一种解淀粉芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌复配微生物菌剂及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药和微生物肥料技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )菌株和一株死谷芽孢杆菌(B.>)及其微生物菌剂和应用。

背景技术

随着化学农药的大量、频繁使用，环境污染、农药残留和增加抗性等问题也越来越严重，植物病害的生物防治成为了研究热点，其中尤以植物内生菌作为拮抗菌的研究得到众多学者的观注。植物内生细菌是指生活在植物的根、茎、叶、花、果实和种子中，但对植物没有任何实质性伤害的细菌，其具有多种生物学功能，特别是抑菌功能成为生防菌资源的有力支撑。研究发现植物内生菌对植物有促进生长的作用，这些促生作用主要体现在内生细菌通过产IAA、固氮作用和通过解磷或溶磷作用使植物能够尽可能的得到养分的补充，从而使植物对生物量进行了积累；植物内生细菌也可以通过分泌抑菌物质、与病原菌竞争营养空间及诱导植物获得抗病性阻止或降低病原菌对植物的侵染或造成的危害。以内生细菌为菌种资源研制的微生物农药不易产生抗药性，不伤害天敌，且能利用农副产品甚至工业废水广泛生产，应用于农业生产后为生产绿色或无公害农产品提供了一个新的途径。

大量使用化学氮肥、磷肥和钾肥会导致重金属在土体中累积、资源与能源大量消耗、环境污染，且其利用率低，未被吸收利用的氮肥在农田中流失或挥发，对地下水资源、土壤和空气造成了严重污染，使农畜产品的有毒物质超标，给人类健康带来了极大的危害，同时化肥的长期大量施用破坏土壤团粒结构，造成土壤板结，肥力下降。

微生物肥料作为一种新型肥料，施入土壤后，通过其特定菌株的快速繁殖，能固定大气中的氮素、释放土壤中固定态的磷、钾元素，使得环境的养分潜力得以充分发挥，并为作物生长营造一个良好的土壤微生物环境，在减少化肥用量、降低环境污染、提高农作物品质等方面具有重要意义。尤其是集抑菌、固氮、解磷、解钾和作物生长素于一身的复合微生物肥料的研发，在农业可持续发展中有举足轻重的作用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中化学农药和化肥环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )菌株和一株死谷芽孢杆菌(B.>)及其微生物菌剂和应用，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>amyloliquefaciens>B.>)具有广谱杀菌活性和促生能力，可用来制备环保性好、不易产生抗药性和安全性好的内生芽孢杆菌微生物菌剂。另外，所述菌株和菌剂能够作为微生物农药和肥料使用，能够抑制镰刀菌（Fusarium>solani），其抑菌率在72.2%以上；对马铃薯有促进作用，可以作为防治根腐病专用微生物农药和微生物肥料使用，从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明从高寒草地珠芽蓼(Polygonum>)、紫花针茅(Stipa purpurca>Griseb)，线叶嵩(Kobreasia>)，秦艽(Gentiana>)和乳白香青(Anaphalis>)等的内生细菌中筛选获得对马铃薯病原菌具有抑菌和对马铃薯具促生作用的内生细菌：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)菌株，并对其生物学功能进行了研究，优化了其培养条件及发酵条件，并进行了防治试验，提供了2株生物防治和生物菌肥的菌种资源和其菌剂的制备方法。

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.13718。

一种死谷芽孢杆菌（B.>），所述死谷芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.13719。

一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述的解淀粉芽孢杆菌的活菌体和死谷芽孢杆菌的活菌体。

进一步的，以所述微生物菌剂的总重量为基准，所述解淀粉芽孢杆菌的活菌体和死谷芽孢杆菌的活菌体的含量共为6.6×10^{11>cfu/g ~6.6×1012>cfu/g。}

进一步的，所述微生物菌剂中还含有发酵基质，所述发酵基质为草炭、有机肥、骨粉的混合物。

进一步的，以所述微生物菌剂的总重量为基准，所述菌体的质量百分比含量为5-15%，其余为发酵基质。

所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1）制备种子液：分别将所述解淀粉芽孢杆菌和死谷芽孢杆菌两种菌的单个拮抗菌株在LB平板上划线培养，48 h后挑取单菌落接入50 mL NB培养液中，28℃，150 r/min下培养12h得种子液，用灭菌蒸馏水调节OD₆₀₀为0.5后，以2%的接种量接入50>

2）制备发酵液：

所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )的发酵条件为：牛肉胨3.0g、酵母膏3.0g、乳糖22.0g、CaCl₂>

所述死谷芽孢杆菌(B.>)的发酵条件为：牛肉胨3.0g、酵母膏3.0g、乳糖20.0g、NaCl 3.0g、pH7.0，接种量14%，温度28℃，转速180r/min，得到死谷芽孢杆菌发酵液；

3）将发酵的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)按质量百分比含量为5-15%接种，其余为发酵基质，温度为24℃~32℃条件下，进行固体发酵96h~192h，制得微生物菌剂。

进一步的，所述的解淀粉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌及所述的微生物菌剂，可应用于制备根腐病专用微生物农药。

进一步的，所述的解淀粉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌及所述的微生物菌剂，可应用于制备根腐病专用微生物肥料。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述的解淀粉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌，及利用所述两株菌株制备得到的微生物菌剂，具有抑菌作用和促生作用，能够作为微生物农药和肥料使用，能够抑制根腐病菌（Fusarium>），其抑菌率在72%以上；

2、本发明所述的解淀粉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌，及利用所述两株菌株制备得到的微生物菌剂，对马铃薯有促生作用，可以作为微生物农药和微生物肥料使用，从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

附图说明

图1解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )菌株的菌落形态；

图2为死谷芽孢杆菌(B.>)的菌落形态。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏：

本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )，于2017年3月2日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.13718。

本发明的死谷芽孢杆菌（B.>），于2017年3月2日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.13719。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)的获得和鉴定

一、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)的获得。

本发明从高寒草地珠芽蓼(Polygonum>)、紫花针茅(Stipa purpurca>Griseb)，线叶嵩(Kobreasia>)，秦艽(Gentiana>)和乳白香青(Anaphalis>)等的内生细菌中，利用对峙培养法即培养皿中央接入病原菌，四周2.5厘米处等距离接种内生细菌，培养5-7天后十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，以抑菌率为依据筛选获得2株对根腐病原菌具有抑菌和对马铃薯具促生作用的内生细菌：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)，本申请人将其保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC>

二、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)的鉴定。

（1）对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)的形态鉴定。

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，28℃培养3d的培养性状为：菌落白色，不规则形，大小6-9 mm，边缘波纹状，表面褶皱，中间隆起，干燥，菌体0.45~0.80×0.89~4.19 μm。

将死谷芽孢杆菌(B.>)接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，28℃培养3d的培养性状为：菌落乳白色，圆形，大小5-8 mm，边缘不规则，表面褶皱，干燥，0.32~0.57×0.81~2.81μm。

（2）对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)的16S>

将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus> )的16S rDNA基因序列在Genebank中与B.> (KJ149810.1)聚合，结合形态特征鉴定为B.>amyloliquefaciens。

死谷芽孢杆菌(B.>)的16S rDNA基因序列在Genebank中与 B.>vallismortis>(KF818642.1) 聚合，结合形态特征鉴定为 B.>。

实施例2 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)微生物菌剂的制备

本实施例所述的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)5%（2菌株1：1比例）和发酵基质余量。

所述发酵基质的组份和含量包括：草炭、有机肥、骨粉混合作为发酵基质，占比分别为45%、45%、10%，含水量30-50%。

所述微生物菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>amyloliquefaciens>B.>)按比例接种于发酵基质中，在温度为24℃的条件下，进行固体发酵96h，得到的发酵物即为微生物菌剂。

经测定，上述发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)的活菌数可以达到3.2×10^10>CFU/mL。

实施例3 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)微生物菌剂的制备

本实施例所述的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>) 10%（2菌株1：1比例）和发酵基质余量。

所述发酵基质的组份和含量包括：草炭、有机肥、骨粉混合作为发酵基质，占比分别为45%、45%、10%，含水量30-50%。

所述微生物菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>amyloliquefaciens>B.>)按比例接种于发酵基质中，在温度为28℃，进行液体发酵144h，得到的发酵物即为微生物菌剂。

经测定，上述发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)的活菌数可以达到6.6×10^12>CFU/mL。

实施例4 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)微生物菌剂的制备

本实施例所述的微生物菌剂的生物活性组份和重量百分比含量包括：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)15%（2菌株1：1比例）和发酵基质余量。

所述发酵基质的组份和含量包括：草炭、有机肥、骨粉混合作为发酵基质，占比分别为45%、45%、10%，含水量30-50%。

微生物菌剂的制备方法为：将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)按比例接种于发酵基质中，在温度为32℃条件下，进行液体发酵192h，得到的发酵液即为微生物菌剂。

经测定，上述发酵液中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)的活菌数可以达到4.51×10¹²>

实施例5 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)的室内抑菌活性和田间防治效果

试验一：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>vallismortis)室内抑菌活性测定。

首次筛选出解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基中进行培养；同时，将指示菌株根腐病菌（Fusarium>）接种于马铃薯葡萄糖琼脂（即PDA）培养基中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径为6mm的菌饼。选取指示菌株的菌饼一块，置于PDA培养基中；具体的，可以将该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置（平皿直径9cm）；再选取由拮抗菌株得到的菌饼四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为2.5cm的圆周上。将该培养皿在28℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)，单独抑菌率分别为72.2%和73%，但1：1复配后抑菌率为82%。

试验二：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus>>B.>)菌株对马铃薯增产、对干腐病的防治效果测定。

于2015年5月~8月进行，地点为甘肃省白银市景泰条山农场。种植模式为垄宽与行距分别为1.35 m和0.70 m，株间距0.17 m，种植密度为5605株/667>2。播种前一天对种薯进行1.5%高锰酸钾浸泡消毒并切块。4月下旬播种，播种时施基肥，过程中再无追肥，8月下旬收获。试验分处理和对照，约135>2，处理和对照间留一垄为保护行。2015年6月27日，用穴施的方法将发酵的微生物菌肥埋入马铃薯根际土壤，肥穴距根际15>

于2015年8月17日进行马铃薯采收，用随机取样方法采收面积为20>2的马铃薯，称重，计算产量，并对采收的马铃薯储藏于室内，4个月后对马铃薯干腐病发病薯块进行统计，并计算发病薯块占总贮藏薯块百分率。

表1 对马铃薯的促生作用

菌肥CK折合亩产yield per mu (kg)1135.5892.4增产率 yeild increase (%)27.2

表1表明，菌肥对马铃薯的增产率达27.2%。

对储藏马铃薯干腐病的统计表明功舥处理的发病率10.4%，空白对照发病率为35%，防效为70.3%，效果良好。

表2 对马铃薯干腐病防效

两种菌（F2）CK干腐发病率(%)10.4%35%

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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