一个参与番茄红素生物合成的circRNA PSY1‑circ1

摘要

本发明涉及核酸领域，具体涉及一种circRNA及其应用。更具体地，本发明提供了一种序列为SEQ ID NO:1所示的circRNA PSY1‑circ1、用于扩增该circRNA PSY1‑circ1的引物对、包含该circRNA PSY1‑circ1的表达载体。藉由本发明的circRNA PSY1‑circ1，可以实现对植物八氢番茄红素合成酶1基因(PSY1)表达、植物类胡萝卜素含量以及番茄果实颜色发育的调控。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸领域，具体涉及一种circRNA及其应用。

背景技术

环形RNA是一类单链、共价闭合环状的转录产物。真核生物中有一类源自于mRNA前体反向剪接(Back-Splicing)(Lasda and Parker,2014)的环形RNA，被称作circRNA。

据报道，早在20多年前，circRNA就已经被鉴定出(Cocquerelle et al.,1993；Nigro et al.,1991；Pasman et al.,1996)，但大多数被认为是异常剪接的产物，其存在和潜在功能均未被重视。

近年来，随着二代高通量测序技术以及生物信息技术的发展，科学家们发现circRNA在各类真核生物中广泛存在(Hansen et al.,2011；Memczak et al.,2013；Salzman et al.,2013；Salzman et al.,2012；Wang et al.,2014)。目前，在真核生物中发现的大部分circRNA的丰度均非常低，说明其可能是一些RNA剪接的副产物，具有重要生理功能的可能性较低(Bachmayr-Heyda et al.,2015；Guo et al.,2014；Salzman et al.,2013；Zhang et al.,2014)。然而，研究也发现了许多高丰度的circRNA，暗示其具有重要的生理功能(Hansen et al.,2011；Jeck et al.,2013；Memczak et al.,2013；Salzman etal.,2013；Salzman et>

circRNA较线性RNA稳定，并多定位于细胞质中(Jeck et al.,2013；Memczak etal.,2013；Salzman et al.,2012)。此外，circRNA的环化具有保守性，其表达模式往往具有时空特异性(Jeck et al.,2013；Memczak et al.,2013；Salzman et al.,2013；Szabo etal.,2015；Veno et al.,2015)。

circRNA的生物合成受顺式元件(cis-element)和反式因子(trans-actingfactor)调控(Chen,2016；Salzman,2016)。反向剪接位点(Back-Splicing Site)两侧内含子中的互补序列或反向重复序列可通过形成发卡结构等二级结构的方式促进circRNA的生成(Jeck et al.,2013；Kramer et al.,2015；Liang and Wilusz,2014；Zhang et al.,2014)。有些外显子的侧翼内含子序列中含有多对互补序列，可通过形成不同的互补结构而产生多种circRNA，该过程被称作选择性环化(Alternative Circularization)(Zhang etal.,2014)。然而，有许多circRNA的侧翼序列并不含互补序列，说明可能存在其他顺式元件如一些RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)识别序列参与环化过程(Ashwal-Flusset al.,2014；Conn et al.,2015；Wang and Wang,2015)。

此外，研究发现，发生环化的外显子可能有一定的长度要求，且其侧翼内含子序列也往往比普通内含子序列长(Kramer et al.,2015；Szabo et al.,2015；Westholm etal.,2014；Zhang et al.,2014)。外显子环化可发生在转录水平(Ashwal-Fluss et al.,2014；Kramer et al.,2015)，也可发生在转录后水平(Liang and Wilusz,2014)。一些反式剪接因子如RBP可参与circRNA的环化。剪接因子Muscleblind(MBL)(Ashwal-Fluss etal.,2014)和Quaking(QKI)(Conn et al.,2015)均可通过与RNA结合而形成复合物的方式促进环化反应。作用于RNA的腺苷脱氨酶1(Adenosine deaminase I acting on RNA,ADAR1)也是一种RNA结合蛋白，其可通过解开RNA二级结构的方式抑制circRNA的生成(Ivanov et al.,2015；Rybak-Wolf et al.,2015)。此外，研究还发现，不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)和精氨酸-丝氨酸富集蛋白(serine-arginine protein,SR protein)可以共同参与circRNA的生物合成调控(Krameret al.,2015)。

目前关于circRNA的生物学功能的研究还非常少。近期的研究表明，该类RNA可参与基因的表达调控。首先，一些circRNA可通过结合miRNA的方式参与基因表达调控(Genget al.,2016；Hansen et al.,2013；Memczak et al.,2013；Wang et al.,2016；Zheng etal.,2016)。然而，很多高丰度的circRNA并不含有miRNA结合位点，而且有些生物体甚至没有siRNA调控通路，这都说明通过抑制miRNA的方式调控基因表达可能不是circRNA的普遍功能(Guo et al.,2014；Jeck and Sharpless,2014；Lu et al.,2015；Wang et al.,2014)。第二，circRNA可调控基因的剪接。例如，果蝇circRNA circMbl的合成可通过结合剪接因子MBL与其pre-mRNA的剪接相竞争(Ashwal-Fluss et al.,2014)。第三，circRNA可直接调控转录过程。有一类circRNA含有“保留内含子(Retained Introns)”，主要定位于细胞核，该类circRNA被称作ElciRNA，可通过与U1snRNP互作促进其来源基因的转录(Li etal.,2015b)。最后,研究表明，有些circRNA可在体内或体外翻译成蛋白质(Abe et al.,2015；Legnini et al.,2017；Pamudurti et al.,2017；Yang et al.,2017)。此外，circRNA可能在细胞通讯中起作用，也可能作为生物标记物(biomarker)(Alhasan et al.,2016)(Lasda and Parker,2016；Li et al.,2015a)。

当前，circRNA的研究尚处于初始阶段，近年来的主要工作仍是围绕circRNA的存在性鉴定，且主要集中在人和动物中，植物中很少，目前只有拟南芥、水稻和番茄中的circRNA有鉴定(Lu et al.,2015；Wang et al.,2014；Ye et al.,2015；Zuo et al.,2016)。circRNA的主要生物学功能尚不明朗，该领域的研究非常少。

类胡萝卜素在生物体内通过异戊二烯途径合成，是呈现红色、橙色和黄色等颜色的一大类色素物质的总称。类胡萝卜素主要存在于植物的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，不仅可以使植物器官显示各种颜色，还可参与光合作用中的光吸收过程，并可清除光合作用产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基。

类胡萝卜素(番茄红素)的生物合成途径现在已有广泛的研究，但是其各合成基因的表达调控机制还不甚清楚。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)是植物类胡萝卜素(或番茄红素)生物合成过程中的重要限速酶，其催化两分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPP)转化为八氢番茄红素。该转化是异戊烯基二磷酸生物合成类胡萝卜素的关键步骤之一。因此，八氢番茄红素合成酶的编码基因PSY是植物基因工程调控转基因植物花、果实颜色以及类胡萝卜素含量的重要靶基因。

鉴于上述类胡萝卜素的各种有益效果，因此亟需找到以类胡萝卜素生物合成中的关键基因例如八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)基因为靶标的物质，通过对该基因表达的调控实现对植物中类胡萝卜素含量的调控以及对植物花、果实颜色发育的调控。

发明内容

本发明的目的在于提供一种circRNA，其可以调控植物中八氢番茄红素合成酶1基因(PSY1)的表达，由此调控植物中类胡萝卜素含量以及植物果实颜色发育。

在第一方面，本发明提供了一种circRNA PSY1-circ1，其序列示于SEQ ID NO:1。

在第二方面，本发明提供了一种用于扩增本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1的引物对；优选地，所述引物对为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或者SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5。

在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明第一方面的circRNAPSY1-circ1。

在第四方面，本发明提供了一种调控植物八氢番茄红素合成酶1基因(PSY1)表达的方法，所述方法包括在所述植物中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1或者抑制本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1的表达。

在第五方面，本发明提供一种调控植物类胡萝卜素含量的方法，所述方法包括通过在所述植物中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1。

在第六方面，本发明提供了一种调控番茄果实颜色发育的方法，包括在番茄中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1。

藉由本发明的circRNA PSY1-circ1的过表达，可以实现对植物八氢番茄红素合成酶1基因、植物类胡萝卜素含量和番茄果实颜色发育的调控。具体地，circRNA PSY1-circ1的过表达可以抑制植物八氢番茄红素合成酶1基因的表达并且由此降低植物中的类胡萝卜素含量；抑制circRNA PSY1-circ1的表达可以提高植物八氢番茄红素合成酶1基因的表达并且增加植物的类胡萝卜素含量。另外，藉由circRNA PSY1-circ1，可以实现对番茄果实颜色发育的调控：circRNA PSY1-circ1的过表达可以使番茄结出黄色果实。还需要指出的是，circRNA比较稳定，相较于其他RNA，更有利于遗传调控。

附图说明

下面对本发明的附图进行简单介绍。

图1是示出RT-PCR方法验证circRNA的引物设计示意图，其中exon7和exon8为PSY1-circ1的两个外显子，离散引物(标注在外显子旁边的箭头)用于扩增circRNA PSY1-circ1。

图2是示出采用RNase R耐受性实验检测circRNA存在的流程图，并且在流程图示出了RNase R耐受性实验可能出现的检测结果，即若是circRNA，则可以耐受RNase R的消化，若是线性RNA，则会被RNase R消化掉。

图3示出对番茄果实中PSY1-circ1的分子生物学鉴定结果。

图4为用于实时PCR鉴定circRNA表达量的引物设计示意图，其中一个引物(如正向引物)需跨越反向剪接位点，且跨位点后的3’端序列为3-6bp，保证能准确扩增出相应的circRNA，且不能扩增线性RNA和其他反向剪接位点位于相近区域的非特异circRNA。

图5为不同成熟期番茄果实中的circRNA PSY1-circ1及其来源基因的表达分析结果。

图6为构建PSY1-circ1过表达载体的示意图。

图7为转基因番茄(AC)中PSY1-circ1及其来源基因PSY1的相对表达量分析，其中OE3和OE28(黑色柱)表示过表达circRNA PSY1-circ1的红色果实株系，OE21和OE26(灰色柱)表示过表达circRNA PSY1-circ1的黄色果实株系。

图8示出不同转基因株系中PSY1-circ1的表达模式，其中OE3和OE28(黑色柱)为红色果实株系，OE21和OE26(灰色柱)为黄色果实株系。

图9示出转基因番茄果实的颜色变化表现在多个水平，其中A1、A2和A3为同一株系有多种颜色的果实；B为同一果穗中含不同颜色果实；C1和C2为同一个果实含不同颜色区域。

图10示出转基因番茄果实的颜色，其中OE3、OE28为红色果实株系；OE21、OE26为黄色果实株系。

图11示出PSY1-circ1转基因番茄中番茄红素和β-胡萝卜素的含量分析(初提物)，其中OE3、OE4和OE28(黑色柱)为红色果实株系，OE5、OE21和OE26(灰色柱)为黄色果实株系。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方案作进一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具体描述的实施方案仅用于示例目的，无意于以任何方式对本发明的保护范围进行限制。在不背离本发明的精神和宗旨的情况下，可以对本发明进行修改。本发明的保护范围由随附的权利要求书来进行限定。

如上所述，当前对circRNA的研究非常有限，基本都是对该类RNA的生物信息学和分子生物学方面的鉴定，而且主要集中在人和动物中，植物中非常少，目前只有拟南芥、水稻和番茄中的circRNA有相关鉴定。另外，circRNA的功能研究目前刚起步，且植物领域内基本无相关报道。因此，对植物circRNA的鉴定和生物学功能进行研究意义非常重大。

另外，如前文所述，类胡萝卜素例如番茄红素是植物花色素的重要组成部分，且具有重要的营养价值，对其合成调控的研究具有重要的应用意义。

综上，植物中是否存在这样的circRNA，其对植物例如番茄中类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶例如八氢番茄红素合成酶1(PSY1)的基因表达会产生影响，成了本领域技术人员亟需解决的一个技术问题。

本发明人以番茄(Solanum lycopersicum)为研究对象，通过高通量测序对不同成熟期的果实进行了circRNA检测，结果在其中检测到大量的来源于不同基因的circRNA位点。在这些circRNA当中，本发明人进一步对来源于PSY1基因的circRNA(PSY1-circ1)的生物学功能进行了分析，意外地发现该circRNA可调控例如抑制其来源基因PSY1的表达，进而调控番茄红素等类胡萝卜素的生物合成。基于以上发现，本发明人完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了一种circRNA PSY1-circ1，其序列示于SEQ IDNO:1。SEQ ID NO:1的序列为：

AGTTCTTTGATGAGGCAGAGAAAGGCGTGACAGAATTGAGCTCAGC TAGTAGATTCCCT^CCATTCAGAGATATGATTGAAGGAATGCGTATGGACTTGAGAAAATCGAGATACAAAAACTTCGACGAACTATACCTTTATTGTTATTATGTTGCTGGTACGGTTGGGTTGATGAGTGTTCCAATTATGGGTATCGCCCCTGAATCAAAGGCAACAACAGAGAGCGTATATAATGCTGCTTTGGCTCTGGGGATCGCAAATCAATTAACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCCAGAAGAGGAAGAGTCTACTTGCCTCAAGATGAATTAGCACAGGCAGGTCTATCCGATGAAGATATATTTGCTGGAAGGGTGACCGATAAATGGAGAATCTTTATGAAGAAACAAATACATAGGGCAAGAA。

该circRNA PSY1-circ1来源于PSY1基因，共429个碱基，包含PSY1的外显子7和8，其第59-60位(即符号“^”所示位置)之间为反向剪接位点。过表达circRNA PSY1-circ1能够抑制八氢番茄红素合成酶(PSY1)的基因表达。由于PSY1是类胡萝卜素生物合成中的重要限速酶，因此该circRNA PSY1-circ1的过表达可以影响类胡萝卜素的生物合成，即影响植物中类胡萝卜素的含量。另外，由于类胡萝卜素是一种天然色素，因此在植物例如番茄中，对类胡萝卜素例如番茄红素的影响也会影响到果实的颜色发育。再者，相对而言，circRNA更为稳定，因此相比于其他RNA，可以更好地实现遗传调控。

在第二方面，本发明提供了一种用于扩增本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1的引物对。

在一个优选实施方案中，所述引物对为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，或者SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5，其中SEQ ID NO:2的序列为：GTTGGGTTGATGAGTGTTCC，SEQ ID NO:3的序列为：CAAGTCCATACGCATTCC，SEQ ID NO：4的序列为GTTGGAGAAGATGCCAGAAG，SEQ ID NO：5的序列为CCATACGCATTCCTTCAATC。

在第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明第一方面的circRNAPSY1-circ1。

在一个具体实施方案中，所述表达载体为pCAMBIA1301载体。

在第四方面，本发明提供了一种调控植物八氢番茄红素合成酶1基因(PSY1)表达的方法，所述方法包括在所述植物中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1或者抑制本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1的表达。

具体地，在植物中过表达circRNA PSY1-circ1可以抑制或者下调八氢番茄红素合成酶1基因的表达，抑制该circRNA PSY1-circ1的表达则可以促进或者上调八氢番茄红素1基因的表达。

在一个具体实施方案中，所述植物可以是番茄。

在一个具体实施方案中，所述类胡萝卜素可以是番茄红素和/或β-胡萝卜素。

在第五方面，本发明提供一种调控植物类胡萝卜素含量的方法，所述方法包括通过在所述植物中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1。

更具体地，在植物中过表达circRNA PSY1-circ1可以抑制八氢番茄红素合成酶1基因的表达，由此降低植物类胡萝卜素含量。

在一个具体实施方案中，所述植物可以是番茄。

在一个具体实施方案中，所述类胡萝卜素为番茄红素和/或β-胡萝卜素。

在第六方面，本发明提供了一种调控番茄果实颜色发育的方法，包括在番茄中过表达本发明第一方面的circRNA PSY1-circ1。

正如本领域技术人员熟知的那样，番茄果实的色素成分主要是类胡萝卜素。不同的类胡萝卜素使番茄呈现不同的颜色，例如番茄红素会使番茄果实呈现红色。因此，影响类胡萝卜素的合成途径将导致番茄果实的颜色发生变化。

如上所述，PSY1-circ1的过表达会抑制PSY1的表达，而PSY1是植物类胡萝卜素(或番茄红素)生物合成过程中的重要限速酶。PSY1的表达被抑制导致番茄果实中的番茄红素含量降低，由此使番茄果实呈现例如黄色。简言之，circRNA PSY1-circ1的过表达可以使番茄结出黄色果实。

下面参照附图对本发明示例性实施方式进行详细描述。对示例性实施方式的描述仅仅是出于示范目的，而绝不是对本发明及其应用或用法的限制。

实施例

实施例1.circRNA PSY1-circ1的生物信息学与分子生物学鉴定

番茄果实中环形RNA的深度测序：采用Trizol(Life>

circRNA位点的提取与分析：深度测序数据去除接头和低质量数据后，用Segemehl(v.0.1.7)软件提取反向剪接位点信息。利用RNase>

RNase R耐受性实验具体如下：利用Trizol(Life technologies)分离总RNA，然后使用DNase I(Fermentas)去除残留基因组DNA。在采用RNA Clean&Concentrator kit(ZymoResearch)纯化之后，将RNA样本分为两等份，一份用RNase R(Epicentre)于37℃消化1小时(R+)，另一部分做Mock处理(R-，即利用水代替RNase R，其余与R+处理完全相同)。将R+RNA和R-RNA用随机引物(Random Hexamer Primer，Fermentas)逆转录为cDNA(M-MLV ReveraseTranscriptase，Promega)，并用作RT-PCR鉴定的模板。利用聚合引物(用于扩增普通线性mRNA)和离散引物(用于扩增circRNA)分别对R+模板和R-模板(cDNA)进行特异性PCR扩增(图1)。还将基因组DNA用作模板，以确保该位点不存在于基因组中。图2示出了上述流程，以及可能的结果。从该图中可以看出，若是circRNA，则其将表现对RNase R的耐受性，若是线性RNA，则其将表现出对RNase R的敏感性。

结果：本发明人通过上述实验鉴定出部分circRNA，由此证明这些生物信息学方式检测到的circRNA位点的确存在。对circRNA>

AGTTCTTTGATGAGGCAGAGAAAGGCGTGACAGAATTGAGCTCAGCTAGTAGATTCCCT^CCATTCAGAGATATGATTGAAGGAATGCGTATGGACTTGAGAAAATCGAGATACAAAAACTTCGACGAACTATACCTTTATTGTTATTATGTTGCTGGTACGGTTGGGTTGATGAGTGTTCCAATTATGGGTATCGCCCCTGAATCAAAGGCAACAACAGAGAGCGTATATAATGCTGCTTTGGCTCTGGGGATCGCAAATCAATTAACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCCAGAAGAGGAAGAGTCTACTTGCCTCAAGATGAATTAGCACAGGCAGGTCTATCCGATGAAGATATATTTGCTGGAAGGGTGACCGATAAATGGAGAATCTTTATGAAGAAACAAATACATAGGGCAAGAA。

这段序列在本文中标注为SEQ ID NO:1，其中第59-60位(即符号“^”所示位置)之间为反向剪接位点。PSY1-circ1共429个碱基，包含PSY1的外显子7和8。PSY1是采用聚合引物SEQ ID NO:6(TTGGTTTGCCTGTCTGTG，正向引物)和SEQ ID NO:7(TGTATCGGACAAAGCACC，反向引物)进行特异性PCR扩增的。

实施例2.circRNA PSY1-circ1及其来源基因在不同成熟期番茄果实中的表达模式分析

鉴定circRNA的特殊引物设计(实时PCR方法)：由于选择性环化现象的存在，同一个基因可产生多个有重叠区域的circRNA，因此设计鉴定circRNA的离散引物(正向引物或者反向引物)跨越反向剪接位点(引物跨过位点的3’端长度为3-6bp)，以保证扩增的特异性，具体见示意图(图4)。其余设计理念同普通实时PCR。

由此设计理念获得的用于实时PCR扩增circRNA PSY1-circ1的引物为离散引物，其中正向引物为TCAGCTAGTAGATTCCCTCCATTC(SEQ ID NO:8)，反向引物为CCTTTGATTCAGGGGCGATAC(SEQ ID NO:9)。

另外，用于实时PCR扩增circRNA PSY1-circ1的来源基因PSY1的引物是聚合引物，其中正向引物为GGACAAGTTTCATGGAATCAGT(SEQ ID NO:10)，反向引物为TGGAGTAGCCAAAATAGCAGAC(SEQ ID NO:11)。

表达模式鉴定分析：提取野生型番茄(AC)绿熟期(MG)、破色期(BR)和红熟期(BR+6)番茄果实的总RNA，去除基因组DNA残留，之后用随机引物(Random>

结果：对于circRNA>

实施例3.circRNA PSY1-circ1过表达载体的构建与遗传转化

circRNA过表达载体的构建：以野生型番茄(AC)的基因组DNA为模板，扩增包含待环化外显子和侧翼序列(上游281bp和下游681bp)的片段(片段A)，扩增部分下游序列(517bp，片段B)。然后将片段A和片段B以相反的方向连接并构建到pCAMBIA1301载体的表达框中(图6)。该载体中片段A和片段B因部分序列互补而形成二级结构，是促进circRNA大量生成的关键。此外，该载体保留了待环化外显子两侧的剪接位点和部分侧翼序列，保证了精确剪接的进行。

遗传转化：将上文制备获得的载体导入根癌农杆菌(A.tumefaciens)EHA105中，随后将此经转化的根癌农杆菌用于转化野生型番茄(AC)，转化方法按照子叶穿刺转化法(Rai,G.K.et>

结果：从图7和图8可以看出，与对照即野生型AC相比，在转基因番茄果实的不同时期，PSY1-circ1均高度表达，这表明本发明人成功地构建了circRNA>

实施例4.转基因番茄(AC)中circRNA PSY1-circ1及其来源基因PSY1的表达

如实施例3所述来制备本实施例所需转基因番茄，并对处于不同时期(绿熟期(MG)、破色期(BR)和红熟期(BR+6))的野生型和转基因番茄中的circRNA PSY1-circ1及其来源基因PSY1的表达量进行检测，采用实时PCR(SYBR Green)，其中所用引物如实施例2所述。

不同时期的番茄果实中PSY1-circ1及PSY1的相对表达量结果示于图7。图7中的左列图示出PSY1-circ1在不同时期番茄果实中的表达情况，右列图示出PSY1在不同时期番茄果实中的表达情况。从图中可见，在绿熟期、破色期和红熟期，PSY1在黄色果实株系(OE21和OE26)中的表达下调，但其在红色果实株系(OE3和OE28)中的表达更高。PSY-circ1在红色果实株系和黄色果实株系之间的表达模式不同。从绿熟期到破色期再到红熟期，PSY1-circ1在黄色果实株系中的表达呈上升趋势，并且在红熟期，其在黄色果实株系中的表达较其在红色果实株系中的表达丰度更高。相反，从破色期到红熟期，PSY1-circ1在红色果实株系中的表达下降。这些结果提示，PSY-circ1的高表达可能在抑制其来源mRNA累积方面发挥作用。

不同果实株系中的PSY1-circ1及PSY1的相对表达量结果示于图8。从该图中可以看出，从绿熟期到破色期再到红熟期，PSY1-circ1和PSY1在黄色果实株系(OE21和OE26)中均呈上升的趋势，而在两个红色果实株系(OE3和OE28)中，PSY1-circ1在破色期后表现下调趋势，PSY1呈增加的趋势。

由以上结果可知，在番茄中过表达circRNA PSY1-circ1影响到了其来源基因PSY1的表达。更具体地，果实成熟期连续高表达circRNA PSY1-circ1可抑制其来源基因PSY1的表达。考虑到PSY1基因是类胡萝卜素生物合成中的关键酶，因此发明人进一步研究了转基因番茄中与番茄果实颜色发育紧密相关的类胡萝卜素番茄红素和β-胡萝卜素的含量是否会发生变化，参见实施例5。

实施例5.转基因番茄(AC)中番茄红素和β-类胡萝卜素含量分析

如实施例3所述来制备本实施例所需转基因番茄。切下番茄果实组织样本(BR+10时期)，液氮冷冻并保存在-80℃。将冷冻样本用液氮研磨成粉末，称取约0.2克用1.8ml提取液(丙酮：正己烷＝2：3)于室温下提取1小时。3000rpm离心10min，取上清液置于新的离心管中。使用UV-1800分光光度计(Shimadzu)测定上清液在663nm、645nm、505nm及453nm处的光密度。使用以下公式计算番茄红素和β-胡萝卜素的含量：番茄红素(100mg/100mL)＝-0.0458A₆₆₃+0.204A₆₄₅+0.372A₅₀₅-0.0806A₄₅₃，β-胡萝卜素(100mg/100mL)＝0.216A₆₆₃-1.22A₆₄₅-0.304A₅₀₅+0.452A₄₅₃(参见NAGATA>

PSY1-circ1过表达AC番茄表现出不同的表型。具体地，本发明的转基因AC番茄果实的颜色变化表现在多个水平，例如同一株系结出多种颜色的果实(参见图9中的A1、A2和A3)，同一果穗中含不同颜色的果实(参见图9中的B)，同一个果实含不同的颜色区域(参见图9中的C1和C2)。此外，本发明的转基因AC番茄单一株系可以结出单独的红色或者黄色的果实。在我们的实验中，有八个株系结出红色果实，七个株系结出黄色果实(表1和图10)。

与果实颜色相一致，黄色转基因果实(OE5、OE21和OE26)中的番茄红素和β-胡萝卜素相对于对照AC显著下降(P<0.01)，在一些红色转基因果实中的含量略有下降(参见图11)。β-胡萝卜素含量的下降稍逊于番茄红素含量的下降，这一结果可能是由于β-胡萝卜素在熟化启动之前就开始累积。简言之，circRNA PSY1-circ1在类胡萝卜素番茄红素和β-类胡萝卜素的生物合成中起到负调节的作用。

表1.PSY1-circ1过表达株系的果实颜色(AC,T0代)

果实颜色OE株系总计黄色OE5、OE8、OE11、OE19、OE21、OE23、OE267红色OE3、OE4、OE7、OE12、OE13、OE14、OE15、OE288

小结：

本发明人在番茄中首次发现了一种来源于PSY1的circRNA，其被命名为PSY1-circ1，该circRNA可以负调控其来源基因PSY1的表达。由于PSY1是类胡萝卜素生物合成中的关键酶基因，因此该circRNA可以间接地调控番茄中类胡萝卜素如番茄红素和β-胡萝卜素的含量，进而调控番茄果实的颜色发育。

在本说明书中，每当提及“示例性实施方式”、“优选实施方式”、“一个实施方式”等时意味着针对该实施方式描述的具体的特征、结构或特点包括在本发明的至少一个实施方式中。这些用词在本说明书中不同地方的出现不一定都指代同一实施方式。此外，当针对任一实施方式/实施方式描述具体的特征、结构或特点时，应当认为本领域技术人员也能够在所有所述实施方式中的其它实施方式中实现这种特征、结构或特点。

以上详细描述了本发明的实施方式。然而，本发明的方面不限于上述实施方式。在不脱离本发明的范围的情况下，各种改型和替换均可以应用到上述实施方式中。

参考文献

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序列表

<110> 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所

<120> 一个参与番茄红素生物合成的circRNA PSY1-circ1

<130> CP20170505

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 429

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 1

agttctttga tgaggcagag aaaggcgtga cagaattgag ctcagctagt agattccctc 60

cattcagaga tatgattgaa ggaatgcgta tggacttgag aaaatcgaga tacaaaaact 120

tcgacgaact atacctttat tgttattatg ttgctggtac ggttgggttg atgagtgttc 180

caattatggg tatcgcccct gaatcaaagg caacaacaga gagcgtatat aatgctgctt 240

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgggttga tgagtgttcc 20

<210> 3

<211> 18

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<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

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<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 18

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<213> 人工序列

<400> 6

ttggtttgcc tgtctgtg 18

<210> 7

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<400> 7

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<210> 8

<211> 24

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<213> 人工序列

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<210> 9

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<213> 人工序列

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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