一种超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法

摘要

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种超高效液相色谱‑四级杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC‑Q Exactive)检测白酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的方法。本发明采用氮吹除醇，超纯水定容过膜后，直接进UPLC‑Q Exactive定量检测。本方法前处理简单且避免了乙醇对质谱稳定性的干扰，分析过程中基本无有机溶剂，可用于各种酒精度较高且EC含量极少的白酒中氨基甲酸乙酯的检测定量分析。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种超高效液相-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法。

技术背景

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)又名脲烷，具有基因毒性和致癌性，国际癌症研究机构(IARC)将其定为“2A”级致癌物。氨基甲酸乙酯不仅是烟草叶和香烟的天然成分，也是发酵食品和酒精饮料的副产物。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料。对于长期饮用酒精饮料的人们，氨基甲酸乙酯在体内积累，无疑增加了致癌的风险。对此，1985年，加拿大卫生与福利院组织规定了各类酒中的EC限量标准：佐餐葡萄酒30μg/L，强化葡萄酒100μg/L，蒸馏酒150μg/L，水果白兰地400μg/L，清酒100μg/L，随后欧美等国家也相继提出来各种酒类中的限量标准。但目前国际上尚无统一限量，主要以加拿大EC限量作为主要参照。

目前测定酒中氨基甲酸乙酯的前处理方法主要有衍生法、液-液萃取法、固相微萃取法、固相萃取法四种，其中衍生法需要使用衍生试剂9-羟基吨，该方法虽操作简单，但衍生时间长；液-液萃取法虽无需贵重仪器，但需要使用大量有机溶剂、乳化现象严重且操作系统误差大，方法的精密度及准确度较低；固相微萃取法虽简便快速环保，且不需要萃取溶剂，但方法的精密度和准确度较低、成本高；固相萃取法准确度高，重复性好，但溶剂用量大、对操作者要求高^[1]。

酒类中氨基甲酸乙酯的仪器检测方法主要有HPLC法、GC-MS法、LC-MS法等，但这些方法有的需要对样品进行复杂的前处理，耗时费力；有的分析时间长，需要消耗一定量的有机溶剂，对操作者的身体健康有不良影响，不经济环保；有的因乙醇的存在对质谱稳定性有严重影响。

也有人采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中的氨基甲酸乙酯，其方法为将白酒稀释后以降低基质效应再进行EC的检测，然而，由于白酒中酒精浓度较高，为了降低基质效应，需要进行高倍稀释，高倍稀释虽然可以减轻基质效应，同时也会降低方法的检出能力，且目标物峰形较差^[2]。练顺才等^[3]采用了减压蒸馏法除去样品中的乙醇，操作复杂，费时费力，且加标回收率或高或低，蒸馏后样品中的乙醇含量难控制，使EC定量存在较大的误差。

上述前处理方法和仪器分析方法，或者需要大量的溶剂，或者需要复杂的前处理，或者精密度和准确度低，无一能够满足快速、简单、环保、精确的氨基甲酸乙酯的分析需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白酒中氨基甲酸乙酯含量分析的前处理方法。

本发明的目的还在提供一种超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法。

本发明的目的还在于提供一种不需要有机溶剂、环保、安全的白酒中氨基甲酸乙酯含量的分析方法。

本发明的目的在于提供一种无乙醇对质谱稳定性的干扰，可以快速、准确、稳定、批量的对白酒中的痕量氨基甲酸乙酯进行定性定量分析方法。

本发明的上述目的具体是通过以下技术方案得以实现的：

一种超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒中氨基甲酸乙酯含量的方法，其包含以下步骤：

(1)取样：量取一定体积的白酒，如1～5mL；

(2)氮吹除醇：在15～30℃以下氮吹至乙醇除净，剩余体积为原体积的30-50％；

(3)定容：用超纯水定容到原体积的0.5～5倍；

(4)过滤：采用0.22μm微孔滤膜过滤；

(5)过滤后的液体进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析：

其中，步骤(2)中，作为优选的实施方式，氮吹除醇条件为：在氮吹25℃下氮吹至原酒样体积的40％；

其中，步骤(3)中，作为优选的实施方式，定容条件为：用超纯水定容到原体积的2倍；

其中，步骤(5)中，超高效液相色谱条件为：Thermo Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)色谱柱，检测温度20～50℃，进样量1-10μL，0.05～0.30％(v/v)甲酸水。作为流动相进行等度洗脱；流速为200～400μL/min。

作为优选的实施方式，高效液相色谱条件为：检测温度50℃，进样量10μL，0.08～0.12％(v/v)甲酸水溶液作为流动相进行等度洗脱，分析时间5min；流速为300μL/min。作为更优选的实施方式，采用0.10％(v/v)甲酸水溶液作为流动相。

其中，步骤(5)中，质谱条件如下：采用加热HESI源，正离子模式，源参数：毛细管电压3.1kv，鞘气35arb(1arb≈0.3L/min)，辅助气20arb，吹扫气3arb，雾化温度170℃，扫描范围50-100，分辨率70000，扫描模式Full MS/dd-ms2。

作为优选的实施方式，源参数为：鞘气35arb(1arb≈0.3L/min)，辅助气20arb，吹扫气3arb。

其中，所述氨基甲酸乙酯分子离子[M+H]+90.05540为定量离子，特征离子m/z62.0240为定性离子。

本发明的有益效果：

(1)前处理简单：仅采用氮吹除醇、定容、过滤。

(2)安全环保：前处理和进样过程中基本没有使用到有机溶剂，采用超纯水定容，流动相中基本也为超纯水，整个分析过程中不会对人类健康产生影响，环境友好。

(3)快速、准确、灵敏度高：利用氮吹除醇完全避免乙醇对质谱稳定性的干扰，高分辨质谱准确定定量样品中痕量氨基甲酸乙酯，且无需进行梯度洗脱，整个分析过程中仅需采用一种流动相。

附图说明

图1氨基甲酸乙酯的二级质谱图；

图2不同色谱柱对于分析效果的影响，从左到右依次为色谱柱1～色谱柱4；

图3洗脱条件1～4对于分析效果的影响，从上到下依次为：洗脱条件1～洗脱条件4；

图4不同定容体积对目标物分析效果的影响；

图5氮吹除醇后剩余不同体积对于分析效果的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

氨基甲酸乙酯购于美国Sigma公司；甲酸及甲醇、乙腈(LC-MS级)购于美国TEDIA公司。

超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo FisherScientific)、分析天平(METTLER TOLEDO XP205)、纯水仪(艾科浦RM-220)，氮吹器(日本日立)。

色谱柱：Agilent的Eclipse Plus C18(50×2.1mm，1.8μm)、Eclipse Plus C18(50×2.1mm，1.8μm)、Eclipse XDB-C18(150×2.1mm，3.5μm)；Thermo的Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)

实施例1采用色谱柱(Thermo Hypersil GOLD aQ)测定白酒中的氨基甲酸乙酯含量

实验方法：

标准溶液的配制

准确称取氨基甲酸乙酯标准品0.2000g于100mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成2000mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。

样品前处理方法

量取1mL的白酒，25℃氮吹至0.4mL，用超纯水定容至原来的体积2倍，0.22μm微孔滤膜过滤；取滤液2mL进样瓶中进行超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析。

仪器方法

超高效液相色谱条件为：Thermo的Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)色谱柱，检测温度50℃，进样量10μL；流动相为0.10％(v/v)甲酸水溶液，流速为300μL/min，等度洗脱，分析时间5min。

质谱条件如下：采用加热HESI源，正离子模式，源参数：毛细管电压3.1kv，鞘气35arb(1arb≈0.3L/min)，辅助气20arb，吹扫气3arb，雾化温度170℃，扫描范围50-100，分辨率70000，扫描模式Full MS/dd-ms2。

氨基甲酸乙酯分子离子[M+H]+90.05540为定量离子，特征离子m/z62.0240为定性离子。

结果与讨论

1、流动相流速优化

本实验考察了200、300、400μL/min三种流速对色谱行为的影响。以300μL/min为流速，目标物峰宽窄，峰形好，与干扰物分离度好。以200μL/min为流速时，虽然目标物与干扰物分离度更大，但峰宽达0.8～1min；以400μL/min为流速时，压力大，不利于色谱柱长时间使用。所以流速300μL/min为最优流速。

2、质谱条件优化

分别在正离子模式和负离子模式下对氨基甲酸乙酯标液进行扫描，发现在正离子模式下EC分子离子[M+H]+(母离子)的丰度最强，通过优化质谱参数获得较强的质谱信号。氨基甲酸乙酯[M+H]+母离子的精确理论质量数为90.05496，而实验中实际质量数为90.05540，对母离子施加碰撞能量，获得其二级质谱图，结果见图1。由于EC相对分子质量较小，结构简单，经质谱碰撞碎裂后只得到一个较明显的特征碎片离子，其特征子离子为62.0240，可能原因是由于α-裂解和γ-重排作用使EC丢失C₂H₄基团，最终产生m/z62.0240碎片离子。

3、方法学评价

(1)线性范围和检出限

分别配制质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0μg/L的氨基甲酸乙酯标准溶液，以上述仪器条件下进行测定，采用外标法定量。以目标物的浓度为纵坐标Y(μg/L)、母离子的色谱峰面积为横坐标(X)，绘制标准曲线，得到线性方程：y＝5E-06x-0.891，R²＝0.9994，线性范围2.0～400.0μg/L。以信噪比(S/N)为3计算得到氨基甲酸乙酯的检出限(LOD)为0.19μg/L，信噪比(S/N)为10计算得定量限(LOQ)为0.64μg/L。

(2)回收率

在待测酒样中加入EC标准溶液，使其配制成加标浓度为20.0、50.0、100.0μg/L的加标样品，按上述方法进行前处理，然后进仪器分析，每个添加水平做3次平行，最后计算平均回收率，验证方法的准确度，结果见表1。对于3种不同的加标量，回收率在99.2％～101.2％之间，相对标准偏差(RSD)在0.6％～1.2％范围内。可见此方法检测白酒中的氨基甲酸乙酯具有良好的回收率，前处理方法对待测样品基本上无损失。

表1.样品加标回收实验结果

(3)精密度和稳定性实验

分别配制两种EC浓度为10.0、50.0μg/L的标准溶液，重复测定6次；随机取一样品，按上述方法进行样品前处理，平行样品6份，进仪器分析。分别验证仪器与方法的精密度和稳定性，结果见表4，从表中可看出浓度为10.0、50.0μg/L的标样RSD值分别为1.6％、0.8％，样品的相对标准偏差RSD值为1.1％，表明该方法具有良好的精密度和稳定性。

表2 方法的精密度和稳定性

实施例2采用色谱柱(Thermo Hypersil GOLD aQ)测定白酒中的氨基甲酸乙酯含量

实验方法同权利要求1，有以下不同点：

进样量1μL；

质谱条件：源参数：毛细管电压3.1kv，鞘气40arb(1arb≈0.3L/min)，辅助气10arb，吹扫气0arb，雾化温度170℃，扫描范围50-100，分辨率70000，扫描模式Full MS/dd-ms2。

实施例3不同色谱柱的选择对分析效果的影响

现有技术中，对氨基甲酸乙酯分析采用的柱子一般为Poroshell 120EC-C18、ZORBAX SB-C18等，而本发明在实验中，发现这些柱子对于氨基甲酸乙酯分离效果和保留相对较差。因此，本发明结合氨基甲酸乙酯的结构特性，选择了Agilent的Eclipse Plus C18(50×2.1mm，1.8μm)、Eclipse XDB-C18(150×2.1mm，3.5μm)、Eclipse XDB-C18(100×2.1mm，1.8μm)和Thermo的Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)4种色谱柱对化合物进行测试。

实验方法如下：

1.实验步骤同实例1,不同之点如下：

色谱柱：Eclipse Plus C18(50×2.1mm，1.8μm，Agilent)

超高效液相色谱流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液，B为乙腈，流速为300μL/min，洗脱程序见表3。

表3 流动相线性洗脱条件

时间(min)A％B％流量(μL/min)0.0090103000.5090103002.5010903008.0010903008.109010300109010300

2.实验步骤同实例1,不同之点如下：

色谱柱：Eclipse XDB-C18(150×2.1mm，3.5μm，Agilent)

流动相：A：0.10％(v/v)甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱，洗脱条件如下：

表4 流动相线性洗脱条件

3.实验步骤同实例1,不同之点如下：

色谱柱：Eclipse XDB-C18(100×2.1mm，1.8μm，Agilent)

流动相：A：0.10％(v/v)甲酸水溶液，B：乙腈，洗脱条件如下：

表5 流动相线性洗脱条件

时间(min)A％B％流量(μL/min)0.0090103004.0090103004.10109030010.00109030010.10901030015.009010300

4.实验步骤完全同实施例1，即采用的色谱柱为Thermo的Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)

需要说明的是，上述柱子的流动相梯度为经实验摸索后，对于该柱子和该目标化合物分析效果最好的洗脱条件。

实验结果与讨论：

结果发现，目标化合物在Thermo的Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)柱上的分离度和保留优于其他三种色谱柱，见图2，而其他三种色谱柱对目标物的保留较差，且干扰物与目标物分离不理想，甚至共流出，导致影响目标物灵敏度，尤其是目标物含量较低时，影响尤为明显；Hypersil GOLD aQ(150×2.1mm，1.9μm)避免了干扰物和目标化合物共流出，使干扰物与目标物流出时间相差3.0min左右，可通过设置质谱采集时间，避免干扰物进入质谱，提高目标物灵敏度，且该色谱柱在100％的水相中稳定性好，可得到较窄的峰宽和很好的峰形。

实施例4不同的洗脱条件对于分析效果的影响

本发明分析了不同的洗脱条件对于分析效果的影响，洗脱条件如下，其余的实验步骤同实施例1。

洗脱条件1为：流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液，B相为甲醇，等度洗脱，50％A+50％B，分析时间5min；

洗脱条件2为：流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液，B相为甲醇，等度洗脱，90％A+10％B，分析时间5min；

洗脱条件3为：流动相A为0.10％(v/v)甲酸水溶液，B相为乙腈，等度洗脱，90％A+10％B，分析时间5min；

洗脱条件4为：流动相为A为0.10％(v/v)甲酸水溶液，等度洗脱，100％A，分析时间5min；

实验讨论：

本实验考察了4种不同洗脱条件对对色谱行为和离子化程度的影响，如图3。结果表明，甲酸水溶液流动相比其他三种流动相体系有更好的洗脱效果，且干扰物与目标物分离很好，峰形最佳。洗脱条件1～3因流动相中加入洗脱能力强的乙腈、甲醇，致使干扰物与目标物分离不佳，且峰形较差，影响EC定量结果。所以选择0.10％(v/v)甲酸水溶液作为最优流动相。现有技术中，氨基甲酸乙酯采用液相色谱-质谱联用进行分析时，常采用的流动相为乙腈或甲醇和甲酸/乙酸水，而事实上，经本发明实验证实，在本发明的方法中，洗脱溶剂仅需采用甲酸水溶液，不含有机溶剂，经济环保，分析方法十分简单。

实施例5不同的定容体积对于分析效果的影响

本发明分析了不同的定容体积对于分析效果的影响，定容体积如下，其余的实验步骤同实施例1。

定容条件1：用超纯水定容到原酒样体积0.5倍

定容条件2：用超纯水定容到原酒样体积1倍

定容条件3：用超纯水定容到原酒样体积2倍

定容条件4：用超纯水定容到原酒样体积3倍

定容条件5：用超纯水定容到原酒样体积5倍

实验讨论：

本实验考察了5种不同定容体积对目标物分析效果的影响，选取EC响应值与稀释倍数之积最高的一组的定容体积作为最优定容体积，如图4。结果表明，定容体积为原体积的2倍时响应最大；氮吹除醇后定容体积为原体积的0.5、1倍时，干扰物含量较高，对目标物存在一定干扰，影响其灵敏度；氮吹除醇后定容体积为原体积的3、5倍时，稀释倍数较大，目标物随之被稀释，峰形变差，响应值降低。所以选择最佳定容体积为原体积的2倍。

实施例6氮吹除醇后剩余不同体积对于分析效果的影响

本发明分析了氮吹除醇后剩余不同体积对于分析效果的影响，定容体积如下，其余的实验步骤同实施例1。

氮吹除醇条件1：氮吹至原体积30％；

氮吹除醇条件2：氮吹至原体积40％；

氮吹除醇条件3：氮吹至原体积50％；

实验讨论：

实验考察了1mL酒样氮吹除醇后剩余体积为原体积的30％～50％对目标物的分析效果的影响，如图5。结果表明，在30％在50％的范围内，目标物的响应差别不是很大，氮吹至原体积的40％时目标物响应最高；氮吹至原体积的50％时，样品中仍存在少量乙醇，干扰目标物离子化和稳定性，降低目标物响应值；而氮吹至原体积的30％时，由于氮吹过度，目标物有损失，致使样品中目标物含量减少，响应降低。所以选择最佳氮吹后剩余体积为原体积的40％。

本发明所述的检测方法能够适用于任何一种白酒中氨基甲酸乙酯含量的检测。

在此有必要指出的是，以上实施例和实验例仅限于发明的技术方案做进一步的阐述和说明，使得本领域技术人员能够更加准确地理解本发明的发明思路以及操作方案，并不是对本发明的进一步限制，本领域技术人员在此基础上作出的非突出的实质性特征和非显著进步的改进，均属于本发明的保护范畴。

参考文献：

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