Entwicklung einer Methode zur Diskriminierung lebender Salmonella-Enteritidis- und Salmonella-Typhimurium-Impfstämme sowie Etablierung und Evaluierung einer molekularbiologischen Methode zur raschen Identifizierung von Salmonella-Serovaren

摘要

Ziel dieser Arbeit war es, die zeit- und kostenintensive Salmonellen-Serotypisierung mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden zu komplettieren und nach Möglichkeit zu ersetzen. Es war geplant, verschiedene publizierte, molekularbiologische Nachweise zu prüfen und gegebenenfalls zu erweitern. Hierfür wurde ein Aufbau dreier Multiplex-PCRs (RAJTAK et al., 2011) und ein High Resolution Melting (HRM) (BRATCHIKOV & MAURICAS, 2011) etabliert und anschließend evaluiert.udZudem sollte im Rahmen dieses Projektes eine molekularbiologische Methode zur Unterscheidung von lebenden Impf- und Feldstämmen der Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium entwickelt werden. Deshalb war geplant, die genetischen Grundlagen der phänotypischen Marker zu ergründen und anhand dieser ebenfalls ein High Resolution Melting für die Differenzierung der Impf- und Feldstämme zu entwickeln.udFür die Salmonella-Serovar-Differenzierung mittels Multiplex-PCRs (RAJTAK et al., 2011) wurden 210 Stämme verteilt auf 31 Serovare geprüft. Es konnten hier jedoch nur wenige Serovare eindeutig differenziert werden (Salmonella Livingstone, Salmonella Goldcoast, Salmonella Ohio, Salmonella Kentucky, Salmonella Typhimurium, Salmonella-Typhimurium-Variante monophasisch (1,4,[5],12:i:-), Salmonella Subspezies IIIb, Salmonella Enteritidis sowie der IDT-Salmonella-Enteritidis-Impfstamm). Für die übrigen Serovare konnte in Verbindung mit der Gelelektrophorese nur eine grobe Einteilung in insgesamt zehn Gruppen erreicht werden. Diese Gruppen enthielten bis zu zehn Serovare. Zudem konnten sehr wichtige Serovare wie Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium nicht endgültig differenziert werden. Für spezielle Fragestellungen, wie die Differenzierung der eindeutig unterscheidbaren Serovare, könnten diese Ergebnisse dennoch nützlich sein.udDas High Resolution Melting nach Bratchikov und Mauricas aus dem Jahr 2011 wurde mit guten Ergebnissen evaluiert. Es konnten alle geprüften 100 Proben (zusammengesetzt aus 21 Serovaren) innerhalb eines Laufes mit dem LightCycler® 96 differenziert werden. Für eine zusätzliche Verbesserung dieser Methode, in Form einer genaueren Differenzierung des Serovars Salmonella Typhimurium, sollte das Protokoll um Differenzierungsmöglichkeiten für die Salmonella-Typhimurium-Variante O5-negativ (1,4,12:i:1,2) und die Salmonella-Typhimurium-Variante monophasisch (1,4,[5],12:i:-) erweitert werden. Dies gelang gänzlich für die monophasische Variante (1,4,[5],12:i:-) durch eine Erweiterung der HRM-Analyse mit dem Primerpaar FljB 1,2;1,5 nach Rajtak et al. aus dem Jahr 2011 sowie teilweise für die Variante O5-negativ (1,4,12:i:1,2). In den gesetzlichen Grundlagen, wie der Geflügel-Salmonellen-Verordnung und allen relevanten EU-Verordnungen für Bekämpfung von Salmonellen beim Geflügel, werden alle Varianten als Salmonella Typhimurium klassifiziert und deshalb gleich behandelt. Alle anderen Verordnungen, wie die Rinder-Salmonellose-Verordnung oder die Verordnung für Meldepflichtige Tierkrankheiten, erfassen ohnehin alle Salmonellen-Serovare. Somit ist eine weitere Unterscheidung der Serovare nicht notwendig, bietet aber Möglichkeiten für eine tiefgründigere Diagnostik, falls diese gewünscht ist. Auch ein Nachteil gegenüber der serologischen Differenzierung stellt sich durch die nur teilweise Differenzierungsmöglichkeit der Variante O5-negativ somit nicht. Um die Anwendbarkeit der HRM-Analyse in der Routinediagnostik, insbesondere bei auftreten neuer Serovare, besser beurteilen zu können, muss diese molekularbiologische Methode jedoch zunächst über einen längeren Zeitraum parallel zur klassischen Diagnostik angewandt werden, bevor sie in der Routinediagnostik verwendet werden kann. Mit Hilfe dieser Methode könnte allerdings, bei in etwa gleichem finanziellem Aufwand, ein erheblicher Zeitgewinn bei der Salmonellen-Differenzierung erzielt werden. Voraussetzung hierfür wäre jedoch das Vorhandensein eines HRM-fähigen Gerätes.udDie Entwicklung einer molekularbiologischen Methode für die Impfstamm/Feldstamm-Differenzierung konnte ebenfalls mit sehr gutem Ergebnis durchgeführt werden. Es konnten mehrere Punktmutationen, sogenannte single nucleotide polymorphisms (SNPs), auf verschiedenen Genen (rpoB und his) mittels Sequenzierung entdeckt werden. Anschließend wurden HRM-Tests entwickelt, die die SNPs aller vier zugelassenen Salmonella-Lebendimpfstämme eindeutig differenzieren können. Diese Methode wurde auf dem LightCycler® 96 erfolgreich etabliert und die mögliche Durchführung der HRM-Analysen auch auf zwei weiteren Geräten (LightCycler® 480 und Rotor Gene Q) geprüft. Hier zeigte sich, dass der Rotor Gene Q ebenso alle vier Impfstoffe, der LightCycler® 480 hingegen aufgrund einer schlechteren Auflösung nur drei Impfstoffe unterscheiden kann. udDie entwickelte Methode bietet eine erhebliche Zeitersparnis, da die derzeitige Unterscheidung anhand der phänotypischen Merkmale eine Inkubation von 18-24 Stunden (LAH-Impfstämme) beziehungsweise 18-48 Stunden (IDT-Impfstämme) benötigt. Die Laufdauer der entwickelten HRM-Analyse hingegen beträgt nur 1,5 Stunden.