肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1及其检测方法

摘要

本发明提供了肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1的突变形式，其序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1的检测方法，该检测方法是基于PTPN1致病基因片段的扩增和其Sanger测序，主要涉及SEQ ID NO:2‑SEQ ID NO:3序列所示扩增引物对。本发明提供的PTPN1致病基因形式尚未被报道，其可以为肥胖男性生精障碍致病机理的解析、致病基因检测以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础；所构建的PTPN1致病基因检测方法具有准确可靠、简便快捷的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因及其检测方法，特别涉及肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1及其检测方法。

背景技术

在生育年龄的男性中约有5%存在不育问题，其中的40％属于精子质量异常，主要表现为少精症、无精症和精子活力差等生精障碍。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由众多相关基因控制，这些基因发生异常就会影响精子的形成从而造成男性不育。目前认为生精相关基因的突变、插入/缺失和遗传多态性是男性生精障碍的重要遗传病因，然而其中大部分生精相关基因尚未得到解析。因此探究男性生精障碍致病基因特征十分有必要，这是揭示男性不育遗传机制、致病基因检测以及针对性预防和治疗的基础。近年来，随着二代测序技术的发展和测序成本的降低，可以实现在基因组层面上对疾病致病基因的研究。然而由于疾病往往存在复杂性，因此必须将二代测序结果和基本体征以及临床信息相结合从特定的疾病亚群入手更好地解析其致病基因特征。

本发明申请人从25例生精障碍患者样本的全外显子组测序结果中发现，有3例患者都出现了PTPN1基因的c.69571A>G突变，而同时此3例患者均为肥胖体征。经进一步验证，本发明申请人首次揭示了基因PTPN1为肥胖男性生精障碍相关基因并提供了其致病突变形式，在此基础上构建了基于PCR扩增和Sanger测序的突变检测方法。

发明内容

本发明提供了肥胖男性生精障碍亚群对应的致病基因，并在此基础上构建了致病基因的检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的之一在于提供肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1，突变所在片段序列如SEQ ID NO:1所示，对应的突变为c.69571A>G，发生在Exon8中；所述突变基因形式经验证，为肥胖男性生精障碍致病基因。值得注意的是，SEQ ID NO:1仅展现出c.69571A>G突变所在的片段序列，基因的其余序列详见GeneBank上登录号NG_012119.1的野生型参考基因序列，c.69571A>G表示的是PTPN1基因的69571位点的A突变成G。

其中，所述肥胖男性生精障碍致病基因的揭示，可以但不限于用于制备肥胖男性生精障碍诊断芯片和试剂盒、构建肥胖男性生精障碍检测方法以及制备肥胖男性生精障碍治疗药物。

本发明的另一目的在于提供肥胖男性生精障碍致病基因突变检测方法，主要是利用SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3所示引物对扩增PTPN1致病基因片段，并对扩增产物进行Sanger测序以判断是否发生c.69571A>G突变。

其中，SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3所示引物对扩增的是c.69571A>G突变所在的基因片段，扩增片段对应于GeneBank上登录号NG_012119.1的野生型参考基因序列的69310-69680，扩增片段长度为371bp。致病基因PTPN1片段的扩增引物对SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3可应用于制备肥胖男性生精障碍诊断芯片和试剂盒以及构建男性生精障碍检测方法中。

本发明提供了PTPN1基因引起的肥胖男性生精障碍的c.69571A>G突变基因形式，以及基于PCR扩增和Sanger测序的致病基因检测方法，这些可以为其致病机理的解析、致病基因检测以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础。

附图说明

图1是PTPN1突变基因扩增片段的Sanger测序图谱中突变位点局部，途中箭头指向处为突变位点。此结果对应于实施例1中的P1号患者，为PTPN1基因的c.69571A>G突变测序局部。

图2是实施例1中P1号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，P1号患者为图中II1。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心表示生精障碍个体，空心表示正常个体,“”表示肥胖体征；图中“+”表示PTPN1基因扩增片段检出c.69571A>G突变，“-”表示PTPN1基因扩增片段未检出c.69571A>G突变；I和II分别代表第1和2代，数字为成员编号。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

选择临床检查确诊的25名男性生精障碍患者在其签署了知情同意书的情况下，进行基因检测和分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，实施例涉及少精和弱精等生精障碍患者的诊断以及肥胖等的判定依据现有的常规临床和体征标准。

（1）男性生精障碍患者的基因突变测定

取男性患者的肘部静脉血5ml，利用德国Qiagen公司的QIAamp血液基因组提取试剂盒提取待测患者样本基因组DNA，检测合格后将其送华大基因进行全外显子捕获测序。全外显子测序建库采用的是美国Agilent公司的SureSelect Human All Exon Kit V1试剂盒，二代测序仪是美国Illumina公司的Hiseq2500，测序的平均深度超过500×。针对原始测序数据，利用dbSNP数据库，千人基因组数据库和8个HapMap 外显子组数据库等数据库过滤无效和多态性信息确定突变位点信息。

（2）特定体征的男性生精障碍患者亚群界定

选择25例男性生精障碍患者中具有相同的特定基因突变的亚群，同时需要满足亚群中患者数不少于3例且能找到共同的体征。对照基因突变结果，结合经询问和临床常规检查检测等得知的患者信息，发现存在肥胖患者亚群（共3例编号P1、P2和P3）且均含有PTPN1基因的c.69571A>G突变，具体结果如表1所示。P1-P3这3例患者均为成年男性（平均年龄为26岁），其体重指数均大于30（健康成年人体重指数正常标准在18.25到25之间），诊断为肥胖。此3例患者的PTPN1基因均发生了c.69571A>G突变，所在基因片段序列如SEQ ID NO:1所示。其余22例非肥胖患者并无PTPN1基因的c.69571A>G突变检出，可以视为对照。

经文献查询和数据库比对发现，肥胖男性生精障碍患者PTPN1基因的c.69571A>G突变为本发明首次报道。PTPN1基因即人类蛋白酪氨酸磷酸酶N1基因，该基因编码的PTP1B蛋白参与胰岛素信号传导通路的调控。有研究显示，PTPN1基因敲除的小鼠不仅胰岛素敏感性增强，对饮食诱导的肥胖有很强的抵抗作用。然而，并未有该基因与肥胖男性生精障碍相关的研究报道。

表1 3例肥胖男性生精障碍患者基因检测及验证结果

患者编号基因突变情况Sanger测序结果家系分离序列P1PTPN1c.69571A>G图1，一致是SEQ ID NO.1P2PTPN1c.69571A>G参见图1，一致是SEQ ID NO.1P3PTPN1c.69571A>G参见图1，一致是SEQ ID NO.1

针对上述c.69571A>G突变，采用SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3所示的引物对进行基因片段扩增。扩增体系详见表2，扩增片段对应于GeneBank上登录号NG_012119.1的野生型参考基因序列的69310-69680，扩增片段长度为371bp。

表2 扩增体系

编号组份添加量110X PCR buffer(Mg²⁺)2.5ul2dNTP Mix(10mM)2ul3上游引物(10uM)1ul4下游引物(10uM)1ul5rTaq0.2ul6Template DNA(30ng/ul)1ul7灭菌ddH₂O17.3ul

扩增条件为：94℃预变性3min；30个循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸5min。

P1-P3这3例患者PTPN1基因扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。Sanger测序结果发现均与二代测序结果一致（图1，表1）。

（3）家系分析验证致病基因突变

由于所述PTPN1基因的c.69571A>G突变未被报道，因此收集P1-P3这3例肥胖男性生精障碍患者家系相关成员血样，PCR扩增PTPN1基因片段再进行Sanger测序。以P1号患者为例，该患者存在PTPN1基因的c.69571A>G突变。如图2所示患者P1是II1，该患者29岁，结婚2年半妻子未孕就诊；经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1300万个为少精，父母健在且有一26岁未婚弟弟。此家庭4人经常规体检，发现患者P1和其母亲以及其弟弟均为肥胖（体重指数分别为36、32、34），其父亲不肥胖（体重指数为22）。采集患者的父母和弟弟血液样本提取基因组DNA，参照（2）中条件利用SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3所示引物对扩增PTPN1基因片段，Sanger测序显示患者母亲和弟弟也都存在c.69571A>G突变，而其父亲无该位点突变。结果表明肥胖体征者均含有PTPN1基因的c.69571A>G突变，且携带c.69571A>G突变的男性同时出现生精障碍，而女性本就不产生精子因此无此症状。

表1中的其余2例即P2-P3患者也出现了PTPN1基因的c.69571A>G突变（具体详见表1），分析其家系也是肥胖体征者均含有PTPN1基因的c.69571A>G突变，且携带c.69571A>G突变的男性同时出现生精障碍。即出现了基因型-表型的家系共分离现象，由此证明了PTPN1基因是肥胖男性生精障碍的相关基因，其致病性突变为c.69571A>G，其所在片段序列如SEQID NO:1所示。

实施例2

另外收集肥胖男性生精障碍患者10例、非肥胖男性生精障碍患者20例以及肥胖但非生精障碍男性10例，将其血样进行基因组提取。对于每例样本，参照实施例1中的体系和方法扩增所述PTPN1致病基因片段；扩增产物均进行测序分析。结果只发现了10例肥胖男性生精障碍患者均出现了PTPN1基因的c.69571A>G突变，相关数据如表3所示。

表3 10例肥胖男性生精障碍患者PTPN1基因片段测序结果

样本编号突变情况序列A1c.69571A>GSEQ ID NO:1A2c.69571A>GSEQ ID NO:1A3c.69571A>GSEQ ID NO:1A4c.69571A>GSEQ ID NO:1A5c.69571A>GSEQ ID NO:1A6c.69571A>GSEQ ID NO:1A7c.69571A>GSEQ ID NO:1A8c.69571A>GSEQ ID NO:1A9c.69571A>GSEQ ID NO:1A10c.69571A>GSEQ ID NO:1

10例肥胖生精障碍患者均出现了PTPN1基因的c.69571A>G突变，而在20例非肥胖男性生精障碍患者和10例肥胖但非生精障碍男性均不存在PTPN1基因的c.69571A>G突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的PTPN1基因的c.69571A>G突变形式为肥胖男性生精障碍致病基因，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。

基于本发明新鉴定的PTPN1基因的c.69571A>G致病突变形式，本发明申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，菌液存于终浓度20%（V/V）甘油的冻存管中，置于-80℃冰箱中长期保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。

虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>黄志玲

<120>肥胖男性生精障碍致病基因PTPN1及其检测方法

<160>3

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>371

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

tcatgcaaag ggatttcctg acaaaccagc cgaagtgaac actaatagga cttcctcttg60

ctgctctttc aaggatcagt ggaaggagct ttcccacgag gacctggagc ccccacccga 120

gcatatcccc ccacctcccc ggccacccaa acgaatcctg gagccacaca atgggaaatg 180

cagggagttc ttcccaaatc accagtgggt gaaggaagag acccaggagg ataaagactg 240

ccccatcaag gaagaaaaag ggagcccctt aaatgccgca ccctacggca tcgaaaggta 300

atatgattgg gtcccagctt gttggggtga ggggaaatga ctttctgttc tagaaacaca 360

cgctggtact g371

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

tcatgcaaag ggatttcctg20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

cagtaccagc gtgtgtttct20