一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗VEGF和EGFR的单链双特异抗体，所述单链抗体由抗VEGF的抗体轻链和抗EGFR的抗体重链通过连接肽融合而成，其具有能够分别识别VEGF和EGFR的两组独特的CDR区序列，对VEGF和EGFR具有高度特异的识别能力，且具有优异的肿瘤结合效果，对不同类型的肿瘤细胞系均有特异性结合。本发明还公开了偶联了指示剂的所述抗体在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。当所述成像剂应用在肿瘤动物模型上，标记了近红外荧光和核磁显像剂的该单链抗体可以清楚地显示出小鼠肿瘤的大小和位置，具有极高的体内成像能力。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体，更具体地，本发明涉及一种单链抗体。

背景技术

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。

肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。

肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。

近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。

如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。

用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。而我们发现血管表皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。

随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。然而，现有技术中的抗体也因为特异性不高导致肿瘤结合效果欠佳，靶点单一以至于存在漏检风险，偶联剂标记单一造成检测成本增高，以及抗体与指示剂的偶联适应度不高限制成像效果等问题而限制了这一诊断手段的进一步应用。

发明内容

基于现有肿瘤诊断存在的技术问题，本发明的目的是研发出一种具有特异性识别能力的双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体，并同时偶联顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料进而提供一种既能作为体内核磁成像剂，又能作为体内荧光成像剂的双特异抗体。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体，所述抗体的轻链来源于抗血管表皮生长因子(VEGF)的抗体，其CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链来源于抗表皮生长因子受体(EGFR)的抗体，其CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、6和7所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。

在一个又为优选的技术方案中，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一个最为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区位于所述抗体的氨基端。

其次，本发明提供了一种生物大分子偶联物，所述偶联物含有上述任一所述抗体。

在一个优选的技术方案中，在所述偶联物中，FITC、近红外荧光蛋白和/或顺磁性阳性造影剂与所述抗体偶联。

在一个更为优选的技术方案中，所述近红外荧光蛋白与所述顺磁性阳性造影剂同时与所述抗体偶联，所述近红外荧光蛋白为irdye800，所述顺磁性阳性造影剂为DOTA-gd。

再次，本发明提供了上述偶联物在制备肿瘤体内成像诊断制剂中的应用。

最后，本发明提供了上述偶联物在制备免疫荧光诊断试剂中的应用，所述FITC与所述抗体偶联。

本发明选取具有确定性抗肿瘤作用的靶点血管表皮生长因子和表皮生长因子入手，利用全人源的噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗VEGF和EGFR的ScFv，选取具有单独的特异性抗原结合活性的抗VEGF的轻链可变区(VL)和抗EGFR的重链可变区(VH)，利用分子生物学方法将两者在基因水平上组成一个双特异的ScFv单链抗体。本发明的双特异的抗血管表皮生长因子和表皮生长因子受体的单链抗体具有优异的亲和力，亲和力常数分别为5.18×10^-9M和4.26×10^-9M。而大多数自身抗体的亲和力常数小于10^-5--8M，本发明的双特异的单链抗体用于体内诊断显像时可以不仅竞争自身抗体与EGFR表面抗原结合，也可以竞争自身抗体与VEGF结合，大大提高了抗体诊断肿瘤的灵敏性。在具有高特异的抗原结合能力的序列基础上，本发明将该单链双特异性抗体偶联顺磁性阳性造影剂和/或近红外荧光，作为体内核磁和/或荧光显像剂，并得到了很好的应用。

本发明的独特构思在于利用两个针对不同靶点的VL和VH组成一个双特异的ScFv单链抗体，在分子量不增加的前提下，具有同时识别两种靶点。另一独特构思在于在这个单链抗体上同时偶联两种显像剂，可同时利用核磁或激光成像，不仅拓宽了这种单链抗体的体内应用方式。而且利用特异性识别肿瘤靶点的单链抗体进行肿瘤体内成像也降低了假阳性率，提高了确诊率。仅仅通过核磁就能达到确诊，不用患者再进行放射性核素成像，减少了患者的核暴露伤害。最后该双特异的单链抗体也可以应用到肿瘤切除手术中，为医生提供手术导航，达到彻底清除肿瘤组织和转移病灶的效果。由于本发明选用的是抗体小分子片段，该单链抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

附图说明

图1.VH和VL PCR产物鉴定图；

图2.载体图谱和重组载体鉴定图；

图3.筛选出的VEGF VL、EGFR VH、VEGF-EGFR ScFv与VEGF-165、EGFR蛋白的结合试验柱状比较图；

图4.纯化后的VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR ScFv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；

图5.FITC标记的VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR ScFv对胰腺癌肿瘤细胞panc-1的免疫荧光结果图；

图6.近红外荧光(irdye800)和DOTA-gd标记的VEGF-EGFR ScFv探针的稳定性分析曲线图；

图7.irdye800和DOTA-gd标记的VEGF-EGFR ScFv对小鼠结直肠癌肝转移的荧光和核磁显像图；

图8.近红外荧光标记的VEGF-EGFR ScFv在手术导航中的应用效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1抗VEGF和EGFR单链抗体的制备

1.1高库容量天然抗体库的建立。

分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。

1.2细胞总RNA的提取

按每5×10⁶cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5分钟，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。4℃，10,000×g离心15分钟，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10分钟。4℃，12,000×g离心10分钟，弃上清，加入1ml>

1.3逆转录合成cDNA第一链

先用无RNase的DNaseⅠ处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10分钟。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer 5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl,MMLV逆转录酶1μl,补加DEPC水至25μl，42℃，保温60分钟进行逆转录反应，70℃，15分钟灭活酶活性。

1.4PCR扩增VH和VL基因

以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：

引物序列：

引物1:5’GCTAGCGGTGGTGGTGAA3’

引物2:5’TTCACCACCACCGCTAGC3’

PCR参数：94℃变性3分钟后，再以94℃30秒；61℃30秒；72℃1分钟，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR产物回收

(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。

(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。

(3)加入200μl溶胶液B，混均后将全部液体吸入回收柱中。

(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。

(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。

(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。重复步骤6)1次。

(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。

(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA片段，于-20℃保存备用。

1.5搭桥PCR法进行VH和VL的拼接

将制备的VH和VL片段作为模板，进行VH和VL片段的串联。

PCR反应体系：

引物序列：

RSC-F 5’GGAGATCAAAGGTGGTTCTGGTGGCGGTGGT3’

RSC-B5’ACTTCACCACCGCCACCAGAACCAC3’

串联后的连接多肽的序列:GGSGGGG

PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，PCR产物溶于30μl ddH₂O中。图1为VH和VL>

1.6连接到噬菌体载体上，

Sfi1酶切载体和PCR产物

37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。

连接反应

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pComb3XSS载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图，其中，泳道1为分子量标记，泳道2,3为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱。

1.7转化和表达

将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体就是噬菌体抗体库。经检测百人天然ScFv抗体库的库容量为2*10¹⁰，完全满足抗体筛选的需要。

1.8 VEGF和EGFR单链抗体的筛选

从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库，VEGF A亚型蛋白或EGFR蛋白包被ELISA板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做ELISA筛选阳性克隆，测序，评价序列，经过多次验证，选择具有特异性结合活性的VEGF(亲和力常数：6.18×10^-9M)的VH和EGFR(亲和力常数：4.98×10^-9M)的VL序列进行表达，同时在基因水平将两者连接成一双特异的ScFv抗体序列并表达。图3筛选出的VEGFVL、EGFR>

表1.VEGF VL、EGFR VH、VEGF-EGFR ScFv与VEGF-165、EGFR蛋白亲和力常数对照表

经过序列分析，所述双特异性单链抗体的轻链(抗EGFR VL)的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链(抗VEGF VH)的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

本发明提供的单链抗体来源于人源的噬菌体抗体库，因此其序列是全人源的，这为该抗体在人体内作为治疗药物或者体内成像诊断试剂的使用奠定了低免疫原性基础。

对该抗体进行进一步改构，在轻链和重链之间添加如SEQ ID NO.9所示的连接多肽。将编码该单链抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)克隆入pGEM-T Easy，并转化入大肠杆菌DH5α保存。制备该单链抗体时，将编码该单链抗体的核苷酸序列克隆入表达载体PET28a⁺载体，再转化到相应BL₂₁(DE₃)大肠杆菌宿主菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。图4为纯化后的VH和VL以及VEGF-EGFRScFv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。泳道1、2分别为VH和VL蛋白，泳道3、4分别为VEGF-EGFRScFv。由于使用的是原核表达系统，载体两端的细菌蛋白质也随之表达，在还原胶的条件下，看到VEGF-EGFR>

大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44ΔlacU169hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1,用于质粒的扩增与转化。

大肠杆菌BL₂₁(DE₃),基因型为hsdS>

pGEM-T Easy：用于PCR产物的克隆，购自Promega公司。

原核表达质粒载体pET28a，pET42，pGEX-4t-1均为本室保存。

VEGF-EGFR单链抗体的纯化

将含有六个组氨酸标记的VEGF-EGFR ScFv-His6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。

HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/分钟。

使用Binding Buffer洗柱。

使用6ml Elution Buffer洗脱柱子，分管收集洗脱液，取少量进行SDS-PAGE鉴定富含目的蛋白的各管于-70℃保存。

实施例2.FITC标记的VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR单链双特异ScFv对胰腺癌肿瘤细胞panc-1的免疫荧光结果(confocal)

利用胰腺癌细胞系panc-1验证VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR单链双特异ScFv对肿瘤细胞的结合。

首先FITC(异硫氰酸荧光素)标记VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR单链双特异ScFv，步骤如下：

(1)将待交联的抗体(浓度≥1mg/ml)对交联反应液透析三次(4℃)，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO₃，1.06g>2CO₃，7.36g>

(2)将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。

(3)按P:F(蛋白质：FITC)＝1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8小时。

(4)加入5mol/L的NH₄Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时。

(5)将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。

(6)交联物的鉴定。

蛋白浓度(mg/ml)＝[A280–0.31×A495]/1.4

F/P比例:3.1×A495/[A280–0.31×A495]，该值应介于2.5～6.5之间。

FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN₃、1％BSA，4℃暗处保存。

然后进行细胞染色，步骤如下：

1)细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

2)细胞半干时，覆盖以4％冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。

3)吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。

4)0.5％Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

5)进口胎牛血清室温封闭30分钟。

6)配制一抗VEGF VL、EGFR VH以及VEGF-EGFR ScFv:FBS＝1:200。

7)加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。

8)次日，取出细胞复温至室温约1小时。

9)冰1‰Tween洗两次，每次5分钟于摇床。冰PBS洗一次，5分钟于摇床。

10)DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。

11)冰1‰Tween洗两次，每次5分钟于摇床。冰PBS洗一次，5分钟于摇床。

12)加入防荧光淬灭封片剂，避光。

13)上机confocal。

结果如图5所示。FITC标记的EGFR VL可以结合panc-1细胞表面的EGFR蛋白，使得细胞膜呈均匀绿色，与DAPI染的细胞核重合。FITC标记的VEGF VH可以结合panc-1细胞胞浆中的VEGF，使得整个细胞显绿色，DAPI将细胞核染成蓝色，两种颜色叠加相互吻合，说明该绿色荧光显示的是细胞形态。该实施例证明FITC标记的VEGF-EGFR单链双特异ScFv可以染细胞膜和细胞浆。

实施例3.近红外荧光(irdye800)和DOTA-gd标记的VEGF-EGFR ScFv对小鼠结直肠癌动物模型的荧光和核磁显像

(1)irdye800和DOTA-gd标记的VEGF-EGFR ScFv探针的稳定性分析

近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。

DOTA-gd(中文名称为钆-大环配体)是一种核磁造影剂。核磁是目前医院常用的检测和诊断工具，通过核磁能够非常直观地观察机体内部器官的形状、密度等性状。然而，仅仅使用核磁造影剂并不能完全地反映体内肿瘤分布，尤其是对于早期肿瘤，需要更加灵敏的方式通过核磁显像。将特异性识别肿瘤靶点的抗体偶联核磁造影剂，注入人体，带有靶标的造影剂会高浓度地聚集在肿瘤组织周围，使其显像密度高于正常组织，增加了肿瘤的确诊率。

如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。

偶联好两种显像剂的探针在0，1，2，4，9，24，48小时分别进行紫外吸收稳定测定和荧光激发稳定性测定，判断探针的稳定性。结果如图6所示。A、B为紫外吸收稳定测定，C、D为荧光激发稳定性测定，随时间的变化紫外吸收率和荧光值均只有少许变化，可以判断该双模态探针偶联成功。

(2)标记的VEGF-EGFR ScFv对小鼠结直肠癌动物模型的荧光和核磁显像

标记的VEGF-EGFR ScFv双模态探针尾静脉注射肿瘤模型小鼠，通过荧光显微镜和核磁观察该探针在肿瘤模型鼠体内的分布，结果如图7所示。A：小鼠肿瘤自发光3D显像；HT29细胞自带luciferase报告基因，可以显示肿瘤模型小鼠肿瘤组织位置；B：双特异探针在小鼠体内的荧光显像，可见，红色荧光分布位置与自发光位置一致；C：双特异探针在小鼠体内的核磁T2显像，可见核磁平扫图中有明显肿块，边际清楚且着色重；D：小鼠解剖图，可见小鼠结直肠肿瘤包块。

实施例4.近红外荧光标记的VEGF-EGFR ScFv在手术导航中的应用

标记有近红外荧光的VEGF-EGFR ScFv在激发光下，可以呈现肿瘤轮廓，结果如图8所示。在可见光下，可见小鼠模型的肿瘤块，第一排由左向右依次为，皮下，解剖皮肤肿块清晰暴露以及摘除的肿块。第二排则在体视荧光显微镜下观察的相应部位的荧光，位置和大小均和可见光视野下的一致。该探针可以应用到手术导航中。

序列表

<110> 北京格根生物科技有限公司

亦康（北京）医药科技有限公司

<120> 一种抗VEGF和EGFR的单链双特异的抗体及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Ser Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Lys Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

1 5 1015

Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

202530

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val

354045

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

505560

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

65707580

Tyr Lys Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile

859095

Lys

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ile Gly Gly Ser Gly Asn His Ile

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ala Arg Met Val Gly Ser Tyr Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His

202530

Thr Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Ser Ser Ile Gly Gly Ser Gly Asn His Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Lys Ser Leu His

65707580

Leu Glu Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Arg Met Val Gly Ser Tyr Ser Trp Tyr Phe Asp Tyr

100 105

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 10

<211> 639

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ctgactgcat ctgtaggtga tcgtgttacc atcacttgtc gtgcatctca gtccattagc 60

tcttggctgg catggtatca acagaaacca ggtaaagctc cgaaactgct gatctacaaa 120

gcatctagcc tggaatctgg tgtaccgtct cgctttagcg gttctggtag cggtactgag 180

ttcactctga ccatcagctc tctgcaaccg gatgacttcg caacttacta ctgtcaacag 240

tacaagagct atccgtacac tttcggtcca ggtaccaaac tggagatcaa aggtggttct 300

ggtggcggtg gtgaagtgca actggttcag tctggtggtg gactggtcaa gcctggtggt 360

tctctgcgtt tgtcctgtgc agcttctggt ttcaccttca gctctcatac tctgaactgg 420

gtacgtcaag ctccaggtaa aggtctggaa tgggtctcta gcattggtgg ctctggtaat 480

cacatctact acaccgatag cgtgaaaggt cgtttcacca tctctcgtga caacgctcgc 540

aaatctctgc atctggagat gaactctctg actgctgaag acactgctgt gtactattgt 600

gcacgtatgg ttggtagcta ctcttggtac ttcgactat 639