液)、更优选用pH 6.0-8.0的10-50mM缓冲液(例如Tris/HCl缓冲液)稀释样品来调整样品的pH值。因此，设想在本文提供的方法的一个优选方面，在步骤(b)中，通过用10-50mM Tris/HCl缓冲液，pH 6.0-9.0稀释样品来调整样品的pH值。更优选地，通过用10-50mMTris/HCl缓冲液，pH 6.0-8.0稀释样品来调整样品的pH值。最优选地，通过用50mM Tris/HCl，pH～7.0稀释样品(在步骤(b)中)来调整样品的pH值。因此，在本文提供的方法中，在步骤(c)的透析期间，样品具有pH值5.7-8.0，优选6.0-8.0，更优选6.5-7.5。

如上所述，样品可以包含洗涤剂，如聚山梨醇酯80。举例说明性实施例证实，尤其是稀释包含洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)的样品可以使内毒素分子在LAL测定试验中可接近。不受理论的约束，相信将包含洗涤剂的样品稀释至近CMC浓度可以降低样品的胶束区室化(micellar compartmentalization)，并因此降低LER效应。

实施例表明1：5至1：20的稀释显著影响LAL测定试验中的回收率。因此，本发明涉及本文提供的样品制备方法和内毒素测定方法，其中在步骤(b)中，以1：5至1：20(样品：缓冲液/水)、优选1：10(样品：缓冲液/水)的比率稀释样品。在本文提供的方法中，抗体优选用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/l聚山梨醇酯80配制。因此，在本文提供的方法中，可以在步骤(b)中稀释样品，使得缓冲液的浓度降低至5-1.25mM，优选至2.5mM。另外，可以在步骤(b)中稀释样品，使得洗涤剂的浓度降低至140-35mg/l，优选至70mg/l。在实施例中，样品是具有约10mg/ml抗体浓度的抗体制剂。在本发明方法的步骤(b)中稀释这些样品以得到2-0.5mg/ml的抗体浓度。因此，在本文提供的方法中，可以在步骤(b)中稀释样品，使得抗体浓度降低至2-0.5mg/ml，优选降低至1mg/ml。在本文提供的方法中，也可以制备未稀释的对照。除了未稀释的对照不被稀释(在步骤(b)中)外，所述未稀释的对照以与待测样品相同的方式处理。文中，“缓冲液/水”是指“缓冲液或水”。

在本文提供的样品制备方法和内毒素测定方法的步骤(c)中，相对于无内毒素的水溶液透析样品。无内毒素的水溶液可以是无内毒素的水。然而，所述无内毒素的水溶液也可以是含有镁离子(例如以盐MgCl₂的形式加入)的无内毒素的水溶液。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法，其中在步骤(c)中，无内毒素的水溶液含有镁离子，例如2.5-10mM>2。

在开始透析之前，可以振荡样品[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温，高速(2037rpm)]，例如，持续30秒至10分钟，优选持续1分钟。优选步骤(c)中的透析持续1-48小时，更优选持续4-24小时，最优选持续约24小时。因此，优选在步骤(c)中透析持续约24小时。透析可以在15-30℃进行，优选在室温(即21±2℃)进行。透析后，可以振荡样品[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温，高速(2037rpm)，例如持续20分钟至1小时，优选持续(至少)20分钟。

可以通过使用旋转式透析仪(Spin Dialyzer，例如Harvard旋转式透析仪,目录号Nb.74-0314))或快速旋转式透析仪(Fast Spin Dialyzer，例如，Harvard Fast SpinDialyzer,目录号Nb.74-0412))进行透析。优选搅拌器的旋转频率是高的(特别是使用快速旋转式透析仪时)，这意味着搅拌器的频率为50至300rpm，优选200至300rpm。搅拌器优选具有20-60mm的长度和5-25mm的直径(即横截面尺寸)。更优选地，搅拌器具有约40mm的长度和约14mm的直径。搅拌器最优选是加热灭菌的(例如在250℃下4小时)磁性搅拌器，具有约40mm的长度和约14mm的直径。这种搅拌器可从OMNILAB获得。事实上通常用高频率搅拌器完成透析，因为这有益于通过透析膜的扩散。因此，使用高频率搅拌器的透析是标准的透析步骤。用于透析的容器优选具有500-5000ml、更优选1000-3000ml、最优选1500-2500ml的容积。该容器可以具有120mm的直径和240mm的高度。例如，用于透析的容器可以是2000ml的高型烧杯(例如可从德国OMNILAB获得，P/N：5013163)。使用快速旋转式透析仪是优选的，因为它具有双面积的透析膜，因此被认为适合于更有效和更快速的透析。

设想对于步骤(c)中的透析，使用具有截留分子量100Da至16kDa、优选500Da至10kDa、最优选10kDa的膜。对于步骤(c)中的透析，可以使用纤维素酯或醋酸纤维素膜。优选地，对于步骤(c)中的透析，使用醋酸纤维素膜。最优选在透析期间使用具有截断分子量10kDa的醋酸纤维素膜。

因此，在本文提供的方法的步骤(c)中，优选通过使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜进行约24小时的透析。在透析之前，可以洗涤透析膜，优选在无内毒素的水中洗涤。特别地，可以在无内毒素的水中振荡透析膜(例如，使用德国SG 20IDL GmbH的摇床或等同物，50至300rpm，优选100rpm)。例如，可以通过在无内毒素的水中振荡透析膜10分钟至3小时、优选1小时来洗涤透析膜。在该洗涤步骤之后，优选将透析膜转移到新鲜的无内毒素的水中，并再次通过振荡透析膜10分钟至3小时、优选1小时来洗涤。

透析可以在1ml小室中进行，例如，在配备有截留分子量范围500Da至10kDa(例如截留分子量10kDa)的膜(如醋酸纤维素膜)的1ml旋转式透析仪(Harvard)室中进行。在透析期间，优选换水，更优选地，换两次水。例如，可以在透析2和20小时之后或透析18和22小时之后换水。优选地，在透析2小时和4小时之后换水。

优选地，在本文提供的方法中，在步骤(c)中的透析之后，振荡样品[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温，高速(2037rpm)。优选地，在透析10分钟至1小时、更优选20分钟之后，振荡样品(即包含抗体的样品)。除振荡之外或替代振荡，可以在透析之后超声处理样品。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法，其中在步骤(c)中在透析后用超声处理样品。

将本文提供的样品制备方法与LAL测定试验组合，该组合方法有益地达到FDA对掺入到样品中的确定量CSE的定量和再现性检测的要求。优选地，本文提供的方法的LAL测定试验是如下所述的LAL测定试验。

实施例表明，加入Mg²⁺(即镁离子)具有进一步的优点，即其将内毒素保留在透析室的内部隔室中。因此，步骤(c)中的透析仅导致除去缓冲液(例如柠檬酸钠缓冲液)而不是内毒素。稀释步骤可降低洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)的浓度，从而消除洗涤剂对LAL级联的抑制。实施例证明，如果本发明方法的步骤按照以下顺序进行，则特别可再现地克服LER效应：(1)加入Mg²⁺；(2)稀释；和(3)透析。因此，步骤(1)、(2)和(3)的组合、或权利要求中的步骤(a)、(b)和(c)的组合，可再现性地克服LER效应。在上文和下文中详细描述了优选的Mg²⁺加入量、优选的稀释度和优选的透析参数。

在一个优选的方面，本发明涉及本文提供的方法用于制备包含抗体的样品，所述样品用于LAL测定试验，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子，例如以MgCl₂形式，至终浓度10-100mM、优选40-75mM、最优选45-55mM，

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液，pH6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液，pH～7.0，以1：5(样品：缓冲液)至1：20(样品：缓冲液)、优选1：10(样品：缓冲液)的比率，稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品1-48小时、优选4-24小时、最优选24小时。优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时后换水。最优选地，使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率为50至300rpm，优选200rpm。

如上所述，抗体优选是单克隆抗体。更优选地，抗体是利妥昔单抗。最优选地，在本文提供的方法中，样品是抗体样品，其用约25mM柠檬酸钠缓冲液(7.35mg/ml)和约700mg/l聚山梨醇酯80配制，并具有约6的pH值。

术语“约”和符号“～”在本文中可互换使用，其是指所提供的具体值可以在一定程度上变化。例如，“约”或“～”(例如在约/～25mM柠檬酸钠缓冲液的情况下)是指，在给定值中包括±10％、优选±5％、最优选±2％范围内的变化。

如所指出的，设想在本发明中，本文提供的样品制备方法与LAL测定试验组合。LAL测定试验具有检测低浓度的内毒素的优点。

如CSE标准曲线所给出的，在动态显色LAL技术中经验证的内毒素检测下限是0.005EU/mL。这些技术的LAL试剂包含从鲎(Limulus crab)纯化的丝氨酸蛋白酶的完整酶促扩增级联。

在最近开发的测定法(Hyglos GmbH,德国)中制造商指示的内毒素(CSE)检测的下限为0.05EU/mL(Hyglos的广告：Grallert等人在:Nature Methods,Oct.2011；p://www.hyglos.de/fileadmin/media/Application_note_EndoLISA_Nature_Methods_October_2011.pdf中)。该测定法仅采用Limulus级联初始酶(即因子C)的重组形式。与认证的LAL测定试验不同，测定法还包括通过用噬菌体编码蛋白预包被微量滴定板的初始内毒素吸附步骤，尚未证实该步骤能够结合熟知可以由LAL方法检测的广谱细菌内毒素。

具体地，在一个优选的方面，本发明涉及用于测定包含多肽的样品中的细菌内毒素的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl₂形式，至终浓度10-100mM、优选40-75mM、最优选45-55mM，

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液，pH6.0-8.0；优选用50mM Tris/HCl缓冲液，pH～7.0，以1：5(样品：缓冲液)至1：20(样品：缓冲液)、优选1：10(样品：缓冲液)的比率，稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品1-48小时、优选4-24小时、最优选24小时。优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时后换水。最优选地，使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率为50至300rpm，优选200rpm。

(d)通过使用LAL测定试验，测定样品中的细菌内毒素。

如上所述，抗体优选是单克隆抗体。更优选地，抗体是利妥昔单抗。最优选地，在本文提供的方法中，样品是抗体样品，其用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/l聚山梨醇酯80配制，并具有约6.5的pH值。

如实施例中所指出的，在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)的LAL测定试验中，可以使用“LER阳性对照”(也称为“阳性LER对照”)。所述“LER阳性对照”是指示剂，以显示如果不进行本文描述的方法的步骤(a)至(c)，则待测样品(即包含抗体的样品)将显示LER效应。或者换言之，在LAL测定试验中使用“LER阳性对照”作为阳性对照，以显示仅使用LAL测定试验(即，不进行本文提供的方法的步骤(a)至(c))不能回收已知掺入量的内毒素(在待测样品内)。在本发明的上下文中，令人惊奇地并且意想不到地发现，将CSE掺入到样品之后振荡样品45分钟至2小时、优选约60分钟至2小时、最优选约60分钟，仅能获得阳性LER效应。因此，在本发明的上下文中，通过向待测试内毒素的样品的等分试样中(例如向含有抗体的样品的等分试样中)掺入已知量的内毒素并振荡掺入样品45分钟至2小时、优选约60分钟至2小时、最优选约60分钟来制备“LER阳性对照”。因此，本发明涉及本文提供的内毒素测定方法，其进一步包括通过向样品的等分试样中掺入已知量的内毒素并振荡掺入了内毒素的样品等分试样≥60分钟(更优选地60分钟至2小时)，产生LER阳性对照。

优选地，在本文提供的测定细菌内毒素的方法中，通过向待测样品的等分试样掺入CSE至5.0EU/ml终浓度来制备“LER阳性对照”。之后，振荡掺入的等分试样[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]≥60分钟、最优选60分钟。振荡后，优选稀释掺入内毒素的等分试样至与本文提供的方法的步骤(b)中的待测样品相同的程度。优选地，用无内毒素的水稀释掺入的等分试样。稀释后，优选振荡掺入的等分试样[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]例如1分钟。

因此，“LER阳性对照”优选按照以下顺序以如下程序制备：

-向待测样品的等分试样中掺入CSE至终浓度5.0EU/ml。优选地，在1.5-5ml透明玻璃钳口平底容器中，更优选在Macherey-Nagel GmbH的螺纹口玻璃瓶(1.5ml或4ml)中制备“LER阳性对照”。

-振荡掺入的等分试样≥60分钟(更优选60分钟至2小时)、最优选60分钟。优选地，在室温(即21±2℃)高速(2037rpm)振荡掺入的等分试样。最优选在室温在Heidolph MultiReax摇床中高速(2037rpm)振荡掺入的等分试样。

-用无内毒素的水稀释掺入的等分试样。稀释掺入的等分试样至与本文提供的方法的步骤(b)中的待测样品相同的程度(即，如果在步骤(b)中以1：10的比率稀释待测样品，则也以1：10的比率稀释掺入的等分试样)。

-振荡掺入的等分试样(例如1分钟)。

如上所述，在制备“LER阳性对照”期间，进行稀释。然而，设想在本发明的上下文中，除了所述稀释之外，不按照本文提供的方法的步骤(a)至(c)所述处理“LER阳性对照”。然而，在测定细菌内毒素的方法的步骤(d)中使用所述“LER阳性对照”，以显示如果不进行本文所述的方法的步骤(a)至(c)，待测样品(即包含抗体的样品)将展示LER效应。可以在步骤(a)至(c)中的任何一个步骤的时间段中(例如在透析时间内)制备“LER阳性对照”，以备在进行LAL测定试验时使用。

为了鉴定给定物质(例如治疗性抗体的样品或缓冲液)显示LER效应，例如，可以在内毒素保持时间研究中随时间监测内毒素含量。内毒素保持时间研究需要内毒素掺入未稀释样品以及存储掺入内毒素的样品一段时间。例如，样品可以被存储多达几个月。优选地，在保持时间研究中，掺入内毒素的样品被存储几天(例如7至长达28天)，并且在规定的时间点进行LAL测定。低于掺入内毒素量的50％的回收率表明样品表现LER效应。

如上提及，常规地用稀释的待测样品以及稀释的阳性对照(PPC)一起进行LAL测定试验，所述稀释的阳性对照(PPC)是具有已知掺入量的CSE的样品。因此，在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中进行的LAL测定试验中，设想，每次以掺入对照标准内毒素(PPC)和未掺入内毒素，一式两份地测量每个样品。因此，使用每个给定的样品，可以容易地测试本文提供的样品制备方法或本文提供的内毒素测定方法是否具有以下有益的效果：即，通过使用LAL测定试验可以检测样品中存在的内毒素(或如FDA所要求的所存在的内毒素的至少50-200％)。因此，设想，本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中的LAL测定试验包括，与待测样品(即待测试的包含抗体的样品)一起测试阳性对照(PPC)。除了PPC掺入了已知量的CSE外，所述阳性对照与待测样品相同。或换言之，必须以相同的方式，对待测样品和PPC进行本文提供的方法的步骤(a)至(c)。因此，在本文提供的方法的步骤(a)之前制备PPC。

在本发明的上下文中，令人惊奇地并且意想不到地发现，只有在将CSE掺入到样品之后振荡样品45分钟至2小时、优选约60分钟至2小时、最优选约60分钟，才能获得阳性LER效应。因此，在本发明的上下文中，掺入后振荡PPC[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中高速(2037rpm)]45分钟至2小时，优选约60分钟至2小时，最优选约60分钟。更优选地，掺入后在室温下振荡PPC[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中高速(2037rpm)]约60分钟。

因此，本发明的一个优选方面涉及本文提供的方法用于测定包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a0)通过以下步骤制备PPC

-向包含抗体的样品的第一等分试样中掺入已知量的内毒素，

-振荡掺入内毒素的等分试样60分钟至2小时(优选在室温下约60分钟)，

(a)向待测样品的第二等分试样以及PPC中加入镁离子，

(b)稀释待测样品的第二等分试样以及PPC，

(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-8.0(优选5.8-7.0)的待测样品的第二等分试样以及PPC，其中待测样品以及PPC具有pH值5.7-9.0，和

(d)通过使用LAL测定试验，测定待测样品的第二等分试样以及PPC中的细菌内毒素。

在本发明的一个方面，将内毒素掺入PPC，从而得到5.0EU/ml的最终内毒素浓度。

结合本文提供的用于测定细菌内毒素的方法而公开的所有方面和定义，可以经适当变化而应用于使用PPC的所述方法。因此，本发明的一个优选方面涉及本文提供的方法用于测定包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a0)通过以下步骤制备PPC

-向包含抗体的样品的第一等分试样中掺入已知量的内毒素，和

-振荡掺入了内毒素的等分试样≥60分钟(优选在室温下60分钟)，

(a)向样品的第二等分试样中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度10-100mM，优选40-75mM，最优选45-55mM，

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：5(样品：缓冲液)至1：20(样品：缓冲液)、优选1：10(样品：缓冲液)的比率，稀释样品的第二等分试样，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品1-48小时，优选4-24小时，最优选24小时。优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时之后换水。更优选地，使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高。

(d)通过使用LAL测定试验来测定样品中的细菌内毒素。

另外，水对照可以应用于本文提供的内毒素测定方法中。优选地，使用至少两种水对照；其中一种由无内毒素的水组成，另一种是掺入已知量的内毒素的无内毒素水(例如得到终浓度5.0EU/ml的CSE)。以与待测样品相同的方式处理水对照。

如上所述，在本文提供的样品制备方法以及本文提供的内毒素测定方法中，设想，在步骤(a)中，孵育样品30分钟至6小时，优选1-4小时，最优选1小时。此外，还设想，在透析之后，振荡样品[例如，在Heidolph MultiReax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]例如10分钟至1小时，优选20分钟。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的方法用于制备用于LAL测定试验的包含抗体的样品，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度10-100mM，优选40-75mM，最优选45-55mM；并孵育样品30分钟至6小时，优选1-4小时，最优选1小时，

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：5(样品：缓冲液)至1：20(样品：缓冲液)，优选1：10(样品：缓冲液)的比率，稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品1-48小时，优选4-24小时，最优选24小时。(优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时之后换水。最优选使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高)。透析后，振荡样品10分钟至1小时，优选20分钟。

类似地，本发明的另一方面涉及本文提供的方法用于测定显示LER效应的包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度10-100mM，优选40-75mM，最优选45-55mM；并孵育样品30分钟至6小时，优选1-4小时，最优选1小时(其中在孵育之前和之后可以振荡样品)，

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：5(样品：缓冲液)至1：20(样品：缓冲液)，优选1：10(样品：缓冲液)的比率，稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品1-48小时，优选4-24小时，最优选24小时。(优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时之后换水。最优选使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高)。透析后，振荡样品10分钟至1小时，优选20分钟。

(d)通过使用LAL测定试验来测定样品中的细菌内毒素。

此外，如上所述，在本文提供的内毒素测定方法中，可以设想，制备PPC并且在掺入后振荡PPC 60分钟至2小时。因此，本发明涉及本文提供的方法用于测定显示LER效应的包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a0)通过以下步骤制备PPC

-向包含抗体的样品的第一等分试样中掺入已知量的内毒素(例如至终浓度5.0EU/ml)，和

-振荡掺入了内毒素的等分试样60分钟至2小时(优选在室温下60分钟)，

(a)向样品的第二等分试样以及PPC中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度10-100mM，优选40-75mM，最优选45-55mM；(优选孵育样品和PPC>

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：5(样品/PPC：缓冲液)至1：20(样品/PPC：缓冲液)、优选1：10(样品/PPC：缓冲液)的比率，稀释样品和PPC，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品和PPC 1-48小时，优选4-24小时，最优选24小时。(优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时之后换水。更优选地，使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高)。透析后，振荡样品和PPC 10分钟至1小时，优选20分钟。

(d)通过使用LAL测定试验来测定样品中的细菌内毒素。

另外，如上所述，可以设想，在本文提供的内毒素测定方法中，制备“LER阳性对照”，并在步骤(d)中使用该“LER阳性对照”以显示LER效应。因此，本发明的一个优选方面涉及本文提供的方法用于测定显示LER效应的包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a0)通过以下步骤制备PPC

-向包含抗体的样品的第一等分试样中掺入已知量的内毒素(例如至终浓度5.0EU/ml)，和

-振荡掺入内毒素的等分试样60分钟至2小时(优选在室温下60分钟)，

(a)向样品的第二等分试样以及PPC中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度10-100mM，优选40-75mM，最优选45-55mM；(优选孵育样品和PPC>

(b)用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-8.0、优选用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：5(样品/PPC：缓冲液)至1：20(样品/PPC：缓冲液)、优选1：10(样品/PPC：缓冲液)的比率，稀释样品和PPC，

(c)相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品和PPC 1-48小时，优选4-24小时，最优选24小时。(优选使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，并在2小时和4小时之后换水。最优选地，使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高)。透析后，振荡样品和PPC 10分钟至1小时，优选20分钟。

(d)通过使用LAL测定试验来测定样品和PPC中的细菌内毒素，其中在LAL测定试验中使用“LER阳性对照”，其通过以下步骤制备：

-向待测样品的第三等分试样中掺入CSE至终浓度5.0EU/ml；

-振荡掺入的等分试样≥60分钟，最优选60分钟；

-用无内毒素的水稀释掺入的等分试样(将掺入的等分试样稀释至与本文提供的方法的步骤(b)中待测样品相同的程度)；

-振荡掺入的等分试样(例如1分钟)。

因此，本发明的一个优选方面涉及本文提供的方法用于测定显示LER效应的包含抗体的样品中的细菌内毒素，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a0)通过以下步骤制备PPC

-向包含抗体的样品的第一等分试样中掺入已知量的内毒素至终浓度5.0EU/ml，和

-在室温下振荡掺入内毒素的等分试样约60分钟，

(a)向样品的第二等分试样以及PPC中加入镁离子(优选以MgCl₂形式)至终浓度45-55mM，振荡样品和PPC>

(b)用50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0，以1：10(样品/PPC：缓冲液)稀释样品和PPC，

(c)使用具有截留分子量10kDa的醋酸纤维素膜，相对于无内毒素的水透析具有pH值5.7-8.0(优选6.5-7.5)的样品和PPC 24小时；其中在2小时和4小时之后换水(优选使用快速旋转式透析仪并且搅拌器的频率高)，振荡样品和PPC 20分钟，和

(d)通过使用LAL测定试验来测定样品和PPC中的细菌内毒素，其中在LAL测定试验中使用“LER阳性对照”，其通过以下步骤制备：

-向待测样品的第三等分试样中掺入CSE至终浓度5.0EU/ml；

-振荡掺入的等分试样60分钟，

-用无内毒素的水以1:10的比率稀释掺入的等分试样，

-振荡掺入的等分试样(例如1分钟)。

另外，如上所述，可以设想，在LAL测定试验中应用水对照。例如，可以在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)的LAL测定试验中，应用由无内毒素的水组成的水对照。另一个水对照可以由掺入了内毒素的无内毒素水组成。内毒素掺入后，优选振荡水[例如，在Heidolph Multi Reax摇床中，高速(2037rpm)]≥60分钟(例如在室温，60分钟)。另外，在LAL测定试验中，通常根据所用试剂盒的说明书制备标准品。

步骤(a0)、(a)、(b)、(c)和(d)应按照(a0)→(a)→(b)→(c)→(d)的顺序进行。但是，可以在任何时间进行透析膜的洗涤，条件是在透析开始时进行该步骤。类似地，可以在任何时间进行LER阳性对照的制备，条件是在LAL测定试验开始时进行该步骤。在本发明的一个优选方面，本文提供的内毒素测定方法包括以下步骤。

步骤(a00)：样品的制备

·调整待测样品的浓度以适应于PPC(例如抗体900μl+100μl无内毒素的水)

·用内毒素掺入待测样品的等分试样以产生PPC(例如抗体900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml)

·制备水对照(例如无内毒素的水1000μl)

·制备另一水对照(例如无内毒素的水900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml)

·在室温振荡样品约60分钟[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，高速(2037rpm)]，

步骤(a01)：洗涤透析膜

·例如，使用10kDa醋酸纤维素(CA)膜并将其放入具有无内毒素的水的结晶皿(例如，制造商B.Braun,Melsungen的300ml蒸馏水)中

·仔细振荡1小时(摇床SG20.IDL GmbH,德国或等同产品，50至300rpm，优选100rpm)

·将膜转移到具有新鲜无内毒素水的新结晶皿中(例如，制造商B.Braun,Melsungen的300ml蒸馏水)，

·振荡(摇床SG 20.IDL GmbH,德国或等同产品，50至300rpm，优选100rpm)1小时

步骤(a)：加入25-100mM，优选50-100mM的镁离子(Mg>2+)

·向步骤(a0)的样品中加入Mg²⁺(例如以MgCl₂形式)至终浓度25-100mM，优选50-100mM(例如向步骤(a0)的样品中加入50μl 1M>2原液)

·振荡[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]2-5分钟，例如1分钟

·在室温下孵育样品45至75分钟，优选60分钟

·振荡[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]1分钟

步骤(b)：稀释

·取步骤(a)的样品之一，用缓冲液pH～7.0(例如50mM Tris/HCl缓冲液pH～7.0)以1：10稀释(例如895μl 50mM Tris缓冲液+105μl样品)

·优选制备两个稀释的样品

·例如：

o 2x抗体，以Tris缓冲液1：10稀释(样品)

o 2x抗体，以Tris缓冲液1：10稀释，掺入5.0EU/ml(PPC)

o 2x LAL水，以Tris缓冲液1：10稀释(背景)

o 2x LAL水5.0EU/ml，以Tris缓冲液1：10稀释(标准)

o LAL-水＝请加入

步骤(c)：透析

·振荡[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)，所有稀释样品1分钟

·将其转移到透析仪(优选快速旋转式透析仪)

·将每个烧杯一个透析仪放在搅拌器上

·在烧杯中注入无内毒素的水(例如制造商B.Braun,Melsungen的200ml蒸馏水)

·在室温透析24小时，在2小时和4小时后换无内毒素的水

·搅拌器的频率优选50至300rpm，更优选200rpm(特别是如果使用快速旋转式透析仪时)。搅拌器优选具有20-60mm的长度和5-25mm的直径。更优选地，搅拌器是具有约40mm长度和约14mm直径的磁性搅拌器。

步骤(d)：振荡

·透析后，将样品转移到新容器中(例如1.5ml螺口小瓶中)并振荡[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]20-60分钟

步骤(d00)：制备“LER阳性对照”和另外的水对照

1.(步骤(d00)无需一定在步骤(d)之后进行。步骤(d00)可以在任何时间进行，只要LAL测定试验开始时“LER阳性对照”和另外的水对照已准备好)。优选在透析结束前1小时制备“LER阳性对照”(即“阳性LER对照”)[例如抗体900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml]

·制备另外的水对照，例如：

1.抗体900μl+100μl LAL水

2.LAL水1000μl

·LAL水900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml

·振荡1小时[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]

·用无内毒素的水1：10稀释样品

·振荡1分钟[例如在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温，高速(2037rpm)]

步骤(e)：LAL测定试验

按照制造商的说明书，制备标准品(即在使用的LAL测定试剂盒中包含的标准品)，并开始如下测量；

(1)LAL试剂(Kinetic-QCL>TM试剂)的制备：

·每小瓶用2.6ml LAL试剂水(LAL Reagent Water)重构由马蹄蟹(鲎，Limuluspolyphemus)变形细胞制备的溶解物和显色底物的共冻干混合物，之后立即使用。

(2)CSE原液(50EU/ml，相当于标准品S1)的制备：

·在分析证书上所述的LAL试剂水的体积中重构CSE制剂(大肠杆菌O55：B5-LPS，每小瓶含有50-200EU的冻干内毒素)，所述体积经计算产生含有50EU(或IU)/ml的溶液。

·在摇床上高速用力振荡CSE原液至少15分钟。

·使用前，先将溶液升温至室温，再在摇床上高速用力振荡15分钟。

(3)CSE标准系列的制备：

·用LAL试剂水在室温下以1：10的方案稀释CSE原液/标准S1(步骤1)，得到CSE标准品完整系列(50、5、0.5、0.05和0.005EU/ml

(4)96孔微板ELISA读取形式中的LAL分析：

·向微板的适当孔中小心分配100μl的LAL试剂水空白、内毒素标准品、产品样品、阳性产品对照。

·将加液后的板放入微板读取器中，合上盖子。

·在37℃±1℃的温度，预孵育板≥10分钟。

·使用8通道多功能移液器，从第一列(A1-H1)开始，然后依次进行到使用的最后一列，将100μl Kinetic-QCL^TM试剂分配到微板的所有孔中。尽可能快地加入试剂(避免气泡)。

·立即点击电脑键盘上的OK按钮，开始测试。

(注意：Kinetic-QCL^TM测定法是在去掉微板盖的情况下进行的)

文中，“掺入”是指“加入”或“提供”。例如，“将已知量的CSE掺入样品”是指“向样品中加入已知量的CSE”或“向样品提供已知量的CSE”。

内毒素，也称为脂多糖(LPS)，是在革兰氏阴性细菌的外膜中发现的大分子，其在动物(例如，在人)中引起强烈的免疫反应。如上所述，本发明提供用于测定(即检测和定量)包含抗体的样品中的细菌内毒素的方法，其中所述方法包括本文所述的步骤(a)至(d)(优选还包括步骤(a00)、(a01)和(d00))。

在一个实施方案中，内毒素可以是大肠杆菌内毒素。因此，在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中测定(即检测和/或定量)的内毒素可以是大肠杆菌内毒素。例如，在LAL测定试验期间掺入样品中的内毒素可以是大肠杆菌内毒素(即从大肠杆菌纯化的内毒素)。优选地，内毒素是商业上可获得的大肠杆菌内毒素(例如对照标准内毒素，CSE)。

WHO国际标准内毒素(I.S.)是来自大肠杆菌O113:H10:K-的内毒素制品，其被国际公认为细菌内毒素测试的最终校准物。现行的国际标准批次被称为“内毒素WHO国际标准，第三I.S.”。

参照标准内毒素(RSE)是一种已经相对于WHO国际标准内毒素校准过的内毒素制品。RSE由国家机构(如USP、EP、JP、ChP)建立，并提供用于校准用于LAL测定试验的CSE(见下文)。

对照标准内毒素(CSE)是非RSE的内毒素制品，其已经相对于RSE进行了校准。CSE是供应商特定的高度纯化的内毒素制品，其由大肠杆菌O113：H10：K-(例如Associates ofCape Cod,Inc.)或其它大肠杆菌菌株如大肠杆菌O55：B5(例如Charles River,Lonza)产生。供应商可能会根据自己的判断加入稳定剂，如人血清白蛋白、PEG或淀粉。根据其预期用途不同，CSE以不同的浓度提供。

本文提供的用于测定(即检测和/或定量)包含抗体的样品中的内毒素的方法；或者本文提供的用于制备包含抗体的样品的方法，具有消除LAL测定试验中的LER效应的有益效果。因此，本发明的一个方面涉及本文提供的样品制备方法或本文提供的内毒素测定方法用于克服在LAL测定试验中测定细菌内毒素时的LER效应的用途。

更具体地说，本文提供的样品制备方法或本文提供的内毒素测定方法具有以下有益效果：这些方法使显示LER效应的包含抗体的样品对LAL酶促级联中的因子C具有反应性。因此，本发明的一个方面涉及，本文提供的样品制备方法或本文提供的内毒素测定方法用于使显示LER效应的包含抗体的样品对LAL酶促级联中的因子C具有反应性的用途。

在此，术语“测定”，特别是在“测定细菌内毒素”或其语法变体中，涉及内毒素的检测和/或定量，优选涉及内毒素的检测和定量。在本发明的上下文中，内毒素(例如大肠杆菌内毒素，如CSE)优选通过LAL测定试验来测定。

术语“细菌内毒素测试”(“bacterial endotoxins test”或“bacterialendotoxin test”)在本文中互换使用，涉及一组检测或定量来自革兰氏阴性细菌的内毒素的测试。BET描述药典(即与作为标准的纲要相关，如欧洲或美国药典，或其它国家或国际药物标准)LAL测定试验(鲎变形细胞溶解物测定试验)。此外，在本发明的上下文中，优选在LAL测定试验期间待测的样品的pH值为5.7-8.0，优选6.0-8.0，更优选6.5-7.5。

术语“LAL测定试验”在本领域中是公知的，其是用于人和动物肠胃外药物、生物产品和医疗装置的体外内毒素测试。具体而言，LAL测定试验是使用来自马蹄蟹(Limuluspolyphemus或Tachypleus tridentatus)的变形细胞溶解物来检测和定量来自革兰氏阴性细菌的内毒素的测试。例如，在细菌细胞繁殖、细胞分裂、营养部分萎缩(vegetationdieback)和细胞裂解期间，LPS分子以相当不受控制和非特异性的方式从细菌细胞表面释放。释放的LPS是有力的细菌毒素，并主要负责革兰氏阴性细菌严重感染的毒性表现和有害作用(例如高热、低血压和不可逆休克)(Rietschel，1994，FASEB J.8：217-225)。脂质A组分负责LPS的这种生物学活性。在稀释的盐溶液中，LPS形成大分子聚集体(胶束)。这些胶束的形成、大小和动力学与LPS浓度、各种物理化学参数(如温度、缓冲液浓度(离子强度)和pH)以及O-链(脂质A的核心-寡糖)的结构相关(Aurell,1998,Biochem.Biophys.Res.Comm.253:119-123)。LPS的脂质A部分在所有革兰氏阴性细菌中高度保守，是LAL测定试验所识别的LPS分子部分，这使得该测试成为研究来自广泛的革兰氏阴性细菌来源的内毒素污染的金标准和适宜方法(Takada(1988)Eur.J.Biochem；175:573-80)。

LAL测定试验的原理描述如下。在LAL测定试验中，通过LAL的凝胶化进行LPS的检测。这种LAL激活的LPS活性受多种因素影响：

-LPS-LPS聚集体的形成[Akama,1984,"Bacterial Endotoxin"(J.Y.Homma,S.Kanegasaki,O.Lüderitz,T.Shiba和O.Westphal编辑],Chemie出版)

-蛋白-LPS聚集体的形成，例如与人脂蛋白Apo A 1、溶菌酶、核糖核酸酶A或人IgG(Emancipator,1992,Infect Immun.60:596-601；Petsch,1998,Anal.Biochem.259:42-47)

-从细菌细胞提取LPS的方法[Galanos,1984,"Bacterial Endotoxin"(J.Y.Homma,S.Kanegasaki,O.Lüderitz,T.Shiba和O.Westphal编辑),Chemie出版]

-细菌物种；在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)内LAL激活活性有1000倍的变化[Niwa,1984,"Bacterial Endotoxin"(J.Y.Homma,S.Kanegasaki,O.Lüderitz,T.Shiba和O.Westphal编辑),Chemie出版]。

LAL测定试验在美国(US)、欧洲(EP)和日本(JP)的药典之间是一致的。在一致的药典章节(USP<85>,Ph.Eur.2.6.14.和JP 4.01)中，描述了用于LAL测定试验的三种技术：

-凝胶技术(基于内毒素诱导的胶凝)

-浊度技术(基于胶凝诱导的浊度)

-显色技术(基于合成肽-发色团复合物分解后的着色)。

这三种技术又用于6种不同的方法中：

方法A：凝胶方法，极限测试

方法B：凝胶方法，半定量测试

方法C：动态浊度方法

方法D：动态显色方法

方法E：显色终点方法

方法F：浊度终点方法

根据Ph.Eur./USP/JP，这六种方法被视为等同。

本发明的一个优选方面涉及本文提供的样品制备方法和本文提供的内毒素测定方法，其中动态显色方法或动态浊度方法用于测定样品中的细菌内毒素。最优选地，在本文提供的样品制备方法和内毒素测定方法中使用动态显色方法。通过使用这种技术，可以通过光度测定检测内毒素。该技术是这样的测定试验，其中测量通过内毒素与LAL反应而从显色底物(即合适的显色肽)释放的发色团。动态显色测定法可以是这样一种方法，其中测量达到反应混合物的预定吸光度所需的时间(起效时间)或显色速率。在溶解物制造商推荐的孵育温度(通常为37±1℃)下进行测试。例如，为了进行动态显色LAL测定试验，可以将样品与包含LAL和显色底物(即合适的显色肽如Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA)的试剂混合，并置于孵育的板读取器中。然后，随着时间监测样品出现的颜色(例如黄色)。颜色出现之前所需的时间(反应时间)与存在的内毒素的量成反比。即在大量内毒素存在时反应迅速发生；在存在较少量内毒素时反应时间增加。可由标准曲线计算未知样品中内毒素的浓度。在LAL测定试验期间，即在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中，内毒素的定量优选通过标准校准曲线进行，所述标准校准曲线覆盖至少两个数量级的范围(在本发明的一个方面，0.005、0.05、0.5、5.0和50.0EU/ml)。

例如，在动态显色LAL技术期间，可发生以下反应。革兰氏阴性细菌内毒素催化LAL中酶原的活化。初始活化速度由存在的内毒素浓度决定。活化的酶催化对硝基苯胺(pNA)从无色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA分离。在整个孵育期间在405nm处连续光度测量释放的pNA。通过与含有已知量的内毒素标准品的溶液的反应时间比较，从反应时间计算样品中的内毒素浓度。对于LAL测定试验，可以根据制造商的说明使用来自LONZA的试剂盒“LimulusAmoebocyte Lysate(LAL)Kinetic-QCL^TM”(目录号:50-650U、50-650NV、50-650H；K50-643L、K50-643U)。在进行LAL测定试验时，可以考虑使用包含在所使用的试剂盒中的内毒素(例如大肠杆菌O55：B5内毒素，其包含在来自LONZA的试剂盒“Limulus>TM”(目录号:50-650U、50-650NV、50-650H；K50-643L、K50-643U)中)。

在本发明的上下文中，优选在LAL测定试验期间待测样品的pH值为5.7-9.0。更优选地，在LAL测定试验期间待测样品的pH值为5.8-8.0，甚至更优选pH 5.8-7.5，甚至更优选pH 5.8-7.0。最优选地，在LAL测定试验期间待测样品的pH值为5.8-7.0。例如，在LAL测定试验期间待测样品的pH值可以是pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9或pH 7.0。因此，可以设想在本发明的上下文中，在LAL测定试验之前，将待测溶液(即溶解的固体样品或液体样品)的pH值调整至pH5.7-8.0之间，更优选调整至pH5.8至pH 7.0之间。如果需要，例如通过稀释、加入缓冲液和/或中和，调整pH值。

一些物质(如β-葡聚糖)在一定程度上干扰LAL测试(明显的例外是水样品)。干扰可以抑制或增强LAL测定试验。特别地，干扰因素可以增强或减弱从LAL测试获得的LPS定量，并因此增强或减弱内毒素的定量。因此，如果在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中PPC的回收不在50-200％的可接受范围内，则必须消除干扰因素。这可以通过在本文提供的方法的步骤(b)中的样品稀释来完成。特别地，样品可以用无内毒素的水或无内毒素的缓冲液(优选用Tris/HCl缓冲液，pH～7.0)稀释。没有抑制/增强的最低样品稀释度(最高产品浓度)称为“非干扰浓度(NIC)”。但是，在样品稀释期间，不得超过MVD(最大有效稀释度＝可以测定内毒素限的样品最大可能稀释度)。特别地，根据不同批次的测试结果，选择覆盖所有批次的样品稀释度(经验证的样品稀释度或样品浓度)。或换言之，在本文提供的方法的步骤(b)中选择在PPC中导致50-200％回收的样品稀释度。为了确立所选择的处理可以有效地消除干扰而不丧失内毒素(即，不显示LER效应)，可以通过使用掺入确定浓度的内毒素的样品(即PPC)来进行“干扰因子测试”。

因此，本发明的一个方面涉及本文提供的内毒素测定方法，其中制备PPC并在本文提供的内毒素测定方法的步骤(d)中测试内毒素。如果掺入内毒素的对照标准的回收达到50-200％，则样品不含干扰因素。

由于根据USP/Ph.Eur./JP的BET包括允许单独评估每个测试结果的内部对照(PPC)，根据USP/Ph.Eur./JP的BET方法验证不是正确内毒素结果的先决条件。

术语“低内毒素回收(LER)”或“LER效应”在本领域中是已知的，其描述由聚山梨酸酯加上柠檬酸盐或磷酸盐的组合特异地引起的内毒素屏蔽(Chen,J.and Williams,K.L.,PDA Letter 10,2013,14-16)。内毒素屏蔽也可以由任何其它缓冲液组分或其组合引起。为了鉴定给定物质(例如缓冲液或治疗性抗体样品)显示LER效应，可以随时间监测内毒素含量，例如，在内毒素保持时间研究中。内毒素保持时间研究需要内毒素掺入未稀释的样品，并随着时间存储掺入内毒素的样品。例如，样本可以存储多达几天。优选地，在保持时间研究中，掺入内毒素的样品被存储几天(例如7至长达28天)，并且在规定的时间点进行LAL测定试验。回收率低于掺入的内毒素的量的50％表明样品显示LER效应。如果内毒素回收低于50％，但只发生在任何中间的时间点而不在结束时间点发生，则不能认为测试样品显示屏蔽效应。

在过去的几年期间，FDA已经认识到了LER现象并发布了指导(参见Hughes,P.,等人,BioPharm.Asia March/April 2015,14-25)。这些指导定义了，一旦之前将确定量的CSE掺入到未稀释的样品中，药物样本中内毒素回收的可接受限在50和200％之间(例如5.0EU/ml＝100％)。如果待测试样品显示LER效应，则掺入内毒素的回收率低于掺入内毒素总量的50％。

在本文提供的本发明方法中，样品包含抗体，优选单克隆抗体。本文中术语“样品”、“待测样品”、“包含抗体的样品”和“待测试的包含抗体的样品”可以互换使用，指的是待测试内毒素的存在和/或量的包含抗体的一定量的液体。或换句话说，术语“样品”、“待测样品”、“包含抗体的样品”和“待测试的包含抗体的样品”在本文中互换使用，涉及待测试内毒素的存在和/或量(优选存在和量)的液体，其中所述液体包含抗体。所述“待测试的包含抗体的样品”优选是治疗性抗体的样品。术语“治疗性抗体”涉及旨在用于人的任何抗体制品。抗体(例如治疗性抗体)优选用聚山梨醇酯80或柠檬酸钠缓冲液配制，更优选用聚山梨醇酯80和柠檬酸钠缓冲液配制。最优选地，抗体用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/L聚山梨醇酯80配制，并具有约6.5的pH值。在本发明的上下文中，优选所述抗体(例如治疗性抗体)是单克隆抗体。最优选地，所述抗体(例如治疗性抗体)是抗CD20抗体利妥昔单抗。因此，在本发明的上下文中，样品可以是的样品。设想在本发明的上下文中，待测样品(即待测试的包含抗体的样品)表明/显示LER效应。

在此，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且尤其包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示期望的生物学活性。还包括人抗体、人源化抗体、驼源化抗体或CDR嫁接抗体。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，除了以少量存在的可能天然发生的突变之外，抗体群的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高特异性的、针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以不被其它抗体污染地合成。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，包含在本发明方法的样品中的单克隆抗体可以通过首先由Kohler,G.等人,Nature 256(1975)495描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。

本文所述的单克隆抗体优选通过在宿主细胞、最优选中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达产生。为了生产，将编码抗体(编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链))的分离的核酸插入一个或多个载体(例如表达载体)。将这些载体引入宿主细胞。宿主细胞包含(例如已经转化了)：(1)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。宿主细胞可以是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。

为了重组生产抗体，分离(例如如上所述的)编码抗体的核酸，并将其插入到一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以容易地分离并使用常规步骤(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)测序。

用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(也参见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以从细菌细胞糊以可溶性级分分离抗体，并可以进一步纯化。

除原核生物以外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；and Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用悬浮生长适应化的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或例如Graham,F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(TM4细胞，例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，例如Mather,J.P.等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA>

“抗体片段”包含完整抗体的一部分。术语“抗体片段”包括保留结合抗原(如CD20)的能力的抗原结合部分，即“抗原结合位点”(例如片段、子序列、互补决定区(CDR))，其包含或可选地由以下组成：例如(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward；1989；Nature 341；544-546)和(vi)分离的互补决定区(CDR)。抗体片段或衍生物还包含F(ab')2、Fv或scFv片段或单链抗体。

优选地，在本文提供的方法中，抗体(即包含在样品中的抗体)是利妥昔单抗。

术语“利妥昔单抗”(商品名)涉及针对蛋白CD20的嵌合单克隆抗体。在癌性和正常B细胞表面发现CD20。利妥昔单抗破坏B细胞并因此用于例如治疗以过量的B细胞、过度活跃的B细胞或功能失调的B细胞为特征的疾病。这包括许多淋巴瘤、白血病、移植排斥和自身免疫性疾病。例如，利妥昔单抗作为皮下制剂用于慢性淋巴细胞性白血病。然而，利妥昔单抗通常通过静脉输注施用。骨髓中的干细胞不具有CD20蛋白，从而允许在利妥昔单抗治疗后恢复B细胞群体。如本文所用，术语“利妥昔单抗”还涵盖符合国家或地区上市许可要求的所有抗CD20抗体或抗CD20抗体片段，所述国家或地区选自美国、欧洲和日本。最优选地，术语“利妥昔单抗”是指具有分别如SEQ ID NO：1和2所示的重链和轻链氨基酸序列的抗体。本领域技术人员很容易知道如何从给定的氨基酸序列获得编码的核酸序列。因此，根据SEQ ID NO：1和2的知识，可以容易地获得利妥昔单抗的编码核酸序列。

商品名是指含有作为活性成分的依泊汀β(epoetinbeta)的药物制剂。依泊汀β是天然存在的激素促红细胞生成素的合成版本。促红细胞生成素由健康的肾脏产生，刺激骨髓产生红细胞，所述红细胞环绕身体携带氧气。依泊汀β还用于治疗正在进行化疗的某些类型癌症患者的症状性贫血。化疗的副作用之一是与癌细胞一起杀死健康的血细胞。注射依泊汀可以增加红细胞的生成，并有助于缓解贫血症状。因为依泊汀增加血细胞的产生，可以从接受依泊汀的人采集更大量的血液，并且可以存储该血液用于在手术期间或之后的输血。

在本文提供的样品制备或内毒素测定方法的步骤(d)中，相对于无内毒素的水溶液透析样品(即包含抗体的样品)，其中样品具有pH 5.7至pH 8.0之间的pH值(优选在pH6.0至8.0之间，更优选在6.5至7.5之间)。在生物化学中，透析是基于分子通过半透膜(如透析管)的扩散速率差异、在溶液中分离分子的常用方法。透析是一种常用的实验室技术，其运作原理与医疗透析相同。在生命科学研究中，透析最常见的应用是自较大的大分子如抗体中去除不需要的小分子，如盐、还原剂或染料。透析也常用于缓冲液交换和药物结合研究。

扩散是分子在溶液中的随机热运动(布朗运动)，导致分子从较高浓度区域到较低浓度区域的净移动，直到达到平衡。在透析中，样品和缓冲溶液(称为透析液)通过半透膜分开，导致差异扩散模式，从而允许在样品和透析液中分子的分离。由于膜的孔径，样品中的大分子(例如抗体)不能穿过膜，从而限制了它们从样品室的扩散。相反，小分子(例如柠檬酸钠缓冲液的组分)将自由地穿过膜扩散并在整个溶液体积中获得平衡，由此改变了这些分子在样品和透析液中的总浓度。一旦达到平衡，分子的终浓度取决于所涉及的溶液的体积，并且如果用新鲜透析液代替(或交换)平衡后的透析液(参见下文的步骤)，则扩散将进一步降低样本中小分子的浓度。

例如，可以使用以下透析步骤用于从样品(即，从包含抗体的样品)中去除柠檬酸钠缓冲液：

1.获得并洗涤具有截留分子量10kDa的膜

2.将样品加载入透析管、盒或装置

3.将样品放入具有透析液的外部室(搅拌缓冲液)

4.在室温下透析24小时；在所述24小时期间换水两次

通过使用适当体积的透析液和多次交换缓冲液，可以降低样品中柠檬酸钠缓冲液的浓度至可忽略的水平(即原始含量的1-2％)。

通过参照以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。在附图以及实施例中，所描述的大部分实验通过规定的数字表示。例如，名称[利妥昔单抗117]是指用配制的利妥昔单抗和/或配制的利妥昔单抗安慰剂进行实验，并且该实验具有参考号“117”。

附图说明

图1使用12-16kDa的MWCO对含有磷酸盐和聚山梨醇酯20的透析的时间依赖性。显示室温下所示透析时间后获得的内部透析液的重量(冻干并称重)。灰色条顶部的数据显示2次测量的平均量(％)。

图2使用在透析之前用或不用(w/o)牛血清白蛋白(BSA)处理的12-16kDa的MWCO膜，对含有磷酸盐和聚山梨醇酯20的进行透析。显示在所示时间之后获得的内部透析液中的磷酸盐(P)含量。左侧条显示在透析之前用0.2％BSA处理膜时的P量。右侧条对应于没有BSA处理的P量。根据Strominger(1959,J.Biol.Chem.234:3263-3267)进行从内部透析液回收的磷酸盐的光度测定。

图3：[利妥昔单抗115]和[利妥昔单抗117]通过使用(A)利妥昔单抗和(B)利妥昔单抗安慰剂作为样品，进行实施例2.1中描述的克服LER效应的方案获得的回收率(％)。在图中，“快速旋转”和“慢速旋转”是指搅拌器的频率(即“快速旋转”是指搅拌器的频率高)。该示例性方案也可用于其它样品的常规质量控制，优选用于含有柠檬酸钠缓冲液和聚山梨醇酯80作为洗涤剂的样本的质量控制。

图4：用于克服LER效应的修改方案的示意图以及通过进行所述方案获得的回收率。(A)根据本发明用于克服LER效应(例如在利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂中)的方案的示意图。详细的方案在实施例2.2中描述。该示例性方案也可用于其它样品的常规质量控制，优选用于含有柠檬酸钠缓冲液和聚山梨醇酯80作为洗涤剂的样本。(B)[利妥昔单抗046]进行根据图4(A)的方案后通过LER测定法获得的利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂的回收率(％)。有关更多详细信息，请参阅实施例2.2中描述的方案。

图5：[利妥昔单抗059]使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例2所述的方案获得的回收率(％)。

图6：使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例3所述的方案获得的回收率(％)。通过进行如参照实施例2.2所述的方案获得的回收率[利妥昔单抗061]。

图7：使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例4所述的方案获得的回收率(％)。(A)通过进行如参照实施例3.1中所述的方案获得的回收率[利妥昔单抗062]。(B)通过进行如参照实施例3.2中所述的方案获得的回收率[利妥昔单抗063]。

图8：使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例5中所述的方案获得的回收率(％)。(A)通过进行如参照实施例4.1中所述的方案获得的回收率[利妥昔单抗064]。(B)通过进行如参照实施例4.2中所述的方案获得的回收率[利妥昔单抗065]。

图9：使用利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂作为样品进行如参照实施例6中所述的方案获得的回收率(％)[利妥昔单抗072]。

图10：使用利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂作为样品进行如参照实施例7中所述的方案获得的回收率(％)。(A)[利妥昔单抗079]不孵育；(B)[利妥昔单抗080]孵育4小时；(C)[利妥昔单抗081]孵育1天；(D)[利妥昔单抗082]孵育3天。

图11：使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例8中所述的LAL测定试验获得的回收率(％)。(A)[利妥昔单抗002]具有不同稀释度的LAL测定试验；(B)[利妥昔单抗004]Lonza和ACC CSE掺入的比较；(C)[利妥昔单抗005]具有不同稀释度和pH调整的LAL测定试验。

图12：使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例8中所述的LAL测定试验获得的回收率(％)。单独的透析和稀释不能克服LER效应[利妥昔单抗011]。

图13：LER效应的时间依赖性。该图显示了使用利妥昔单抗作为样品进行如参照实施例1中所述的掺入和LAL测定试验获得的回收率(％)[利妥昔单抗027]。显示了掺入后的振荡时间(即2秒至60分钟)。

图14：缓冲液系统对LER效应的重要性。显示了进行如参照实施例10中所述的LAL测定试验获得的回收率(％)。(A)当使用利妥昔单抗或柠檬酸钠作为样品并以1:2、1:5、1:10或1:20的比率稀释时的LAL测定试验[利妥昔单抗006]；(B)当使用柠檬酸钠；聚山梨醇酯80或柠檬酸钠和聚山梨醇酯80作为样品，并以1:2、1:5或1:10的比率稀释时的LAL测定试验[利妥昔单抗029]。

图15：MgCl₂对LER效应的影响。显示了进行如参照实施例13中所述的LAL测定试验获得的回收率(％)。(A)加入MgCl₂至10mM的浓度[利妥昔单抗030]；(B)加入MgCl₂至50mM的浓度[利妥昔单抗031]；(C)加入MgCl₂至25mM的浓度[利妥昔单抗032]；(D)加入MgCl₂至75mM的浓度[利妥昔单抗033]。

图16：机械处理对LER效应的影响。显示了进行如参照实施例14中所述的LAL测定试验获得的回收率(％)[利妥昔单抗034]。在图中，“振荡”是指振荡60分钟。

提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解的是，在不背离本发明精神的情况下，可以对所述步骤进行修改。

实施例1：技术设备和试剂

1.技术设备

1.1微板读取系统(文中也称为“读取器”)

· PRO，多模式微板读取器；瑞士Tecan/Tecan DeutschlandGmbH，德国，P/N：30050303。

·Magellan V.7.1软件

·Costar^TM细胞培养板，96孔，Fisher>

1.2摇床系统和玻璃小瓶

·Multi Reax；Heidolph,德国，P/N：545-10000-00。

·1.5ml螺纹口玻璃瓶(N8)；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG，德国，P/N：702004(Qty.100)。

·N 8PP螺帽，黑色，顶部封闭；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG，德国，P/N：70250(Qty.100)。

·4ml螺纹口玻璃瓶(N13)；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG，德国，P/N：702962(Qty.100)。

·N 13PP螺帽，黑色，顶部封闭；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG，德国，P/N：702051(Qty.100)。

1.3透析设备

·旋转式透析仪^TM，室体积1000μl；Harvard>

该透析仪是用于透析生物样品的简单的单侧装置。可获得宽范围的透析仪尺寸来容纳20μl到5ml的样品体积。对于1ml(如本文所用),目录Nb是74-0314。膜的MWCO范围从100至300,000Da。整个单元由PTFE制成，PTFE是一种几乎不反应的材料。

·快速旋转式透析仪，室体积1000μl，Harvard Apparatus,U.S.A.,P/N740510(Qty.1)或740504(Qty.5)。备注：双侧膜系统，顶部加底部膜。

该透析仪是由PTFE制成的可重复使用的样品室，用于高样品回收，并且经过了重新设计以提供更大的膜表面积用于甚至更快的透析速率。该超快速透析仪(Ultra-FastDialyzers)的体积为50μl至1500μl，文中使用1000μl。对于1ml(如本文所用)，目录Nb.是74-0412。

·醋酸纤维素膜，500Da MWCO，Harvard Apparatus，U.S.A.，P/N：SP1 7425-CA500，当地经销商：Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH,德国,P/N:SP17425-CA500。

·醋酸纤维素膜，10kDa MWCO，Harvard Apparatus,U.S.A.,P/N:SP1 7425-CA10K，当地经销商：Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH,德国,P/N:SP17425-CA10K。

备注：在利妥昔单抗的LER研究中以及在的LER实验中，除了“标准”500Da MWCO膜之外，还进行了该膜的测试。

·醋酸纤维素膜，25kDa MWCO，Harvard Apparatus,U.S.A.,P/N:SP17425-CA25K，当地经销商：Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH,德国,P/N:SP1 7425-CA25K。

备注：在利妥昔单抗的LER研究中以及在的LER实验中，除了“标准”500Da MWCO膜之外，还进行了该膜的测试。

·Aqua B.Braun，无菌无致热源水，1l，B.Braun Melsungen AG，德国，P/N：14090586。

·结晶皿，900ml，OMNILAB，德国，P/N：5144008。

(备注：用于漂洗透析膜)

·烧杯，高型，2000ml，OMNILAB,德国，P/N：5013163。

·烧杯，高型，250ml，OMNILAB,德国，P/N：5013136。

1.4常规实验室设备

·高压灭菌系统(备注：用于透析室消毒)

· LoRetention-Reloads，PCR清洁级别，0.5-10μl，Eppendorf，德国，P/N：0030072.057

· LoRetention-Reloads，PCR清洁级别，2-200μl，Eppendorf，德国，P/N：0030072.022

· LoRetention-Reloads，PCR清洁级别，50-1000μl，Eppendorf，德国，P/N：0030072.030

·单个的，5ml，Paper/Plastic Wrap,Fisher Scientific,P/N：10420201。

2.试剂

2.1动态显色LAL测定试验和LAL相关试剂

·Kinetic-QCL^TM试剂盒；Lonza，瑞士，P/N：50-650U或50-650H(即“Lonza试剂盒”)。

·CHROMO-LAL von Associates of Cape Cod(AAC)Inc.,美国,P/N：C0031-5(即“ACC试剂盒”)。

·用于K-QCL的内毒素大肠杆菌O55:B5；Lonza，瑞士，P/N：E50-643。

·内毒素大肠杆菌O55:B5，2.5mg/小瓶；Lonza，瑞士，P/N：N185。

·LAL试剂水–100ml；Lonza，瑞士，P/N：W50-100。

·MgCl₂，10mM溶液用于与LAL一起使用，30ml小瓶；Lonza，瑞士，P/N：S50-641。

·氯化镁六水合物用于分析ISO，Reag.Ph.Eur.,250g；Merck,德国,P/N:1.05833.0250。

·Tris缓冲液，50mM溶液用于与LAL一起使用，30ml小瓶；Lonza，瑞士，P/N：S50-642。

2.2蛋白试剂

·白蛋白牛级分V，极低的内毒素，无脂肪酸，25g；Serva,德国,P/N:47299.04。

·白蛋白,人血清,级分V，高纯度；1g；Merck，德国，P/N:126658-1GM。

3.测试的药物

对于本文所述的实施例，使用利妥昔单抗(其包含)和(其包含依泊汀-β)。另外，利妥昔单抗和各自的安慰剂也用于本文所述的方法中。

除了不存在活性治疗成分之外，各样品的安慰剂与样品相同，即利妥昔单抗安慰剂不含利妥昔单抗，但是含有制剂的所有其它组分。

实施例2：本发明克服LER效应的方法

实施例2.1：克服LER效应的方案

在本实施例中，使用利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂作为样品。然而，如下所述，本文所述的方案可用于所有药物抗体典型制剂中克服LER。

用于本实施例的材料

-膜：

·10kDa醋酸纤维素(CA)膜，来自Harvard Apparatus,美国,P/N:SP1 7425-CA10K

-透析仪：

·FastSpin DIALYZER，室体积1000μl，Harvard Apparatus,美国,P/N 740510(Qty.1)或740504(Qty.5)

-样品小瓶：

·1.5ml螺纹口玻璃瓶(N8)；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG,德国,P/N:702004

·N 8PP螺帽，黑色，顶部封闭；Macherey-Nagel GmbH&Co.KG,德国,P/N:70250

-结晶皿：

·900ml，Duran，VWR德国,P/N:216-1817

-MgCl₂-原液：

·溶于水的1M MgCl2(氯化镁六水合物，用于分析 ACS,ISO,Reag.Ph.Eur.,250g；Merck,德国,P/N:1.05833.0250)

-Tris-缓冲液，50mM溶液用于与LAL一起使用(即，无内毒素)，30ml小瓶；Lonza，瑞士，P/N：S50-642

-样品：

·利妥昔单抗安慰剂和LAL水

逐步实施的方案：

步骤1：制备样品

·1x利妥昔单抗安慰剂900μl+100μl LAL水

·1x利妥昔单抗安慰剂900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml

·1x LAL水1000μl

·1x LAL水900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml

·在RT(室温)下振荡样品60分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，高速(2037rpm)]，

步骤2：洗涤透析膜

·使用10个10kDa的醋酸纤维素(CA)膜并将其放入具有300ml Aqua Braun(即制造商B.Braun，Melsungen的蒸馏水)的结晶皿中，

·振荡其1小时(摇床SG 20，IDL GmbH,德国，或等同物，50至300rpm，优选100rpm)

·将膜转移到具有新鲜Aqua Braun(也是300ml)的新结晶皿中，

·振荡其1小时(摇床SG 20，IDL GmbH,德国，或等同物，50至300rpm，优选100rpm)

步骤3：加入MgCl>

·向步骤1的样品中加入50μl的1M>2原液

·振荡其1分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]

·在室温下孵育样品60分钟

·振荡其1分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]

步骤4：稀释

·取步骤3的样品之一，用pH～7的缓冲液(即50mM Tris/HCl缓冲液pH～7)以1:10稀释，

o 895μl 50mM Tris缓冲液+105μl样品

·进行两次以重复测定(即在一式两份中测定)：

o 2x利妥昔单抗安慰剂,与Tris缓冲液1:10

o 2x利妥昔单抗安慰剂5.0EU/ml,与Tris缓冲液1:10

o 2x LAL水,与Tris缓冲液1:10

o 2x LAL水5.0EU/ml,与Tris缓冲液1:10

步骤5：透析

·振荡所有稀释的样品1分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]，

·转移到快速旋转式透析仪中

·每个烧杯(即烧杯，高型，2000ml，OMNILAB，德国，P/N：5013163)一个透析仪，放在磁性搅拌器板上。调整搅拌器的频率至高频(即“快速旋转”)。搅拌器的高频率是指50-300rpm，优选200-300rpm。搅拌器是加热灭菌(250℃，4小时)的磁性搅拌器，具有约40mm的长度和约14mm的直径。

·向烧杯中注入200ml Aqua Braun

·在室温(21±2℃)，透析24小时，在2小时和4小时之后换Aqua Braun

·透析后，将样品转移到新的1.5ml螺口小瓶中

步骤6：振荡

·振荡样品20分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]

步骤7：制备LER阳性对照(即阳性LER对照)和另外的水对照

·在透析结束前1小时制备LER阳性对照

1.利妥昔单抗安慰剂900μl+100μl LAL水

2.利妥昔单抗安慰剂900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml

3.LAL水1000μl

4.LAL水900μl+100μl CSE浓度50EU/ml＝终浓度5.0EU/ml

·振荡1小时[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]

·用LAL水以1:10(样品:LAL水)稀释样品

·振荡[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]1分钟

步骤8：LAL测定试验

·按照制造商(Kinetic-QCL^TM测定法；Lonza)的说明书制备标准品并开始LAL测定试验。

结果与讨论

如在图3(A)(即[利妥昔单抗117])和3(B)(即[利妥昔单抗115])中可以看出，上述方法能够克服LER效应。此外，通过使用这种方法，可以在利妥昔单抗以及利妥昔单抗安慰剂中克服LER效应。这表明上述方案不依赖于包含特定单克隆抗体的制剂，而是可以用于在包含聚山梨醇酯80和螯合缓冲液(例如柠檬酸钠)的每种制剂中消除LER效应。该制剂对于抗体，特别是单克隆抗体是典型的。因此，预期上述方法可用于克服每种抗体制剂中的LER效应。

已经发现，Mg²⁺是在含有螯合缓冲液(如柠檬酸钠)和显示LER效应的制剂中恢复LAL反应性的二价阳离子选择。

为了去除螯合缓冲液(例如柠檬酸钠缓冲液)，第二步(在加入Mg²⁺之后)进行透析。Harvard的旋转式透析仪^TM是透析的优选设备。

洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)是LER效应的第二个原因。通常，在达到洗涤剂的临界胶束浓度(CMC)(通常在μM范围内)的情况下，生物样品中洗涤剂(例如聚山梨醇酯80)的存在导致胶束形成。胶束可以抑制LPS介导的因子C(一种丝氨酸蛋白酶，其是LAL级联反应中第一个酶)的激活(Nakamura(1988a)J.Biochem.103:370-374)。在单克隆抗体制品中，未稀释的样品通常高于CMC以获得抗体的功能性溶解。在文中研究的产品中，洗涤剂的CMC确实超过它们的CMC(聚山梨醇酯80：700mg/l(50倍过量))，导致推测聚山梨醇酯80以胶束形式存在。在上述方案中，通过稀释使洗涤剂的浓度降低，使得洗涤剂的浓度接近/降至低于CMC值(聚山梨醇酯80：14mg/l或10.6μM)。将洗涤剂稀释至接近CMC浓度可以消除胶束的隔室化，并因此使得掺入的CSE分子可被LAL酶接近。

因此，现在可以认为LER效应问题(例如在柠檬酸钠和聚山梨醇酯80用于配制药品的情况下)被解决了。总而言之，本文提供了用于药品的安全、稳定和可再现的测试方法。

总之，在利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂中，上述方案令人惊奇地克服了LER效应。相反，相同的方案对(其不包含抗体但是包含依泊汀-β)不能揭示令人满意的结果，表明本文提供的方法对于抗体制剂特别有用，优选用于具有单克隆抗体、柠檬酸盐缓冲液和聚山梨醇酯80的制剂。

实施例2.2：修改的方案(1)用于克服LER效应

在这个实施例中，使用了克服LER效应的修改方案。与实施例2.1相比，最重要的变化如下：

1.在实施例2.2中，使用了旋转式透析仪。相比之下，在实施例2.1中，使用快速旋转式透析仪，其具有更高效的透析室并提高透析的效率(膜在柱体的两侧)。

2.在实施例2.2中，透析膜的MWCO是500Da。相反，在实施例2.1中，透析膜的MWCO是10kDa。

3.在实施例2.2中，用无内毒素的水以1:10稀释。相反，在实施例2.1中，用Tris-缓冲液pH～7(即Tris/HCL缓冲液pH～7)以1:10稀释。通过用无内毒素的水以1：10的比率稀释样品，将样品的pH值调整至约6.0。

4.在实施例2.2中，透析时间是4小时。相反，在实施例2.1中，透析时间是24小时。

在本实施例中，使用利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂作为样品。然而，出于与实施例2.1所讨论的相同的原因，该方案可以用于在所有典型抗体制剂中克服LER。

具体来说，实施例2.2中使用的方案详述如下。

方案概述

步骤1：“设置LER效应”(也见下面的“LER阳性对照”)：

以5EU/ml或0.5EU/ml(CSE；Lonza，大肠杆菌O055:B5)掺入利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品，并在室温下以最大速度振荡混合物60分钟[摇床：Heidolph Multi Reax，高速(2037rpm)]以获得“阳性LER效应”样品。

步骤2：加入MgCl₂：在透析之前，加入2M>2原液，使得终浓度约50mM>2；如步骤1振荡1分钟。

步骤3：1:10稀释[一个样品不稀释(未稀释)作为参照]；如步骤1振荡1分钟。

步骤4：使用500Da膜透析4小时(用0.2％BSA预孵育30分钟；任选但不是强制性的)，2小时后换水一次。将溶液从透析室转移到玻璃小瓶中，如步骤1在RT(室温，即21±2℃)下振荡20分钟。

步骤5：动态LAL-测定法测量。

详细的方案

步骤1：制备样品

·制备抗体溶液(利妥昔单抗)用于50mM>2：向1个管中注入877.5μl利妥昔单抗+97.5μl>

·未掺入的对照：877.5μl利妥昔单抗安慰剂+97.5μl水

·未掺入的水对照：975μl水(用于空白扣除)

·使用的小瓶：透明平底小开口1.5ml Macherey&Nagel,Ref.Nr.70213

·在室温下在Heidolph Multi Reax上高速(2037rpm)振荡1小时。

步骤2：加入MgCl>2至终浓度50mM>2

·原液1M>2·6H₂O：向掺入的样品以及未掺入的样品(空白)中加入50μl>2原液。

步骤3：稀释

·含有50mM>2的利妥昔单抗样品：通过加入900μl无内毒素的水(即LAL水)+100μl样品，制备1:10稀释液

·替代利妥昔单抗：稀释液1:10，用无内毒素的水(即LAL水)同样地处理水对照

步骤4：透析

·透析前振荡1分钟[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在室温下高速(2037rpm)]。

·将样品放入1ml透析仪室(Harvard旋转式透析仪)中，其中固定有MWCO 500Da的膜(可选地，用0.2％BSA预孵育30分钟)。

·在24℃，相对于1l的Aqua Braun(即无菌无致热原的水；由BBraun，Melsungen提供)透析4h；2小时后换水。交换的水已经被调整到24℃。

·将旋转式透析仪分配(取决于透析室的数量)在多个装有1升Aqua Braun的2l烧杯上，搅拌(磁性Teflon搅拌器)。

·在一个2l烧杯中至多有5个透析仪。

步骤5：制备LER阳性对照

同样在该实施例中，在LAL测定试验中使用LER阳性对照。可以在任何时间制备该LER阳性对照，只要在LAL测定试验开始时其已准备好即可。有利地，在4小时透析结束前1小时制备LER阳性对照，使得所有样品都准备好同时用于测试。为了制备LER阳性对照，使用以下方案：

·利妥昔单抗900μl+100μl CSE→终浓度CSE：5.0EU/ml。

·在RT下在Heidolph Multi Reax中高速(2037rpm)振荡1小时。只有在这些条件下，获得最大LER效应(回收率<1％)。

·平行制备下列空白：

o具有5.0EU/ml CSE的水

o具有5.0EU/ml CSE的水；1:10稀释(0.5EU/ml)。

步骤6：LAL测定试验

·所有样品制备好后开始测试。

·从所有样品，使用两份100μl的等分试样用于在板中重复测定(2x，即一式两份测定)，其中板子在Tecan Reader中在37℃孵育10分钟。

·按明确限定的顺序(根据机器的读取)向每个样品中加入100μl LAL试剂(Kinetic-QCL^TM测定法；Lonza)。

结果与讨论：

实施例2.1中描述的方案产生了最好的可再现回收率(也是相对于水对照而言)。然而，实施例2.2中描述的方案对于掺入的两种CSE浓度都产生了良好的CSE回收率，范围从50％到95％(见图4(B)[利妥昔单抗046])。因此，可以得出结论，实施例2.2中使用的方案是与实施例2.1中描述的方案的功能性等同物。

参照实施例1：LER效应的时间依赖性

在现有技术中，推定LER效应在用确定量的CSE掺入样品之后立即出现(C.Platco,2014,“Low lipopolysaccharide recovery versus low endotoxin recovery in commonbiological product matrices”.American Pharmaceutical Review,九月1日,2014,pp.1-6)。因此，首先在LPS掺入后室温下振荡样品约2-10分钟的非常短时间。然而，这种掺入证明是无效的，一些实验表明，在这么短时间的间隔(<10分钟)中物质的屏蔽效应尚未达到最大。发现掺入机制是以正确方式分析LER效应的基本过程之一(参见例如图13[利妥昔单抗027])。根据这些数据，LER效应是动态现象，其需要时间屏蔽CSE分子，例如通过渗透到制剂混合物的胶束中。因此，按照常规实践在下一步分析LER效应之前振荡2-10分钟是不合适的，因为LER效应的形成条件还没有到达，这不能被认为代表了LER效应。因此，在实验中包括了测试“阳性LER效应”(通过LAL测试达到回收率0％的情况下被定义存在)的内部标准。通过对利妥昔单抗中的LER效应进行动态研究，证实了阳性LER效应需要≥60分钟的孵育时间。

特别地，分析了需要进行多长时间振荡[在1.5ml透明玻璃钳口平底容器中、在Heidolph MultiReax摇床中、在室温(21℃±2℃)，高速(2037rpm)，最大频率(即，涡旋)]，来实现最大LER效应。因此，将利妥昔单抗样品在小瓶中掺入CSE，以获得0.5和5.0EU/ml(由Macherey-Nagel制备的小瓶，1.5ml)。在掺入后，分别振荡样品60分钟、30分钟、10分钟，5分钟或2秒。之后，通过混合900μl无内毒素的水(即LAL水)和100μl样品，制备1：10的稀释液。稀释后，再振荡样品1分钟。随后，一式两份在LAL测定试验中测试样品。具体而言，将100μl的各样品施加到板上，并在37℃在读取器中孵育10分钟。然后，向各样品中加入100μl色原并进行测量。在这个实验中，所有的溶液都具有室温。如在图13[利妥昔单抗027]中所见，如果样品以1:10的比率稀释，则与相应的未稀释样品相比LER效应较低(即回收率较高)。另外，振荡2秒后，具有5.0EU/ml内毒素的稀释样品的回收值仍然约为50％。然而，增加振荡(即涡旋)时间导致回收率不断下降(除了30分钟的值)，参见图13[利妥昔单抗027]。相比之下，未稀释的样品在2秒后已经显示出最大的LER效应。然而，稀释的样品在已振荡(即涡旋)60分钟的样品中也显示出显著的LER效应。

从这个结果得出的结论是，掺入需要时间将LPS分子屏蔽到洗涤剂胶束中。当获得约100％的屏蔽或<0.5％的CSE回收率时，“阳性LER效应”是完全的。这个过程需要在室温下振荡最少1小时[例如：摇床：Heidolph Multi Reax，高速(2037rpm)、在室温，在1.5至5ml透明玻璃钳口平底中，持续1小时]或者在4℃存储>24h的更长时间。在所有的图中，得到的“阳性LER对照”显示为图示中位于图的右侧的一个条柱。

参照实施例2：人血清白蛋白(HAS)和不同MgCl₂浓度对回收率的影响

为了确定HSA和不同MgCl₂浓度对掺入内毒素的利妥昔单抗样品回收率的影响，进行了以下实验。此外，在本实验中还分析了透析对回收率的影响。更具体地说，振荡利妥昔单抗掺入样品60分钟以获得“阳性LER效应”。在透析之前，加入10-75mM>2，随后进行稀释。使用没有BSA封闭的膜。透析后，加入或不加入0.01μg/ml>

样品在1.5ml Macherey-Nagel的螺纹口小瓶中制备。

步骤1：制备样品

·制备用于10mM>2的掺入利妥昔单抗：897μl利妥昔单抗+99.8μl>

·制备用于50mM>2的掺入利妥昔单抗：889μl利妥昔单抗+98.8μl>

·制备用于75mM>2的掺入利妥昔单抗：883μl利妥昔单抗+98.1μl>

·制备用于10mM>2的掺入水：897μl水+99.8μl>

·制备用于50mM>2的掺入水：889μl水+98.8μl>

·制备用于75mM>2的掺入水：883μl水+98.1μl>

·振荡60分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤2：加入MgCl2

·使用4M>2原液(即在0.629ml水中511.437mg>2·6H₂O)。

o对于10mM>2，向掺入样品中加入2.5μl的4M溶液。

o对于50mM>2，向掺入样品中加入12.5μl的4M溶液。

o对于75mM>2，向掺入样品中加入19μl的4M溶液。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤3：稀释

·如下制备1:10比率的稀释液：

·制备利妥昔单抗1:10：总是900μl LAL水+100μl样品

·由于没有足够的透析仪可用，水不以1:10稀释。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤4：透析

·将样品放入1mL透析仪中。500Da膜。但是，膜在LAL水中洗涤。

·相对于1L Aqua Braun在24℃进行透析4小时，2小时后换水。新的水也具有24℃的温度。

·透析仪置于三个2L烧杯中并且由于在每个烧杯中有长的搅拌器(即搅拌棒)而旋动该透析仪。

·每个烧杯中总是有4个透析仪。

步骤5：透析后加入HSA

·透析后，将样品分部分。为了制备HSA样品，将396μl各样品加入到单独的小瓶中。为了制备没有HSA的样品，将400μl加入到单独的小瓶中。

·为了获得0.01μg/ml的HSA浓度，将4μl的1μg/ml溶液加入到396μl样品中

·HAS原液是新制备的。

·振荡20分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤6：制备LER阳性对照

·在4小时透析结束前1小时制备LER阳性对照，以便与其它样品同时准备好。

·利妥昔单抗900μl+不同CSE原液的100μl CSE，从而得到5.0EU/ml]

·室温振荡1小时[Heidolph Multi Reax摇床，高速(2037rpm)]

步骤7：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

结果显示在图5中[利妥昔单抗059]。该实验证明HSA处理降低了回收率，因此在本文提供的方法中不太有用。另外，结果显示，透析膜的BSA处理对于获得满意的回收率是不必要的。此外，该实验还证明，50mMMgCl₂对于回收是最佳的值，10和75mM>2导致较低的回收。然而，用75mM>2也获得了满意的回收率。此外，该实验显示，即使没有透析，加入MgCl₂也能得到在令人满意的范围内(70-100％)的回收。但是，如上所述，在没有透析的情况下，LER效应不能被可再现地克服。因此，透析样品得到更稳健地克服LER效应的方法。在实验[利妥昔单抗059]中表明，水对照值高(部分值>220％)。LER阳性对照令人满意；即0％回收。

参照实施例3：加入MgCl₂后4小时孵育时间

在这个实验中，振荡利妥昔单抗样品60分钟以达到“阳性LER效应”。加入MgCl₂后，在室温孵育未稀释的样品4小时。孵育后，振荡样品2分钟。图5(B)中显示在LAL测定试验中测试的不同样品[利妥昔单抗061]。

在1.5ml Macherey-Nagel的螺纹口小瓶中制备了样品。

步骤1：样品制备

·制备用于10mM>2的掺入利妥昔单抗/水：897μl利妥昔单抗/水+99.8μl>

·制备用于50mM>2的掺入利妥昔单抗/水：889μl利妥昔单抗/水+98.8μl>

·制备用于75mM>2的掺入利妥昔单抗/水：883μl利妥昔单抗/水+98.1μl>

·制备用于100mM>2的掺入利妥昔单抗/水：877μl利妥昔单抗/水+97.5μlCSE从而获得5.0EU/ml

·制备用于150mM>2的掺入利妥昔单抗/水：866μl利妥昔单抗/水+96.3μlCSE从而获得5.0EU/ml

·振荡60分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤2：加入MgCl₂

·使用4M>2原液(即在0.657ml水中534.661mg>2·6H₂O)。

·对于10mM>2，向掺入样品中加入2.5μl的4M溶液。

·对于50mM>2，向掺入样品中加入12.5μl的4M溶液。

·对于75mM>2，向掺入样品中加入19μl的4M溶液。

·对于100mM>2，向掺入样品中加入25μl的4M溶液。

·对于150mM>2，向掺入样品中加入37μl的4M溶液。

·振荡1分钟[室温高速(2037rpm)]

步骤3：稀释

·以1:10的比率制备稀释液：900μl LAL水+100μl样品(即利妥昔单抗样品或水样品)

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤4：制备LER阳性对照

·利妥昔单抗900μl+100μl>

·通过混合900μl利妥昔单抗+100μl CSE,制备另一LER阳性对照，从而获得5.0EU/ml；随后用无内毒素的水1:10稀释样品

步骤5：振荡

·在室温振荡所有样品以及LER阳性对照1小时[Heidolph Multi Reax摇床，高速(2037rpm)]

步骤6：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

该实验的结果如图6(B)所示(即[利妥昔单抗061])。该图再次证明50mM>2对于CSE回收是可再现的最佳值；10、75和150mM显示稍差的结果。加入MgCl₂后实施一段孵育时间，未稀释的利妥昔单抗样品根本不导致CSE回收，参见图6(B)(即[利妥昔单抗061])。然而，1:10稀释导致约50-60％的回收(特别是当加入10、50、75或100mM>2时)。水对照值和LER阳性对照都令人满意。在这个实验中，没有进行透析。然而，一些实验表明透析是再现地克服LER效应所必需的。

参照实施例4：加入MgCl₂后2小时和4小时孵育时间的比较

振荡利妥昔单抗样品60分钟以达到“阳性LER效应”。加入MgCl₂后，孵育未稀释的样品2小时或4小时，然后1:10稀释,并在LAL测定试验中测量。在图7(A)和7(B)中显示在LAL测定试验中测试的不同样品(即分别为[利妥昔单抗062]和[利妥昔单抗063])。

在1.5ml Macherey-Nagel的螺纹口小瓶中制备了样品。

步骤1：样品制备

·制备用于10mM>2的利妥昔单抗/水：897μl利妥昔单抗/水+99.8μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

·制备用于50mM>2的利妥昔单抗/水：889μl利妥昔单抗/水+98.8μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

·制备用于75mM>2的利妥昔单抗/水：883μl利妥昔单抗/水+98.1μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

步骤2：制备两个LER阳性对照

·利妥昔单抗900μl+100μl CSE从而获得0.5和5.0EU/ml。

·用无内毒素的水以1:10的比率稀释LER阳性对照之一。

步骤3：振荡

·振荡所有样品以及LER阳性对照1小时：[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤4：加入MgCl2

·使用4M>2原液。

o对于10mM>2，向掺入样品中加入2.5μl的4M溶液

o对于50mM>2，向掺入样品中加入12.5μl的4M溶液

o对于75mM>2，向掺入样品中加入19μl的4M溶液

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤5：孵育时间

·将(未稀释)样品(以及LER阳性对照)分部分。各样品的一半(约500μl)孵育2小时，另一半孵育4小时。

步骤6：稀释

·振荡2分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

·以1:10的比率制备稀释液：900μl LAL水+100μl样品(即利妥昔单抗样品或水样品)。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤7：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

结果如图7(A)和7(B)所示(即分别为[利妥昔单抗062]和[利妥昔单抗063])。此处测量了0.5和5.0EU/ml内毒素的回收率。当向样品中加入10-75mM>2时，孵育2小时的样品(图7(A)，即[利妥昔单抗062])和孵育4小时的样品(图7(B)，即[利妥昔单抗063])中的回收相同。在这两个实验中，回收率非常相似。此外，在掺入5.0EU/ml内毒素的样品中，即使没有透析，也获得了令人满意的回收率(80-90％)。在掺入0.5EU/ml内毒素的样品中，回收率约为35-45％。重要的是，没有稀释(以1:10的比率)，观察到完全的LER，即0％回收率，在10-75mM>2存在下也如此。水对照以及LER阳性对照均令人满意。在这些实验中，没有进行透析。然而，进一步的实验表明，在没有透析的情况下，LER效应有时被克服，有时不被克服。因此透析样品得到更稳健地克服LER效应的方法。

参照实施例5：比较加入不同量的MgCl₂之后孵育时间2小时与加入不同量的MgCl>2之后不孵育

振荡利妥昔单抗样品60分钟以达到“阳性LER效应”。加入MgCl₂之后，不孵育未稀释的样品或孵育未稀释的样品2小时。然后1:10稀释并在LAL测定试验中测量。图8(A)和8(B)显示了在LAL测定试验中测试的不同样品(即分别为[利妥昔单抗064]和[利妥昔单抗065])。

参照实施例5.1：加入MgCl>2之后没有孵育时间

在该实验中，向样品中加入MgCl>2之后不进行孵育。

在1.5ml Macherey-Nagel的螺纹口小瓶中制备样品。

步骤1：制备样品

·制备用于10mM>2的利妥昔单抗/水：897μl利妥昔单抗/水+99.8μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

·制备用于25mM>2的利妥昔单抗/水：895μl利妥昔单抗/水+99.4μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

·制备用于50mM>2的利妥昔单抗/水：889μl利妥昔单抗/水+98.8μl不同CSE原液从而获得0.5和5.0EU/ml。

步骤2：制备两个LER阳性对照

·利妥昔单抗900μl+100μl CSE从而获得0.5和5.0EU/ml。

·用无内毒素的水以1:10的比率稀释LER阳性对照之一。

步骤3：振荡

·振荡(即，涡旋)所有样品以及LER阳性对照60分钟：[HeidolphMulti Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤4：加入MgCl₂

·使用4M>2原液。

o对于10mM>2，向掺入样品中加入2.5μl的4M溶液

o对于25mM>2，向掺入样品中加入6.25μl的4M溶液

o对于50mM>2，向掺入样品中加入12.5μl的4M溶液

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤5：稀释

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

·以1:10的比率制备稀释液。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤6：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

结果如图8(A)所示(即[利妥昔单抗064])。有关结果的讨论，参见参照

实施例4.2。

参照实施例5.2：加入MgCl>2后孵育2小时

在这个实验中，加入MgCl₂之后孵育样品2小时。步骤1至4如上参照实施例4.1所述进行。然而，加入MgCl₂之后，在室温(21℃)，孵育未稀释的样品2小时。孵育后，进行下面的步骤5和6。图8(B)显示了在LAL测定试验中测试的不同样品(即[利妥昔单抗065])。

步骤5：稀释

·振荡2分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

·以1:10的比率制备稀释液：900μl LAL水+100μl样品(即利妥昔单抗样品或水样品)

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤6：制备两个LER阳性对照

·利妥昔单抗900μl+100μl CSE从而获得0.5和5.0EU/ml

·用无内毒素的水以1:10的比率稀释LER阳性对照之一

步骤7：振荡

·振荡所有样品以及LER阳性对照1小时[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)]

步骤8：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上。

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

参照实施例4.1的结果如图8(A)所示(即[利妥昔单抗064])；参照实施例4.2的结果示于图8(B)(即[利妥昔单抗065])。在这两个实验中，稀释和LAL测量在加入MgCl₂后立即进行(图8(A)，[利妥昔单抗064])、或在加入MgCl₂后使样品静置2小时后进行(图8(B)，[利妥昔单抗065])。所有的回收率都非常相似，在掺入5.0EU/ml CSE的样品中，即使没有透析也获得了令人满意的(60-80％)回收率。有趣的是，在2小时的孵育时间之后，25mM>2浓度导致100％回收。因此，加入MgCl₂之后的孵育时间似乎是降低LER效应的有价值措施。然而，掺入0.5EU/ml>2+和稀释之外，透析是可靠地克服LER效应的必要步骤。在这些实验中，水对照的值是令人满意的。未稀释的LER阳性对照也是令人满意的，即0％。

参照实施例6：用利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品比较不同稀释度

掺入后，振荡利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品60分钟以达到“阳性LER效应”。加入MgCl₂之后，振荡未稀释的样品1小时并以1:2、1:5、1:10或1:20的比率稀释。然后进行LAL测定试验。在图9中显示在LAL测定试验中测试的不同样品(即[利妥昔单抗072])。

具体来说，进行了以下实验：

步骤1：制备样品

·制备用于25mM>2的利妥昔单抗/利妥昔单抗安慰剂/水：895μl利妥昔单抗/利妥昔单抗安慰剂/水+99.4μl不同CSE原液，从而获得0.5和5.0EU/ml。

步骤2：制备三种LER阳性对照

·利妥昔单抗安慰剂450μl+50μl CSE，从而获得0.5和5.0EU/ml(第一LER阳性对照)。

·利妥昔单抗450μl+50μl CSE，从而获得0.5和5.0EU/ml(第二LER阳性对照)。

·利妥昔单抗450μl+50μl CSE，从而获得0.5和5.0EU/ml。之后，将该样品以1:10的比率稀释(第三LER阳性对照)。

步骤3：振荡

·振荡(即涡旋)所有样品以及LER阳性对照物60分钟[HeidolphMulti Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤4：加入MgCl₂

·使用4M>2原液。

o对于25mM>2，向掺入样品中加入6.25μl的4M溶液

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温下高速(2037rpm)]

步骤5：稀释

·样品稀释如下：

o以1:5的比率稀释:400μl水+100μl样品

o以1:10的比率稀释:450μl水+50μl样品

o以1:20的比率稀释:475μl水+25μl样品

·以1:10的比率稀释三个LER阳性对照之一。

·不稀释不含MgCl₂的水。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤6：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

结果如图9所示(即[利妥昔单抗072])。重要的是，利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂的结果没有显著差异。这表明，利妥昔单抗中的LER效应主要基于缓冲系统(即柠檬酸盐缓冲液与聚山梨醇酯80)，抗体(即利妥昔单抗)对LER效应没有显著的影响。然而，在这个实验中，利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂的回收率都不令人满意。在上述实验中，水对照的值是令人满意的。未稀释的LER阳性对照也是令人满意的，回收率为0％。

参照实施例7：加入MgCl₂之前的孵育时间对利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品中回收率的影响

在下面的实验中，测试了加入MgCl₂之前的孵育时间是否对利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品的回收率有影响。具体而言，振荡利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂样品60分钟以实现“阳性LER效应”。然后将样品在4℃孵育0小时至3天。之后，加入MgCl₂至浓度50mM，稀释样品。然后，用没有BSA封闭的透析膜进行透析。图10显示在LAL测定试验中测试的不同样品(即[利妥昔单抗079]和[利妥昔单抗082])。

在1.5ml Macherey-Nagel的螺纹口小瓶中制备样品。

步骤1：制备样品

·制备用于50mM>2的利妥昔单抗/利妥昔单抗安慰剂/水：5,346μl利妥昔单抗/利妥昔单抗安慰剂/水+596μl不同CSE原液，从而获得0.5或5.0EU/ml。

·涡旋60分钟[Heidolph MultiReax摇床，室温下高速(2037rpm)]

·对于进一步的步骤，将1ml各样品转移到新的小瓶中

步骤2：孵育时间

·将样品置于4℃冰箱中0小时、4小时、1天、3天或7天。

·在1天、3天或7天的孵育时间之后，振荡样品2分钟[Heidolph MultiReax摇床，在室温下高速(2037rpm)]。孵育0小时和4小时之后，不振荡样品。

步骤3：加入MgCl₂

·使用5M>2原液(即0.891ml水中0.9055g>2)

o对于50mM>2，向掺入样品中加入10μl的5M溶液

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)

步骤4：稀释

·以1:10的比率制备稀释液：900μl LAL水+100μl样品(即利妥昔单抗样品、利妥昔单抗安慰剂样品或水样品)

·不稀释不含MgCl₂的水。

·振荡1分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温,高速(2037rpm)

步骤5：透析

·将样品加入1ml透析仪中。相对于1升Aqua Braun在24℃下透析4小时，2小时后换水。新水也具有24℃的温度。使用500Da膜，其之前未用BSA孵育。

·透析仪置于三个2L烧杯中并且由于在每个烧杯中有长的搅拌器(即搅拌棒)而旋转。

·透析后，将样品转移到新的1.5ml小瓶中。

步骤6：振荡

·振荡20分钟[Heidolph Multi Reax摇床，室温，高速(2037rpm)]

步骤7：制备LER阳性对照

·在4小时的透析结束前1小时制备LER对照，以便与其它样品同时准备好。

·利妥昔单抗或利妥昔单抗安慰剂900μl+100μl CSE以获得5.0EU/mL CSE

·在室温下振荡1小时[Heidolph Multi Reax摇床，高速(2037rpm)]

步骤8：LAL测定试验

·在双重测定中将100μl各样品施加到板上

·在37℃在读取器中孵育10分钟。

·将100μl色原施加到各样品。

·在读取器中开始测量。

结果与讨论：

结果示于图10(A)(即[利妥昔单抗079]，不孵育)、图10(B)(即[利妥昔单抗080]，孵育4小时)、图10(C)(即[利妥昔单抗081]，孵育1天)和图10(D)(即[利妥昔单抗082]，孵育3天)。没有显示孵育7天的结果。结果再次证明，通过使用本文所述的方案，对于利妥昔单抗以及利妥昔单抗安慰剂样品，可以获得良好的回收率。另外，这个实验证明，加入MgCl₂之前的孵育时间不会改善回收率。具体而言，0-4小时的孵育时间导致回收率在期望的范围内(50-200％)，而1天和3天的孵育时间导致较低的回收率(大约20-30％)。不进行(即0小时)孵育，对于利妥昔单抗，获得了非常好的回收率(70-80％)。对于掺入5.0EU/ml>

参照实施例8：现有技术的方案(“LAL测定试验”)及其修改不能克服利妥昔单抗或利妥昔单抗安慰剂中的LER效应

在该实施例中，测定了通常已知的LAL测定试验是否能够检测利妥昔单抗和利妥昔单抗安慰剂制品中的内毒素。因此，使用了以下材料：

[利妥昔单抗002]：Lonza CSE+Lonza试剂(即Lonza试剂盒)

[利妥昔单抗004]：分别为ACC CSE或Lonza CSE+ACC试剂(即ACC试剂盒)

[利妥昔单抗005]：Lonza CSE+ACC试剂(即ACC试剂盒)

如制造商所描述，精确地进行了LAL测定试验。

如从图11(A)-(C)(即分别为[利妥昔单抗002]、[利妥昔单抗004]和[利妥昔单抗005])可以看出的，标准的LAL测定试验并不导致令人满意的回收率，即使测试几个不同的稀释度。具体而言，在一个实验中(即[利妥昔单抗002])，将利妥昔单抗移液到96孔板(即微量滴定板)中并掺入LonzaCSE至终浓度0.5EU/ml或5.0EU/ml。随后，在96孔板中进行如图11(A)(即[利妥昔单抗002])所示的用水稀释。然后进行LAL测定试验。然而，如图11(A)(即[利妥昔单抗002])所见，未达到50％的回收。

在类似实验中(即[利妥昔单抗004])，将利妥昔单抗移液到微量滴定板的孔中，掺入Lonza CSE和ACC CSE至终浓度0.5EU/ml或5.0EU/ml。随后，在96孔板中进行如图11(B)(即[利妥昔单抗004])所示的用水稀释。之后，进行测量。但是，如图11(B)所见，使用ACCCSE的回收率超过了200％，而Lonza CSE掺入没有达到令人满意的回收率。

在进一步的实验中，分析了pH调整对LAL测定试验的影响。具体而言，在一个实验中[利妥昔单抗005]将利妥昔单抗移液到微量滴定板中，在板中进行Lonza CSE掺入。随后，进行如图11(C)[利妥昔单抗005]所示的用水稀释或pH调整。然而，稀释和pH调整都不能得到50％的回收(参见图11(C)[利妥昔单抗005])。

单独的透析也不能达到令人满意的回收率。更具体地说，在进一步的实验中，用CSE掺入利妥昔单抗以获得终浓度0.5和5.0EU/ml(即900μl利妥昔单抗溶液与100μl CSE混合)。随后，在1ml旋转式透析仪中(在1mlTeflon室中)在4℃透析样品4小时，其间在2小时后换水一次。透析膜具有100Da的MWCO。然后，在板中进行如图12(即[利妥昔单抗011])所示的稀释。随后，通过使用LAL测定试验来测量内毒素回收。但是，只有水对照能获得良好的回收率。在利妥昔单抗的情况下，最大回收<5％(见图12[利妥昔单抗011])。因此，只有透析和稀释不能克服LER效应。

参照实施例9：保持时间研究

为了识别和监测LER效应，在内毒素保持时间研究中随时间监测了内毒素含量。因此，将内毒素掺入各种缓冲液的未稀释样品，并随时间存储(多至28天)。用适当的样品混合物掺入后在PPC中可接受的内毒素回收值定义为在理论掺入值(100％)的50-200％范围内。LER效应由内毒素随时间的显著丧失来指示。具体而言，内毒素值<50％理论掺入值的不利趋势指示LER效应。

在内毒素保持时间研究中研究了几种制剂缓冲液组分(结果参见下表)。

表1：保持时间研究

n.d.＝未确定

从上表中可以看出，包含聚山梨醇酯20和Na₂HPO₄；聚山梨醇酯20和NaH₂PO₄；聚山梨酸酯20、Na₂HPO₄⁺和NaH₂PO₄；柠檬酸钠、聚山梨醇酯80和NaCl；柠檬酸钠和聚山梨醇酯80；以及聚山梨醇酯80和NaCl的缓冲液呈现LER效应。

参照实施例10：缓冲液和洗涤剂对LER效应的影响

在几个实验中，分析了柠檬酸盐和/或聚山梨醇酯80对LER效应的影响。具体而言，在一个实验中使用利妥昔单抗和25mM柠檬酸钠缓冲液作为样品。在掺入前，将pH调整至pH7。随后，在板中进行CSE掺入，并用水稀释样品。如从图14(A)(即[利妥昔单抗006])可以看出，通过使用1:10的稀释度对柠檬酸钠可以获得令人满意的回收率。然而，在利妥昔单抗的情况下无法达到50％的回收。

在另一个实验中，使用25mM柠檬酸钠缓冲液、聚山梨醇酯80和两者的组合作为样品。具体而言，使用存在于利妥昔单抗中的浓度(即聚山梨醇酯80：0.7mg/ml；柠檬酸钠：9mg/ml)。这些缓冲液系统掺入了0.5和5.0EU/ml的Lonza CSE或Cape cod CSE(除了柠檬酸钠，其仅掺入了Lonza，因为ACC掺入的柠檬酸钠缓冲液已经在上述实验中进行了并示于图14(A)(即[利妥昔单抗006])。掺入后，在板中用水进行1：2或1：5的稀释。在聚山梨醇酯80的情况下，几个样品得到在50％至200％之间的令人满意的回收率。相比之下，在柠檬酸钠缓冲液的情况下，只有1：10的稀释度得到在50％和200％之间的回收率。这表明与聚山梨醇酯80相比，柠檬酸盐缓冲液对LER效应的影响更显著。此外，在该实验中如果使用柠檬酸钠和聚山梨醇酯80的组合作为样品，则不能克服LER效应。该实验表明，在单克隆抗体制剂中，LER效应由缓冲液制剂，即由柠檬酸钠缓冲液和聚山梨醇酯80的组合，引起。

这些结果已经通过另一个实验证实，其中测试了几个不同的稀释度。具体而言，制备包含25mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)、700mg/L聚山梨醇酯80或两者的样品(即利妥昔单抗制剂)。将这些制剂以及水对照中掺入Lonza CSE至终浓度0.5或5.0EU/ml。在室温下在涡旋机中振荡所有样品1小时[摇床：Heidolph Multi Reax，高速(2037rpm)，在1.5透明玻璃钳口平底容器中。随后，在1.5ml小瓶中用无内毒素的水进行如图14(B)所示的(即[利妥昔单抗029])稀释，并振荡(如前)1分钟。振荡后，进行LAL测定试验。具体而言，将100μl各样品加入到96孔板中，并在37℃在读取器中孵育10分钟。然后，将100μl色原加入到各样品中并进行测量。如图14(B)(即[利妥昔单抗029])所示，缓冲液(即柠檬酸钠缓冲液)的LER效应比洗涤剂(即聚山梨醇酯80)的LER效应更强。聚山梨醇酯80显示相对恒定的回收率(～40-90％，参见图14(B)，[rituximab 029]从右侧第2-5栏)，然而在柠檬酸盐缓冲液中LER效应取决于稀释度。最重要的是，如果聚山梨醇酯80与柠檬酸盐缓冲液组合(如在单克隆抗体制剂中的情况)，则表现出强的和可再现的LER效应，参见图14(B)(即[利妥昔单抗029])。在这些样品中，也使用高稀释度，回收率只有～5-10％。因此，这个实验证明了如何能够获得阳性LER效应。这个结果在内毒素测定领域中是开创性的，因为它允许测试几种手段和方法克服LER效应的能力。

当分开地分析缓冲液和洗涤剂的影响时，缓冲液对LER效应的影响在和利妥昔单抗二者中更显著(参见例如图14(B)，即[利妥昔单抗029])。这些数据令人惊奇地表明，去除缓冲液比去除洗涤剂更重要。考虑到在两种制剂中缓冲液的浓度是相当的(利妥昔单抗：25mM柠檬酸钠和NeoRecormon：27.8mM磷酸钠)，必须在缓冲液的结构和/或其物理-化学性质中寻找该影响的原因。柠檬酸钠是一种众所周知的螯合阴离子，而在磷酸盐中，这种影响不太明显。因此，这些观察也可以解释为什么加入Mg²⁺对于克服LER效应是重要的，因为Mg²⁺被螯合缓冲液复合而降低其在LAL测试中的浓度。

参照实施例11：标准物理和生物化学方法不能回收被LER效应屏蔽的内毒素

为了克服LER效应(在参照实施例9鉴定为具有LER效应的缓冲液中)，测试了不同的物理和生物化学方法：

在-30℃冷冻掺入内毒素的样品。该研究是基于LER在室温下比在2-8℃更明显这一最初发现。结果：冷冻掺入内毒素的样品不能克服LER。

在70℃加热掺入内毒素的样品30分钟。进行这项研究是因为已经表明加热克服了一些产品的内毒素屏蔽效应(Dawson,2005,LAL update.22:1-6)。结果：热处理掺入内毒素的样品不能克服LER。

将掺入内毒素的样品稀释至最大有效稀释度(MVD)。进行这项研究是因为样品稀释是克服LAL抑制的标准方法。结果：如从图11(即[利妥昔单抗002]、[利妥昔单抗004]、[利妥昔单抗005])可以看出，单独稀释不能克服LER效应。

使用Endo Trap柱用于掺入内毒素的样品。这些柱用于通过亲和色谱法从溶液中除去内毒素。用内毒素水溶液进行测试。结果：不能从柱中回收内毒素。

参照实施例12：通过透析去除洗涤剂

如下所述，已经测试了几个在市场上可获得的透析室和膜(包括不同大小的截留分子量，MWCO)。

可商业获得的用于透析室的合适膜是例如醋酸纤维素(MWCO 100至300,000Da)、再生纤维素(MWCO 1,000至50,000Da)或纤维素酯(MWCO100至500Da)。文中，醋酸纤维素和纤维素酯是优选的，醋酸纤维素最优选的。

在透析之前稀释测试样品(即利妥昔单抗)，这样接近CMC并且产生递增水平的洗涤剂单体(预期其可以通过透析膜扩散)。对掺入CSE的回收率的调查显示，在利妥昔单抗的情况下，再生纤维素不如醋酸纤维素那样有效。在使用利妥昔单抗的一系列实验中，鉴定了MWCO优选为～10kDa。该大小是优选的，理由是该大小被认为可以i)加快透析过程，和ii)还允许洗涤剂的较高低聚物的聚集体(但不是胶束)通过膜(在醋酸纤维素的疏水特性(葡萄糖聚合物上的乙酰酯)不抑制这种运输过程的情况下)。

为了模拟的情况，进行了确定最佳透析的实验。如前所述，缓冲液和洗涤剂是样品制剂中主要影响LER效应的那些化合物。为了模拟的制剂，制备在0.1mg/ml聚山梨醇酯20存在下、总体积0.5ml中确定量的磷酸盐缓冲液(2.7mg)，并进行透析(在旋转式透析仪中)。在图1中显示了这种实验的一个非常简单的实例，其中使用具有12-16kDa的MWCO的醋酸纤维素透析膜。此处显示在给定时间之后内部透析液中剩余的物质，由此说明透析的效率。具体来说，分析经过72小时(3d)内部透析室中剩余的物质的重量。结果是相当令人惊奇的，因为其表明只有在室温下较长的透析时间(>24-48小时)后才能实现的完全有效透析。基于该实验，优选的透析时间为20小时至过夜(例如24小时)。此外，这个结果表明Harvard快速透析仪优于Harvard旋转式透析仪，前者具有双重区域的透析膜，从而导致更快速的透析。

在图2中，显示了在将磷酸盐置于透析的内部透析液隔室中时的透析效率。在该实验中，透析膜(MWCO 12-16kDa)在使用之前用0.2％BSA洗涤(30分钟)，以避免样品中掺入的CSE的非特异性吸光度。然而，在本文提供的发明方法中，样品的稀释(例如以1：10比率的稀释)可以降低洗涤剂的浓度。

参照实施例13：MgCl₂对LER效应的影响

已经发现，通过向样品中加入MgCl₂可以降低LER效应(参见例如图15(即[利妥昔单抗031])。特别地，当Mg²⁺的浓度是柠檬酸钠浓度的2倍时(即50mM>2+)，观察到最好的结果。

具体而言，制备包含25mM柠檬酸钠缓冲液pH6.5(即柠檬酸钠缓冲液，pH6.5)、0.7mg/ml聚山梨醇酯80或二者(pH6.5，即利妥昔单抗制剂)的样品。向这些制剂以及水对照中掺入Lonza CSE至终浓度0.5或5.0EU/ml。在室温下振荡所有样品1小时[摇床：HeidolphMulti Reax，高速(2037rpm)，在1.5透明玻璃钳口平底容器中]。然后，向样品中加入MgCl₂以达到10mM、25mM、50mM或75mM的浓度。随后，在1.5ml小瓶中用无内毒素的水进行如图15(A)、18(B)、18(C)和18(D)(即[利妥昔单抗030-利妥昔单抗033])所示的稀释并振荡(即如前涡旋)1分钟。振荡后，进行LAL测定试验。具体而言，将100μl各样品加入到96孔板中并在37℃在读取器中孵育10分钟。之后，将100μl色原加入到各样品中并进行测量。如图15(A)(即[利妥昔单抗030])可以看出，在所有稀释的样品中，MgCl₂(10mM)可中和柠檬酸盐的络合作用。镁离子降低了包含聚山梨醇酯80以及柠檬酸盐缓冲液的样品中的LER效应。在这种情况下，实现了用5.0EU/ml的约50％的回收率和用0.5EU/ml的约25％的回收率。水对照的值在围绕理论预期值的范围(即70-130％)。此外，图15(A)、15(B)、15(C)和15(D)(即[利妥昔单抗030]、[利妥昔单抗031]、[利妥昔单抗032]和[利妥昔单抗033])的比较显示，两倍于柠檬酸盐缓冲液浓度的MgCl₂浓度(即50mM>2)得到最佳回收率。尽管25mM和75mM>2不是MgCl₂的最佳浓度，但是这些浓度仍可以克服柠檬酸盐缓冲液的LER(回收：75-190％)。在使用利妥昔单抗作为样品的类似实验中证明，只加入MgCl₂至10mM、50mM或75mM>2的浓度并且随后以1:10的比率稀释(不透析)，能够得到令人满意的掺入终浓度至5.0EU/ml的内毒素的回收(参见图5，即[利妥昔单抗059])。

参照实施例14：机械处理对LER效应的影响

测试了机械处理(如振荡和超声处理)是否可用于分散胶束，从而降低LER效应。

具体而言，用Lonza CSE掺入无内毒素的水(即LAL水)和利妥昔单抗以达到0.5和5.0EU/ml的终浓度。然后，超声处理样品1小时或振荡1小时[即在Heidolph Multi Reax摇床中，在1.5ml透明玻璃瓶钳口平底容器中，在室温，高速(2037rpm)涡旋]。然后用无内毒素的水制备1:10(样品：水)稀释液。随后，通过使用12-16kD膜(在透析之前其已经在0.2％BSA中孵育30分钟),透析稀释的样品。在两个2升烧杯中进行透析4小时。外部透析液是1升AquaBraun，透析2小时后换水。透析后，向一些样品中加入MgCl₂(如图16所示，即[利妥昔单抗034])，以便得到50mM的MgCl₂终浓度。加入MgCl₂后，振荡所有样品(也有不含MgCl₂的样品)20分钟(例如，如前涡旋)。随后，进行LAL测定试验。具体而言，将100μl各样品加入到96孔板中并在37℃在读取器中孵育10分钟。然后，将100μl色原加入到各样品中并进行测量。如从图16(即[利妥昔单抗034])可以看出，振荡或超声处理都不能改善回收率。因此可以得出这样的结论：通过振荡或超声处理机械地分散引起LER的胶束，相比而言是无效的。但是，加入MgCl₂(50mM)降低了LER效应，因为其导致了多至5-20％的改善的回收率值。此外，该实验还证实，不同实施步骤的顺序对于克服LER效应是重要的。具体而言，在上述实验(示于图16，即[利妥昔单抗034])中，步骤的顺序是(a)稀释、(b)透析和(c)加入MgCl₂。该顺序没有得到令人满意的回收率(参见图16，即[利妥昔单抗034])。然而，如图3和4(即[利妥昔单抗046]、[利妥昔单抗115]和[利妥昔单抗117])所示，(a)加入MgCl₂、(b)稀释和(c)透析的顺序导致回收率满足FDA的要求(即50％-200％)。

本发明涉及以下核苷酸和氨基酸序列：

SEQ ID NO：1：利妥昔单抗重链氨基酸序列

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：2：利妥昔单抗轻链氨基酸序列

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.制备样品的方法，所述样品包含抗体，用于鲎变形细胞溶解物(LAL)测定，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl₂形式，

(b)稀释样品，和

(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-8.0的样品。

2.用于在显示LER效应的包含抗体的样品中测定细菌内毒素的方法，其中所述方法按照以下顺序包括以下步骤：

(a)向样品中加入镁离子，优选以MgCl₂形式，

(b)稀释样品，

(c)相对于无内毒素的水溶液透析具有pH值5.7-8.0的样品，和

(d)通过使用LAL测定试验，测定样品中的细菌内毒素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗体是治疗性抗体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体用聚山梨醇酯80配制。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗体用柠檬酸盐缓冲液配制。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述抗体用约25mM柠檬酸钠缓冲液和约700mg/l聚山梨醇酯80配制，并具有约6.5的pH值。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗体是抗CD20抗体利妥昔单抗。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中加入镁离子至终浓度约25至75mM。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中通过用10-50mM Tris/HCl缓冲液pH 6.0-9.0，优选6.0-8.0，稀释样品，调整样品的pH值。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中以1:10的比率稀释样品。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在步骤(c)的透析期间，样品具有6.0-8.0的pH值。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中透析在室温进行约24小时。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中对于步骤(c)中的透析，使用具有截留分子量10kDa的膜。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中对于步骤(c)中的透析，使用醋酸纤维素膜。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中对于步骤(c)中的透析，换水两次。

16.根据权利要求2-15中任一项所述的方法，所述方法还包括通过向样品的等分试样中掺入已知量的内毒素并且振荡掺入内毒素的样品等分试样60分钟至2小时，产生低内毒素回收(LER)阳性对照。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法用于使包含抗体的样品对LAL酶促级联中的因子C具有反应性的用途。