一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

摘要

本发明公开了一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法，通过将桑叶制成碎粉后，分散于水中、灭菌后，再采用单宁酶酶解、平菇菌种发酵得到富含多酚和多糖的产品。本发明全程不使用化学有机试剂，对环境和产品没有有机试剂污染的风险；利用平菇菌种发酵之前，添加了外源单宁酶处理桑叶，不仅增加了多酚含量，而且有利于后续的液体发酵；一方面能增加体系中的游离酚类物质，另一方面，也增加了后期食用菌液体发酵时的碳源，使得发酵更加优化；在高效富集多酚与多糖的同时，对α—葡萄糖苷酶的抑制率也得到提高；本发明生产条件温和，安全卫生，操作过程简单，易于工业化扩大生产，能提高桑叶的利用率和经济附加值。

说明书

技术领域

本发明属于生物资源开发技术领域，特别涉及一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法。

背景技术

桑叶是(Mulberry Leaf)是桑科植物桑的叶。桑叶在我国有丰富的资源，一年四季均能出产。除养蚕外，桑叶自古就作为中药使用，性甘、苦、寒、疏风清热，清肝明目，降压利尿之功效。现代化学的研究表明桑叶含有桑叶多酚、桑叶多糖、植物留醇等；有关桑叶功能作用的研究包括抗凝血作用、降血压作用、降血糖作用、抗病毒作用、抗菌抗炎作用等。近年来，关于桑叶中多酚或多糖的研究很多。例如，中国食品学报刊登的《响应面优化提取桑叶多酚的研究》和《响应面分析法优化桑叶多糖提取工艺的研究》；蚕业科学刊登的《超声波辅助乙醇提取桑叶多酚的工艺条件优化》等。但存在目标成分单一的缺点，浪费了桑叶资源。也有研究者针对性地提出多糖、多酚物质联产的复合提取方法，例如CN101214279《一种从桑叶中提取黄酮、多糖的方法》，CN101412703《一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺》，但这些提取方法中，往往要用到乙醇、氯仿、正己烷等化学有机试剂，会造成环境污染且产品的食用安全性不能得到充分保障。

近年来，也有利用食用菌发酵强化桑叶生物功能的报道。发明专利《鸡腿菇液体转化桑叶的发酵液制备方法及其用途》采用了接入鸡腿菇菌种，获得具有预防和治疗糖尿病的药物和饮品，相较于接入单一的食用菌菌种发酵，本发明采用先酶解后食用菌发酵，所得营养物质更多，且能表现出良好的α—葡萄糖苷酶的抑制率。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述方法制备得到的产品以及应用。

技术方案：本发明提供了一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法，通过将桑叶制成碎粉后，分散于水中、灭菌后，再采用单宁酶酶解、平菇菌种发酵得到富含多酚和多糖的产品。

其中，具体包括以下步骤：

1)桑叶烘干后，打成桑叶粉备用；

2)将步骤1)的桑叶粉与水按照固液质量比为1∶15～1∶25的比例，均匀分散于水中得到分散液；

3)分散液用硫酸调整pH至5～6，然后加入单宁酶，单宁酶的加入量为0.1～0.4U/克桑叶，室温保持60min得到酶解液；

4)将酶解液灭菌后，再按酶解液体积的3％的接种量接入平菇菌种，并加入0.001％的维生素B1(质量百分比)、0.1％的磷酸二氢钾(质量百分比)，然后液体发酵96～144小时得到发酵液；

5)发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

其中，上述平菇菌种为为已活化的液体种子菌种。

其中，上述步骤4)中同时加入安全无毒的含氮类物质或糖类，使得C/N比在12～30之间。

其中，上述安全无毒的含氮类物质为玉米粉。

其中，上述糖类为葡萄糖或蔗糖。

其中，上述产品进一步加工为浸膏或干燥品。

本发明的内容还包括上述产品及其应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

1、本发明全程不使用化学有机试剂，对环境和产品没有机试剂污染的风险；本发明采用可食用的平菇作为发酵菌种，安全放心；生产全程条件温和，不使用有机溶剂，安全卫生。

2、在本发明中，在利用平菇菌种发酵之前，添加了外源单宁酶处理桑叶，不仅增加了多酚含量，而且有利于后续的液体发酵；一方面能增加体系中的游离酚类物质，另一方面，也增加了后期食用菌液体发酵时的碳源，使得发酵更加优化；

3、本发明在高效富集多酚与多糖的同时，对α—葡萄糖苷酶的抑制率也得到提高；

4、本发明生产条件温和，安全卫生，操作过程简单，易于工业化扩大生产，能提高桑叶的利用率和经济附加值。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本实施例中的桑叶为果桑，采摘于中国桑树种质资源圃(江苏镇江)；平菇菌种来源江苏省农业科学院(江苏南京)。本发明中的实施例不仅仅限于该桑叶或者平菇菌种，普通的桑叶以及平菇菌种都能采用该方法进行高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率。

实施例1一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用；

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中得到分散液；

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5；

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.1U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液；

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖使得C/N比为17，然后液体发酵120小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.9mg/g桑叶，多酚含量达9.54mg/mL澄清液，对α-葡萄糖苷酶抑制率达48％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例2一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中得到分散液。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.4U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液。

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖、使得C/N比为17，然后液体发酵120小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.7mg/g桑叶，多酚含量达9.62mg/mL澄清液，对α—葡萄糖苷酶抑制率达50％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例3一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.1U/克桑叶，室温保持60分钟。

步骤(5)：将步骤(4)制作的含桑叶粉的液体于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，不加葡萄糖或蔗糖、使得C/N比为12，然后液体发酵96小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为100r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.3mg/g桑叶，多酚含量达5.35mg/mL澄清液，对α—葡萄糖苷酶抑制率达29％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例4一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.2U/克桑叶，室温保持60分钟得到含桑叶粉的液体。

步骤(5)：将步骤(4)制作的含桑叶粉的液体于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖、使得C/N比为24，然后液体发酵120小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.7mg/g桑叶，多酚含量达5.78mg/mL澄清液，对α—葡萄糖苷酶抑制率达36％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例5：一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.4U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液。

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖和和玉米粉、使得C/N比为24，然后液体发酵144小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达3.0mg/g桑叶，多酚含量达9.95mg/mL澄清液，对α—葡萄糖苷酶抑制率达54％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例6一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶20的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5.5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.1U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液。

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖和和玉米粉、使得C/N比为18，然后液体发酵96小时，发酵时摇床培养温度为24℃，摇床转速为100r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达3.0mg/g桑叶，多酚含量达9.01mg/mL澄清液，对α—葡萄糖苷酶抑制率达43％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α-葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例7一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶15的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至5。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.1U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液。

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，不加葡萄糖或蔗糖、不加玉米粉，使得C/N比为12，然后液体发酵96小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.5mg/g桑叶，多酚含量达5.48mg/mL澄清液，对α-葡萄糖苷酶抑制率达31％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。

实施例8一种同时高效富集桑叶多酚和多糖并提高α—葡萄糖苷酶抑制率的方法

步骤(1)：桑叶烘干后，使用粉碎机加工成桑叶粉，为保证粒度均匀，可过50目以上筛目的筛备用。

步骤(2)：将步骤(1)制作的桑叶粉与水按固液质量比为1∶25的比例，均匀分散于水中。

步骤(3)：将步骤(2)制作的含桑叶粉的分散液用硫酸调整pH至6。

步骤(4)：将步骤(3)制作的含桑叶粉的分散液中加入单宁酶，加入酶量为0.4U/克桑叶，室温保持60分钟得到酶解液。

步骤(5)：将步骤(4)制作的酶解液于121℃灭菌15min后，再按体积比为3％的接种量接入已经经过常规方法活化的平菇液体菌种，加入维生素B1 0.001％(质量百分比)、磷酸二氢钾0.1％(质量百分比)，加入适量葡萄糖和玉米粉、使得C/N比为30，然后液体发酵144小时，发酵时摇床培养温度为25℃，摇床转速为110r/min。

步骤(6)：将步骤(5)制作的发酵液混匀，采用物理法使得固液分离，收集澄清液，得到同时富含多酚和多糖的产品。

此例中的产品多糖含量达2.7mg/g桑叶，多酚含量达5.85mg/mL澄清液，对α-葡萄糖苷酶抑制率达37％；而对照组多糖含量为1.9mg/g桑叶，多酚含量为4.75mg/mL澄清液，α—葡萄糖苷酶抑制率只有20％。注：对照组为桑叶烘干，磨碎成粉，分散于水中，调节pH至5.5，不接入任何菌种，摇床110r/min，25℃下放置5天后，固液分离，收集澄清液，所测数值。