高分子量聚氧乙烯衍生物的基质辅助激光解吸质谱分析法

摘要

为了获得比传统的高分子量聚乙二醇衍生物的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱分析法具有更高强度的信号，提供了一种MALDI质谱分析法，其中用激光束照射分子量为40,000以上的聚乙二醇衍生物和基质的混合物以一起蒸发聚乙二醇衍生物和基质，从而确定聚乙二醇衍生物的分子量。该MALDI质谱分析法的特征在于：作为所述基质，使用1‑辛醇/水分配系数(logPow)为4.1～4.8的低极性基质。

说明书

技术领域

本发明涉及高分子量聚乙二醇衍生物的基质辅助激光解吸(以下称作MALDI)质谱分析法。

背景技术

MALDI质谱分析法是用激光束照射基质和聚合物的混合物以使聚合物和基质一起蒸发并电离，从而测量聚合物的分子量的分析方法。基质在MALDI质谱分析法中的作用包括将激光束的能量传递至聚合物，从而电离聚合物。因此，基质和聚合物之间的亲和性是重要的。作为亲和性的指导，推荐使用例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)或者2,5-二羟基苯甲酸(DHB)的高极性基质，用于例如聚乙二醇(PEG)的高极性聚合物的测量。此外，已经推荐使用例如蒽三酚或者维甲酸(RA)的低极性基质，用于例如聚苯乙烯(PS)的低极性聚合物的测量(非专利文献1和2)。此外，已经报道在具有10,000分子量的聚乙二醇的MALDI质谱分析法中，作为高极性基质的CHCA是最好的(非专利文献3)。

另一方面，公知的是通过MALDI质谱分析法测量高分子量聚合物是困难的。这是因为，由于随着分子量增加电离变得困难，所以必须增加照射的激光强度，但是倾向于发生聚合物分子由于激光照射的分解。因此，举例来说，在聚乙二醇的情况下，仅报道了分子量25,000以下的聚乙二醇的测量结果(非专利文献2)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Chemical Reviews,2001,vol.101,pp 527-569

非专利文献2：Mass Spectrometry Reviews,1999,vol.18,pp309-344

非专利文献3：Analytical Chemistry,2004,vol.76,pp 5157-5164

发明内容

本发明要解决的问题

如上所述，难以通过MALDI质谱分析法测量高分子量聚乙二醇衍生物的分子量。此外，特别地，在聚合物具有分支结构的情况下，显著地观察到由于激光照射的分解并且在很多情况下信号强度不足。因此，期望能通过MALDI质谱分析法测量高分子量聚乙二醇衍生物的分子量。

本发明的目的是为使得能够在高分子量聚乙二醇衍生物的MALDI质谱分析法中获得比之前具有更高强度的信号。

解决问题的手段

本发明包括下列项目。

(1)一种基质辅助激光解吸质谱分析法，在该质谱分析法中，用激光束照射包含分子量为40,000以上的聚乙二醇衍生物和基质的混合物以一起蒸发所述聚乙二醇衍生物与所述基质，从而测量所述聚乙二醇衍生物的分子量，其中，使用1-辛醇/水分配系数(logPow)为4.1～4.8的低极性基质作为所述基质。

(2)如(1)所述的基质辅助激光解吸质谱分析法，其中，所述聚乙二醇衍生物的分子量为60,000以上。

(3)如(1)或(2)所述的基质辅助激光解吸质谱分析法，其中，所述基质为反-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈。

(4)一种基质，该基质在分子量为40,000以上的聚乙二醇衍生物的基质辅助激光解吸质谱分析法中使用，该基质为1-辛醇/水分配系数(logPow)为4.1～4.8的低极性基质。

(5)如(4)所述的基质，其中，所述聚乙二醇衍生物的分子量为60,000以上。

本发明的优点

发明人发现：在通过MALDI质谱分析法测量作为高极性聚合物的聚乙二醇衍生物的分子量的情况下，当聚乙二醇衍生物具有40,000以上的高分子量时，通过使用如上所述的低极性基质，抑制了聚合物的分解并且能够获得足够的信号强度，由此完成本发明。

通过使用根据本发明的MALDI质谱分析法，抑制了高分子量的聚乙二醇衍生物的分解并且能够获得高信号强度，使得根据本发明的MALDI质谱分析法由于能够适用于开发和质量控制，所以对工业极为有用。

此外，在本发明之前，已经推荐使用例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)或者2,5-二羟基苯甲酸(DHB)的高极性基质用于例如聚乙二醇(PEG)的高极性聚合物的测量，并且已经报道了通过使用高极性聚合物获得的分析结果更好。

附图说明

图1是示出实施例1中获得的质谱的图表。

图2是示出比较例中1-1获得的质谱的图表。

图3是示出比较例中1-2获得的质谱的图表。

图4是示出实施例2中获得的质谱的图表。

图5是示出比较例中2-1获得的质谱的图表。

图6是示出比较例中2-2获得的质谱的图表。

图7是示出实施例3中获得的质谱的图表。

图8是示出比较例中3-1获得的质谱的图表。

图9是示出比较例中3-2获得的质谱的图表。

图10是示出实施例4中获得的质谱的图表。

图11是示出比较例中4-1获得的质谱的图表。

图12是示出比较例中4-2获得的质谱的图表。

图13是示出实施例5中获得的质谱的图表。

图14是示出比较例中5-1获得的质谱的图表。

图15是示出比较例中5-2获得的质谱的图表。

图16是示出实施例6中获得的质谱的图表。

图17是示出比较例中6-1获得的质谱的图表。

图18是示出比较例中6-2获得的质谱的图表。

具体实施方式

以下将详细描述本发明。

作为本发明分析目标的聚乙二醇衍生物可以直链或者分支的。根据本发明的分析方法，与传统的MALDI质谱分析法不同，由于特别地即使在具有分支结构的聚乙二醇衍生物的情况下，也能抑制其分解并且能够测量其分子量，所以对于聚乙二醇衍生物优选的是具有分支结构和两个以上聚乙二醇链。聚乙二醇链的数量没有上限，并且例如，即使在聚乙二醇衍生物具有最多8个聚乙二醇链时也能进行分析。更典型地，聚乙二醇衍生物中聚乙二醇链的数量为2、3、4、6或8个。

聚乙二醇衍生物的分子量为40,000以上。另外，聚乙二醇衍生物的分子量可以为60,000以上。此外，聚乙二醇衍生物的分子量优选为1,000,000以下，并且更优选为200,000以下。根据本发明的分析方法，不同于使用高极性基质的传统的测量方法，即使在聚乙二醇衍生物具有高分子量的情况下也能够进行准确度高的分析。

在聚乙二醇衍生物具有40,000以上的分子量的情况下，与现有技术的说明相反，当使用高极性基质时信号强度减小。

作为本发明分析目标的聚乙二醇衍生物优选以式(1)和(2)表示。

在所述式中，Z是从具有2～8个羟基的化合物去除所有羟基而获得的残基。

OA¹、OA²和OA³各自为氧乙烯基，并且a、b和c各自为0～5,000(优选为0～3,000，并且更优选为0～1,000)。

L¹、L²和L³各自独立地为亚烷基，该亚烷基可以在亚烷基链中或者在末端具有酯键、氨基甲酸酯键、酰胺键、脲键、醚键或者硫醚键。在一个分子中，L¹、L²和L³可以是相同或者不同的。

p、q和r各自独立地为0或者1。

s和t各自独立地为0～8(特别优选为2、3、4、6或者8)。

X¹、X²和X³各自独立地代表羟基，例如甲氧基、叔丁氧基或者苄氧基的烷氧基，或者能够与例如蛋白质、多肽或者药物的生物活性物质特异性地反应的活性基团。在一个分子中，X¹、X²和X³可以是相同或者不同的。

活性基团具体包括，例如醛基、缩醛基、硝基苯基碳酸酯基、琥珀酰亚胺基碳酸酯基、琥珀酰亚胺基酯基、巯基、马来酰亚胺基、烯基、炔基、叠氮基、氨基和羧基，并且优选为包括例如醛基、硝基苯基碳酸酯基、琥珀酰亚胺基碳酸酯基、琥珀酰亚胺基酯基、巯基、马来酰亚胺基、炔基、叠氮基、氨基和羧基。

本发明中能够使用的用于MALDI质谱分析法的低极性基质为1-辛醇/水分配系数为4.1～4.8(更优选为4.3～4.8)的低极性基质。基质的1-辛醇/水分配系数为通过OECD测试指南117中描述的高效液相色谱法测量的数值。

作为本发明中使用的低极性基质，可以使用由碳、氢和氮3种元素构成的芳香化合物。特别优选地，例示了反-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈。

不特别限定聚乙二醇衍生物与MALDI质谱分析法的基质的比率。聚乙二醇衍生物：MALDI质谱分析法的基质的比率优选为1：100(摩尔比)～1：1,000,000(摩尔比)，并且更优选为1：500(摩尔比)～1：100,000(摩尔比)。

在用于本发明的分析的样品的制备方法中，作为能够用于制作包含MALDI质谱分析法的基质和聚乙二醇衍生物的液体的溶剂，理想的溶剂是能够溶解MALDI质谱分析法的基质和聚乙二醇衍生物的溶剂。具体地，所述溶剂包括例如，四氢呋喃、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、六氟异丙醇、丙酮、甲乙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳。此外，溶剂可以单独使用或作为两种以上的混合物使用。当用于MALDI质谱分析法的基质或者聚乙二醇衍生物溶解在所述溶剂中时，浓度优选为1～100mg/mL。

用于MALDI质谱分析法的基质可以包含电离剂。电离剂具体地包括，例如金属盐、铵盐和有机盐，例如三氟乙酸钠、三氟乙酸银、硝酸铜、氯化钠和氯化钾。

关于包含的电离剂与用于MALDI质谱分析法的基质的比率，电离剂：用于MALDI质谱分析法的基质的比率优选为1：1(摩尔比)～1：10,000(摩尔比)，并且更优选为1：10(摩尔比)～1：5,000(摩尔比)。

在电离剂溶解于溶剂中之后，可以与用于MALDI质谱分析法的基质混合，并且在此情况下，溶解于溶剂中的电离剂的浓度优选为大约0.1～100mg/mL。

通过用于本发明的分析的样品的制备方法如此制备的用于MALDI质谱分析法的样品，即使在激光强度减弱时也能提供高信号强度。因此，由于使用通过用于本发明的分析的样品的制备方法制备的用于MALDI质谱分析法的样品进行的MALDI质谱分析法抑制聚合物的分解并且能够测量精确的分子量，因此其能够适用于聚乙二醇衍生物的质量控制。

实施例

将参考实施例更详细地描述本发明。

(实施例1)

反-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈(Santa Cruz Co.，纯度99％以上，1-辛醇/水分配系数为4.6)用作用于MALDI质谱分析法的基质，分支的聚乙二醇衍生物SUNBRIGHT GL2-600HO(NOF制造，分子量为60,000，如下所示的化合物1)用作样品，并且三氟乙酸钠用作电离剂。用于MALDI质谱分析法的基质的四氢呋喃溶液(浓度为20mg/mL)、分支的聚乙二醇衍生物的四氢呋喃溶液(浓度为60mg/mL)和三氟乙酸钠(电离剂)的四氢呋喃溶液(浓度为2mg/mL)以100：1：2(体积比)混合。

用微量吸液管在MALDI质谱分析法的靶标上滴1μL用于MALDI质谱分析法的基质、分支的聚乙二醇衍生物和电离剂的混合液并干燥。将靶标插入Bruker Daltonics Inc.制造的AutoFlex III型MALDI质谱仪中。然后，在20.0kV的加速电压下，在2,500次激光冲击的整合(integration)的正电离模式中，通过适当调整激光强度进行测量。确定信号强度的评价以使用获得的质谱中的峰顶的信号强度。

在使用实施例1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为10,389次计数(count)。实施例1中获得的质谱图如图1所示。

(比较例1-1)

除了使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA，1-辛醇/水分配系数为0.9)作为基质之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例1-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为978次计数。比较例1-1中获得的质谱图如图2所示。

(比较例1-2)

除了使用2,5-二羟基苯甲酸(DHB，1-辛醇/水分配系数为0.6)作为基质之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例1-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例1-2中获得的质谱图如图3所示。

[表1]

信号强度实施例110,389比较例1-1978比较例1-20

(实施例2)

除了使用浓度为80mg/mL的SUNBRIGHT GL4-800HO(NOF制造，分子量为80,000，如下所示的化合物2)的四氢呋喃溶液之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用实施例2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为23,734次计数。实施例2中获得的质谱图如图4所示。

(比较例2-1)

除了使用CHCA作为基质之外，在与实施例2相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例2-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为2,005次计数。比较例2-1中获得的质谱图如图5所示。

(比较例2-2)

除了使用DHB作为基质之外，在与实施例2相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例2-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例2-2中获得的质谱图如图6所示。

[表2]

信号强度实施例223,734比较例2-12,005比较例2-20

(实施例3)

除了使用浓度为40mg/mL的SUNBRIGHT MEH-40T(NOF制造，分子量为40,000，如下所示的化合物4)的四氢呋喃溶液之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用实施例3的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为1,390次计数。实施例3中获得的质谱图如图7所示。

H-(OCH₂CH₂)₉₀₈-OMe

化合物4

(比较例3-1)

除了使用CHCA作为基质之外，在与实施例3相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例3-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为39次计数。比较例3-1中获得的质谱图如图8所示。

(比较例3-2)

除了使用DHB作为基质之外，在与实施例3相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例3-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例3-2中获得的质谱图如图9所示。

[表3]

信号强度实施例31,390比较例3-139比较例3-20

(实施例4)

除了使用浓度为40mg/mL的SUNBRIGHT ME-400GS(NOF制造，分子量为40,000，如下所示的化合物5)的四氢呋喃溶液之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用实施例4的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为1,971次计数。实施例4中获得的质谱图如图10所示。

(比较例4-1)

除了使用CHCA作为基质之外，在与实施例4相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例4-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下的信号强度为39次计数。比较例4-1中获得的质谱图如图11所示。

(比较例4-2)

除了使用DHB作为基质之外，在与实施例4相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例4-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例4-2中获得的质谱图如图12所示。

[表4]

(实施例5)

除了使用浓度为40mg/mL的SUNBRIGHT GL2-400HO(NOF制造，分子量为40,000，如下所示的化合物6)的四氢呋喃溶液之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用实施例5的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为4,469次计数。实施例5中获得的质谱图如图13所示。

(比较例5-1)

除了使用CHCA作为基质之外，在与实施例5相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例5-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为85次计数。比较例5-1中获得的质谱图如图14所示。

(比较例5-2)

除了使用DHB作为基质之外，在与实施例5相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例5-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例5-2中获得的质谱图如图15所示。

[表5]

(实施例6)

除了使用浓度为40mg/mL的SUNBRIGHT PTE-40000(NOF制造，分子量为40,000，如下所示的化合物7)的四氢呋喃溶液之外，在与实施例1相同的条件下进行测量和评价。在使用实施例6的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，信号强度为10,138次计数。实施例6中获得的质谱图如图16所示。

(比较例6-1)

除了使用CHCA作为基质之外，在与实施例6相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例6-1的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下的信号强度为564次计数。比较例6-1中获得的质谱图如图17所示。

(比较例6-2)

除了使用DHB作为基质之外，在与实施例6相同的条件下进行测量和评价。在使用比较例6-2的用于MALDI质谱分析法的样品的制备方法的情况下，未检测到信号。比较例6-2中获得的质谱图如图18所示。

[表6]

信号强度实施例610,138比较例6-1564比较例6-20

虽然已经参考其具体实施例详细地描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，能够在不背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明进行各种变化或修改。

本申请基于2015年3月31日提交的日本专利申请(日本专利申请No.2015-071739)，并且其全部内容通过引用并入本申请。另外，本文引用的所有文献作为整体并入本申请。