一种毛绒制品的快速分子鉴定方法

摘要

本发明公开了一种毛绒制品的快速分子鉴定方法，包括以下步骤：从毛绒制品中提取线粒体DNA；采用羊绒特异性引物、羊毛特异性引物以及羊驼绒特异性引物进行PCR特异性扩增；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，如果出现相应的条带，则鉴定含有羊绒、羊毛、羊驼绒成分，不出现相应的条带，则不含相应的成分。本发明采用特定的羊绒、羊毛、羊驼绒的特异性引物进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，可以准确定性对毛绒制品中的羊绒、羊毛、羊驼绒成分进行鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及毛绒制品分子鉴定技术领域，具体涉及一种毛绒制品的快速分子鉴定方法。

背景技术

我国是毛绒制品生产、加工、出口大国，毛绒类纤维的总加工量居世界第一。羊绒作为重要的毛绒类产品之一，其细度均匀，手感滑糯柔软而细腻，拉力强而富有弹性，使其质感、手感、保暖性等明显优于其他毛绒制品，素有“软黄金”之称。一些不法生产厂商为达到降低成本提高利润的目的，在加工羊绒制品过程中往往掺入价值相对较低的其他纤维，如绵羊绒、改性绵羊毛、拉细绵羊毛和羊驼绒等，这些掺假行为不仅损害了消费者的利益，更影响了我国毛绒产业的健康可持续发展。

毛绒类纤维现有的鉴别方法，主要是根据GB/T 16988-2013《特种动物纤维与绵羊毛混合物含量的测定》的规定，使用投影显微镜对山羊绒、兔毛、羊驼毛等绒毛类型的各组分纤维含量的测定。该鉴别方法过分依赖于检测人员的工作经验，而对羊绒、改性绵羊毛和羊驼绒等形态结构极其相似的纤维，这种方法逐渐显现出其局限性，已不能满足毛绒产业发展的要求。近年来发展起来的图像识别法、红外光谱法、实时定量PCR法、基因探针法、靶向蛋白质组技术和生物芯片法等虽各有千秋，却均因各种原因难以推广。

随着各种毛绒混纺织物的大量出口，毛绒类纤维的成份鉴定工作已成为维护商家与消费者权益，增加我国国际市场竞争力以及打击假冒劣伪的重要一环，也一直是纺织检测行业具有挑战性的课题之一，已成为业界亟待解决的问题。

本发明旨在利用基因扩增技术，对毛绒制品实现快速准确地定性鉴定。

生物体所有的遗传信息都贮存在DNA分子中，每种动物都有其特定的DNA碱基序列，利用这种特定标记的差别，设计特定的引物，通过聚合链式反应(polymerase chainreaction，PCR)扩增得到特异性片段，从而确定各自的种属。

由于动物毛纤维的基因组DNA主要存在于毛囊部位，毛绒织物一般没有毛囊，因而只能提取纤维中的线粒体DNA，通过比较线粒体DNA的特征碱基序列差异来定性鉴别羊绒、羊毛与羊驼纤维。

线粒体是独立于细胞核，存在于大多数真核细胞里的一种非常重要的、基本的细胞器。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)被发现后，核外遗传物质的研究逐渐成为分子遗传学和进化遗传学的重要研究领域，受到越来越多的重视。MtDNA为共价闭合环状双链螺旋分子。其进化速率是核DNA的5-10倍，具有进化速度快、极少发生重组、多拷贝及严格母系遗传等特征，在近缘种间及种内具有丰富的多态性。因此，mtDNA是研究近缘物种分类及动物起源与进化最重要的分子遗传标记之一，被广泛的用于动物系统发育分析中，并为动物的起源与进化研究提供了大量的分子生物学依据。

CytB是编码线粒体内膜细胞色素b氧化酶基因的一个亚基，参与氧化磷酸化合成ATP过程。cytB基因核苷酸序列总长为1140bp，编码379个氨基酸，不同物种cytB基因的序列长度没有明显的差异。cytB基因进化速度适中，易用一些通用引物对所检测的物种进行扩增测序，较小的一段基因片段包括了科间、属间、种间乃至种内的遗传信息，适合于分析种间或者属间的差异被认为是解决系统分类和进化问题最可信的遗传标记之一，已被广泛的应用到动物的分子鉴定、系统发育分析和起源与进化的研究中。

发明内容

本发明提供了一种毛绒制品的快速分子鉴定方法，采用特定的羊绒、羊毛、羊驼绒的特异性引物进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，可以准确定性对毛绒制品中的羊绒、羊毛、羊驼绒成分进行鉴定。

一种毛绒制品的快速分子鉴定方法，包括以下步骤：

(1)从毛绒制品中提取线粒体DNA(mtDNA)；

(2)采用羊绒特异性引物、羊毛特异性引物以及羊驼绒特异性引物进行PCR特异性扩增；

所述的羊绒特异性引物为：上游引物为catcactaatcttctttcagcaatc，下游引物为tgtggaggaagggtacaagtact；

所述的羊毛特异性引物：上游引物为cattgatctcccagctccatcaaatatt，下游引物为attgtcgcaaataggaggattactccg；

所述的羊驼绒特异性引物：上游引物为attatgcaaatcatgacaggactatttc，下游引物为atatttcaagtttctaggaaggcgtagg；

(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，如果出现相应的条带，则鉴定含有羊绒、羊毛、羊驼绒成分，不出现相应的条带，则不含相应的成分。

如果样品中仅存在羊绒、羊毛或羊驼绒，那么用相应的引物可以扩增出目的条带，但用其他引物则无扩增结果。

步骤1)中，本发明研究和开发动物纤维的DNA检测，关键技术难点在于DNA的提取。特别是经过染色、整理等加工处理的毛绒制品，更难获得高质量的可用于进一步分析的DNA片段，而PCR技术只需微量的DNA样品，很好地解决了上述问题，因此，基于线粒体DNA片段的PCR技术是一种理想的选择。

从毛绒制品中提取线粒体DNA具体包括：

将毛绒制品用液氮研磨，然后采用Biomiga试剂盒，按照Biomiga试剂盒的步骤，得到线粒体DNA。

毛绒制品在冷冻干燥器用液氮研磨(6870SPEX SamplePrepUSA)加工成细小的颗粒。

所述的液氮研磨的条件为：采用冷冻干燥器，先预冷3min～7min，然后以每秒5～15次的速率运行，0.5～3min内运行1～3个循环，再冷却0.5～3min。

研磨时注意以下条件：先预冷5min，然后以每秒10次的速率运行，1min内运行2个循环，再冷却1min。选用Biomiga试剂盒，按说明书步骤进行，将粉碎的毛绒制品进行蛋白酶，DTT预处理—高效裂解—柱分离—获取线粒体DNA等步骤，分别提取羊绒、羊毛，羊驼的线粒体DNA，并以此为模板进行PCR特异性扩增。

步骤2)中，羊绒，羊毛与羊驼绒cytB基因的序列相似度高达72.5％，本发明的重点在于找到三者cytB基因各自的特征序列，得到了三种特异性引物，分别扩增长度不同的cytB基因片段，通过扩增cytB片段长度的差异，达到定性鉴别的目的。

所述的PCR特异性扩增的反应条件为：90℃～95℃预变性3～10min，90℃～99℃变性15s～1min，30℃～45℃复性30s～1min，65℃～80℃延伸30s～1min，经过20～40个循环后，最后65℃～80℃延伸5～15min。进一步优选，PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，35℃复性45s，72℃延伸30s，经过30个循环后，最后72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、基于cytB基因羊绒、羊毛和羊驼绒之间非同源性序列设计特异性引物，进行PCR扩增定性鉴别羊绒、羊毛和羊驼绒，只要样品其含量≥0.5％，就可利用DNA技术定性鉴别出羊绒、羊毛或羊驼绒组分的存在。

2、对于羊绒、羊毛和羊驼绒的混合物，当羊绒含量≥0.5％，羊驼绒含量≥5％时，PCR扩增技术定性可同时鉴别羊绒、羊毛及羊驼绒纤维，避免了人为因素的影响，检测准确性、灵敏度极高，对解决贸易纠纷，尤其是国际性贸易争端必将发挥重要作用。

3、分别针对羊绒、羊毛及羊驼绒纤维cytB基因设计特异性引物的扩增技术，有效提高了羊绒检测的灵敏度，为PCR技术在毛绒制品方面的推广应用奠定了基础，同时为基于PCR技术的羊绒、羊毛及羊驼绒纤维定性测研究提供了有力的技术保障。

附图说明

图1为纯羊绒样品分别采用羊毛、羊绒及羊驼绒引物进行扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊毛特异性引物，2为采用羊绒特异性引物，3为采用羊驼绒特异性引物；

图2为纯羊毛样品采用羊毛特异性引物进行扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊毛特异性引物；

图3为纯羊驼绒样品采用羊驼绒特异性引物进行扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊驼绒特异性引物；

图4是羊绒含量分别为0.5％、1％、5％、10％、20％的5个样品均采用羊绒特异性引物进行扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4、5为5个样品；

图5是羊毛含量分别为0.5％、1％、5％、10％、20％的5个样品均采用羊毛特异性引物进行扩增的结果图；

图6是羊驼绒含量分别为0.5％、1％、5％、10％的4个样品均采用羊驼绒特异性引物进行扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4为4个样品；

图7是按不同比例混合的羊绒、羊毛和羊驼绒纤维采用三种引物进行PCR扩增的结果图，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4为表1中的4个样品。

具体实施方式

本发明具体实施方式中，出现的百分数，如无特别说明，均为质量百分数。

1、材料、试剂与仪器

标准参考材料：从内蒙古收集来的纯羊绒，以及上海第一纺织有限公司的细羊毛，羊驼。一般没有市售的参考纤维混合物、纤维混纺是由两种或三种不同的参考材料(羊绒/羊毛+羊驼)定量混合制备，具体如表1所示，表1中的百分数为质量百分数，这些参考混合物通过显微镜检查进行了分析。

试剂：Biomiga试剂盒；仪器：PCR扩增仪(5331型eppendorf基因扩Germany)；冷冻干燥器(6870SPEX SamplePrepUSA)

表1

编号羊绒比例(％)羊驼毛比例(％)羊毛比例(％)10.50.59921198355904101080

本发明利用比对的羊绒、羊毛和羊驼绒之间非同源性序列设计特异性引物，并确保扩增的cytB基因片段长度不同，设计引物见表2。

表2

将毛绒制品在冷冻干燥器用液氮研磨(6870SPEX SamplePrepUSA)加工成细小的颗粒。研磨时注意以下条件：先预冷5min，然后以每秒10次的速率运行，1min内运行2个循环，再冷却1min。选用Biomiga试剂盒(厂家：www.biomiga.com，型号：GD2512-01)，按说明书步骤，将粉碎的毛绒制品进行蛋白酶，DTT预处理—高效裂解—柱分离—获取线粒体DNA等步骤，分别提取羊绒、羊毛，羊驼的线粒体DNA，并以此为模板进行PCR特异性扩增。PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，35℃复性45s，72℃延伸30s，经过30个循环后，最后72℃延伸10min。

如果样品中仅存在羊绒、羊毛或羊驼纤维，那么用相应的引物可以扩增出目的条带，但用其他引物则无扩增结果。

当毛绒制品为纯羊绒样品，分别采用羊毛、羊绒及羊驼绒引物进行扩增相应的毛绒，扩增结果见图1所示，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊毛特异性引物，2为采用羊绒特异性引物，3为采用羊驼绒特异性引物，由于该样品为纯羊绒，因此，采用羊绒特异性引物可以扩增出目的条带，采用羊毛特异性引物和羊驼绒特异性引物不能扩增出目的条带。从图1中可以看出，当模板为羊绒，仅羊绒的cytB基因得到特异性扩增。

当毛绒制品为纯羊毛样品，采用羊毛特异性引物进行扩增，扩增结果见图2所示，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊毛特异性引物，由于该样品为纯羊毛，因此，采用羊毛特异性引物可以扩增出目的条带，得到特异性扩增。

当毛绒制品为纯羊驼绒样品，采用羊驼绒特异性引物进行扩增，扩增结果见图3所示，其中，M为Marker，作为标记，1为采用羊驼绒特异性引物，由于该样品为纯羊驼绒，因此，采用羊驼绒特异性引物可以扩增出目的条带，得到特异性扩增。

当毛绒制品为混合毛绒制品，采用5个样品，编号为1～5的5个样品中，羊绒含量分别为0.5％、1％、5％、10％、20％，均采用羊绒特异性引物进行扩增，扩增结果见图4所示，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4、5为5个样品，由于5个样品均含有羊绒，因此，在图4中，都可以扩增出目的条带，得到特异性扩增。

采用编号为1～5的5个样品中，羊毛含量分别为0.5％、1％、5％、10％、20％，均采用羊毛特异性引物进行扩增，扩增结果见图5所示，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4、5为5个样品，由于5个样品均含有羊毛，因此，在图5中，都可以扩增出目的条带，得到特异性扩增。

采用编号为1～4的4个样品中，羊驼绒含量分别为0.5％、1％、5％、10％，均采用羊驼绒特异性引物进行扩增，扩增结果见图5所示，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4为4个样品，由于4个样品均含有羊驼绒，因此，在图6中，都可以扩增出目的条带，得到特异性扩增。

由图4、5和6可知，当混合样品中羊绒比例、羊毛比例或羊驼绒的比例≥0.5％时，利用特异性引物，PCR扩增技术均能准确定性。

将羊绒、羊毛和羊驼绒纤维按不同比例混合，具体详见表1，采用表2中的三种引物，进行PCR扩增实验，结果见图7，其中，M为Marker，作为标记，1、2、3、4为表1中的4个样品对应的扩增结果图。从图7中可以看出，混合样品中同时检测多种成分时，羊绒含量仅为0.5％时，就有相应的扩增条带，当混和样品中羊驼绒的含量≥5％时，有相应的扩增条带。