SCML2在诊断胃肠胰神经内分泌肿瘤中的应用

摘要

本发明涉及Sex Comb on Midleg Like‑2(SCML2)在诊断胃肠胰神经内分泌肿瘤(Gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors,GEP‑NETs)中的应用。具体地说，SCML2在GEP‑NETs组织中呈现特异性表达，免疫组化检测组织中SCML2联合Syn或CgA可100％诊断GEP‑NETs，而且血清SCML2的检测对GEP‑NETs诊断也具有较高的特异性。另外，本发明还建立了ELISA方法检测血清SCML2的水平。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种SCML2在诊断胃肠胰神经内分泌肿瘤中的应用。

背景技术

神经内分泌肿瘤(NETs)可发生于身体各部位，其中以胃肠道和胰腺最为常见，并将发生于这些部位的NETs统称为胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NETs)。较之临床上常见的肿瘤，GEP-NETs相对罕见(据统计胰腺及胃肠道的发病率分别为1：100000，1.95-2.5：100000)，近年来随着临床诊断水平的提高及NETs实际发病率的增加，流行病学显示其发病率比30年前增高了约5倍。尽管诊断工具的改进和对神经内分泌肿瘤认识的提高，但多数患者缺乏典型临床表现，早期常难以发现，平均确诊周期为5-7年，使得转移风险大大增加，因此，提高GEP-NETs的早期诊断水平对治疗以及改善预后显得尤为重要。

肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生的一类物质。目前公认的评估理想肿瘤标志物的指标包括：灵敏度，特异性，与病情严重程度、肿瘤大小或分期相关性，评测肿瘤的治疗效果，预测肿瘤的预后等。就GEP-NETs而言，临床上常用的指标有突触素(Syn)、嗜铬素(CgA)、神经元特异性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)等。但这些传统的神经内分泌肿瘤标志物的敏感性和特异性都不是很理想，国内外学者一直在寻找有助于GEP-NETs诊断和预后判断的敏感性高且特异性好的新标志物。

1999年Montini等首先从果蝇的SCM基因Xp22染色体中鉴定出SCML2，SCML2基因总长约450-500Kb，在C端为高度保守内含子和外显子的结构。SCML2基因在哺乳动物广泛表达并且编码一个700个氨基酸的蛋白，如图1所示，其中，图1A为SCML2的基因位点图，图1B为SCML2的蛋白结构图。已有文献报道，SCML2在急性髓系白血病患者中过表达，在人肝细胞癌中参与调节激活的牙釉蛋白(AMELY)和血管生成，表明它参与细胞的分化及细胞周期的调控，且可能与肿瘤的发生发展相关。

目前SCML2在GEP-NETs组织或血清中的检测，国内外尚未见相关文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种SCML2在诊断胃肠胰神经内分泌肿瘤中的应用，提高诊断标志物的敏感性和特异性。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供SCML2在制备诊断胃肠胰神经内分泌肿瘤的产品中的应用。

其中，所述产品为用于免疫组化实验的肿瘤标志物SCML2、肿瘤标志物Syn、肿瘤标志物CgA、肿瘤标志物SCML2+Syn、肿瘤标志物SCML2+CgA或肿瘤标志物SCML2+CgA+Syn。

进一步，所述免疫组化实验包括如下步骤：

(1)处理新载玻片及盖玻片：将新载玻片及盖玻片浸泡于酸缸中时间不少于24h，流动清水充分漂洗及ddH₂O冲洗3遍，随后将其浸泡于95％酒精中至少24h，电热恒温干燥箱烤干洗净的玻片；同时将载玻片浸入APES工作液中停留20～30s，用ddH₂O洗去残留的APES，再置于通风橱内晾干，处理好的载波片和盖玻片储存于玻片盒中备用；

(2)切片及烘片：胃肠胰神经内分泌肿瘤组织浸蜡处理，包埋成蜡块，切成厚度为4-5μm的薄片，60℃烘片6h～8h；

(3)脱蜡及水化组织切片：3次分别浸入二甲苯15min，2次分别浸入无水酒精10min，2次分别浸入95％乙醇5min，1次分别浸入80％乙醇、70％乙醇各5min，接着自来水冲洗1min，ddH₂O冲洗2min，最后分别用0.01mol/LPBS冲洗3次；

(4)阻断组织中内源性过氧化物酶：每张切片加50μl 3％的H₂O₂-甲醇，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，3次分别用0.01mol/LPBS冲洗3min；

(5)抗原修复：在高压锅内加入适量的水，置于电磁炉上加热煮沸，将石蜡组织切片浸入装满柠檬酸缓冲液的瓷缸，再将瓷缸放入高压锅内，加压并加热至喷气，维持3min后关闭电磁炉，待高压锅内压力正常后取出瓷缸，并等待缸内液体自然冷却直至室温，取出石蜡组织切片，用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min；

(6)封闭切片：将切片上多余的水分擦净，封闭血清滴加至切片上，随后在室温下孵育2h；

(7)一抗孵育：将切片上的血清洗净，每张切片加1滴小鼠抗人SCML2单克隆抗体，在室温条件下孵育1h，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min；

(8)试剂1：除去PBS，每张切片加50μl聚合物增强剂试剂，室温下孵育20min，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min；

(9)试剂2：用吸水纸擦去载玻片上的多余水分，每张切片滴加由HRP标记的羊抗小鼠IgG-HRP，室温下孵育30min，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min；

(10)显色：按照DAB浓缩液试剂C：DAB稀释试剂B＝1：50的比例配制DAB工作液，将切片浸泡于DAB工作液中，保持30s，然后在显微镜下观察组织的显色程度，待阳性反应出现后，于流水下晃洗玻片以及时终止显色反应；

(11)复染：用苏木素复染切片20s，于流水下晃洗，在1％盐酸-乙醇中分化10s，再次置于流水中冲洗；

(12)脱水：将切片依次放置于70％乙醇3min、80％乙醇3min、95％乙醇5min、无水乙醇5min、二甲苯8min×2次进行脱水；

(13)封片：使用中性树脂封固切片，封片过程中不能产生气泡；

(14)免疫组化结果评定。

本发明实施例还提供一种用于检测血清中的SCML2及其在胃肠胰神经内分泌肿瘤组织中呈特异性表达的ELISA检测试剂，包括PBS、洗涤液、封闭液、一抗、二抗、96孔酶标板、牛血清白蛋白(BSA)。

其中，所述的PBS由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、去离子水组成；所述PBS中，氯化钠的浓度为18g/L，氯化钾的浓度为0.2g/L，磷酸氢二钠的浓度为3.63g/L，磷酸二氢钾在所述PBS中的浓度为0.24g/L。

其中，所述的洗涤液由上述配制的PBS和Tween20组成，所述洗涤液中Tween20的体积百分比为0.05％。

其中，所述的封闭液是由上述配制的PBS和BSA组成的BSA-PBS液，所述BSA-PBS液中BSA的浓度为1g/L。

其中，所述的一抗为小鼠抗人SCML2单克隆抗体(1：30稀释)，所述的二抗为羊抗小鼠IgG-HRP(1：1000稀释)。

本发明实施例还提供一种利用上述的ELISA检测试剂检测血清中SCML2的ELISA检测方法，包括如下步骤：

(Ⅰ)包被：取待测血清加入96孔酶标板，50μl/孔，4℃过夜；

(Ⅱ)封闭：弃去包被血清，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入封闭液(PBS-1％BSA)200μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅲ)弃去封闭液，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤1次，加入1：30稀释的小鼠抗人SCML2单克隆抗体100μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅳ)弃去抗体，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入1：1000稀释好的羊抗小鼠IgG-HRP，100μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅴ)弃去抗体，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB)100μl/孔，37℃避光孵育1h；

(Ⅵ)加入终止液50μl/孔；

(Ⅶ)读板：于酶标仪450nm波长处测OD值；

(Ⅷ)统计数据：血清SCML2测定值用中位数(范围)表示，各组间的差异采用秩和检验，界值的确定用ROC曲线。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

1、本发明的目的在于针对现有神经内分泌肿瘤标志物的不足，为GEP-NETs找到一个新的特异性诊断标志物。

2、本发明所述的SCML2在GEP-NETs组织中呈现特异性表达，免疫组化检测组织中SCML2联合Syn或CgA可100％诊断GEP-NETs。

3、本发明表明血清中的SCML2检测对GEP-NETs诊断也具有较高的特异性，除胰腺癌组出现部分假阳性外，在其他良性疾病组及胃肠道腺癌组SCML2水平均低于诊断界值；胰腺腺癌组SCML2水平的轻度升高，可能与SCML2在胰岛组织轻度表达，腺癌致胰岛细胞破坏后SCML2分泌入血有关。

附图说明

图1为本发明背景技术中SCML2的基因位点图和蛋白结构图；

图2为本发明实施例二中免疫组化检测SCML2在GEP-NETs、癌旁组织及腺癌组织中的×200倍的表达；

图3为本发明实施例三中直接ELISA法检测血清中CSML2所测OD值；

图4为本发明实施例三中直接ELISA法检测SCML2诊断GEP-NETs的ROC曲线。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

下述实施例中所使用的免疫组化实验仪器及来源：

(1)全自动组织脱水机：德国LEICA公司；

(2)组织包埋机：德国LEICA公司；

(3)石蜡切片机(RM-2145型)：德国LEICA公司；

(4)病理组织漂烘仪(PHY型)：常州中威仪器公司；

(5)纯水处理仪：上海宝尔公司；

(6)光学显微镜：日本OLYMPUS公司；

(7)医用微波炉：广东顺德微波制品有限公司；

(8)数字图象采集系统：日本尼康公司。

下述实施例中所使用的免疫组化实验试剂及来源：

(1)APES浓缩液：北京中山生物技术有限公司；

(2)APES工作液：APES浓缩液(50×)用丙酮做1：50稀释，使用前临时配置；

(3)PBS缓冲液(pH7.2-7.4)：氯化钠137mmol/L，氯化钾2.7mmol/L，磷酸氢二钠4.3mmol/L，磷酸二氢钠1.4mmol/L；

(4)0.01mmol/L pH6.0柠檬酸缓冲液：北京中山生物技术有限公司；

(5)山羊血清：上海华美生物工程公司；

(6)BSA：Sigma公司；

(7)封闭血清：含0.1％BSA和1.5％山羊血清的0.01mmol/L PBS缓冲液；

(8)一抗：鼠抗人SCML2、Syn、CgA单克隆抗体，Santa Cruz公司，USA；

(9)二步法免疫组化检测试剂盒：含有试剂1(Polymer Helper，即用型)和试剂2(poly-HRP anti-mouse IgG，即用型)，GIB公司；

(10)二抗稀释液：含0.3％Triton-X 100、0.1％BSA、1.5％山羊血清、0.03％NaN₃的0.01mmol/L>

(11)DAB：北京中山生物技术有限公司；

(12)70％乙醇：95％医用乙醇368ml，加ddH₂O定容至500ml；

(13)80％乙醇：95％医用乙醇421ml，加ddH₂O定容至500ml；

(14)二甲苯：北京中山生物技术有限公司；

(15)3％的H₂O₂—甲醇：30％H₂O₂>

(16)中性树脂：北京中杉金桥生物技术有限公司。

下述实施例中所使用的血清SCML2检测用主要仪器及来源：

(1)Thermo Multiskan Ascent酶标仪：Labsystems Dragon，Finland；

(2)低温离心机(HETTICH)：德国生产；

(3)PHS-3B型精密pH计：上海雷磁仪器厂；

(4)ZHWY-344型翘板式脱色摇床：上海智城；

(5)81-2型磁力恒温搅拌器：上海曹行无线电元件厂；

(6)美国宝特ELX-50洗板机；

(7)架盘式药物天平：上海医疗八厂；

(8)电子天平：Sartorius analytic；

(9)-80℃冰箱：日本SANYO公司生产的MDF-U71V型。

下述实施例中使用的血清SCML2检测用主要试剂及来源：

(1)0.01mol/L PBS(pH7.2～7.4)：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄>

(2)洗涤液：吸取0.5mL Tween20至1000mL的烧杯中，加入上述配制的0.01mol/L PBS至1000mL，混匀备用；

(3)1％BSA-PBS液：准确称取BSA 1g，加入上述配制的0.01mol/L PBS至1000mL，混匀溶解4℃放置备用；

(4)一抗：小鼠抗人SCML2单克隆抗体(1：30稀释)：Santa Sruz公司，USA；

(5)二抗：羊抗小鼠IgG-HRP(1：1000稀释)：Santa Cruz公司，USA；

(6)96孔酶标板：NUNC公司，USA；

(7)牛血清白蛋白(BSA)：invitrogen，USA。

实施例1：研究资料及标本

一、组织标本收集

收集南通大学附属医院2009年1月～2014年1月间手术切除并经病理证实的GEP-NETs以及相对应的癌旁组织的石蜡切片64例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及激素治疗。肿瘤分类按照WHO(2010)神经内分泌肿瘤分类标准，病理分级是基于细胞的增殖活性以及核分裂指数。患者的临床资料收集于病案室档案库，包括年龄、肿瘤大小、临床分期、病理特征、手术时间等。其中男36例、女28例；患者年龄≤60岁38例、>60岁26例；肿瘤部位在食道/胃10例、肠道40例、胰腺14例；肿瘤直径≤3cm50例、>3cm14例；病理类型NET 36例、NEC 26例、MANEC 2例；病理分级G1有24例、G2有14例、G3有26例；伴有淋巴转移22例、无淋巴转移42例；伴有远处转移6例、无远处转移58例；TMN分期Ⅰ～Ⅱ期28例、Ⅲ～Ⅳ期36例。另外分别收集胃、肠、胰腺癌各10例，同时进行SCML2检测。

GEP-NETs、非神经内分泌肿瘤、其他胰腺良性疾病血清标本来源于南通大学附属医院2013年10月至2015年10月的住院患者，正常人血清为南通大学附属医院体检中心体检健康者。胰腺疾病患者血清均在未作任何治疗前采集，清晨空腹采集静脉血，血清分离后，用1.5ml离心管分装，立即置-80℃冰箱保存待测。所有样本分为8组：GEP-NETs组10例，男6例，女4例，中位年龄48岁；胃腺癌组10例，男7例，女3例，中位年龄62岁；肠腺癌10例，男5例，女5例，中位年龄58岁；胰腺癌组50例，男26例，女24例，中位年龄68岁；壶腹部癌10例，男7例，女3例，中位年龄57岁；胰腺良性囊性占位10例，男5例，女5例，中位年龄45岁；急性胰腺炎组15例，男8例，女7例，中位年龄53岁；正常体检者15例，男8例，女7例，中位年龄27岁。所有病例均经临床及/或病理学证实。

二、病例随访

所有病例均取得病人家属的知情同意，采用电话查访、随访信及必要时上门随访，进行64例GEP-NETs随访资料收集，随访终点时间为2015年12月。

实施例2：免疫组化检测组织中SCML2

一、免疫组化实验流程(二步法)

(1)处理新载玻片及盖玻片：将新载玻片及盖玻片浸泡于酸缸中时间不得少于24h，流动清水充分漂洗及ddH₂O冲洗3遍后，随后将其浸泡于95％酒精中至少24h，电热恒温干燥箱烤干洗净的玻片。另外对载玻片要经以下处理以防止脱片：将其浸入APES工作液(即APES浓缩液用丙酮按1：50稀释)中停留20～30s，用ddH₂O洗去残留的APES，再置于通风橱内晾干。处理好的玻片储存于玻片盒中备用。

(2)切片及烘片：所需肿瘤组织浸蜡处理，包埋成蜡块，切成厚度为4-5μm的薄片(切片要求平整，尽量避免因刀的缺口造成组织划痕，以免影响组织细胞的形态完整，出现非特异性着色)，60℃烘片6h至8h。

(3)脱蜡及水化组织切片：3次分别浸入二甲苯(60℃)15min，2次分别浸入无水酒精10min，2次分别浸入95％乙醇5min，1次分别浸入80％乙醇、70％乙醇各5min，接着自来水冲洗1min，ddH₂O冲洗2min，最后分别用0.01mol/LPBS冲洗3次。

(4)阻断组织中内源性过氧化物酶：每张切片加50μl 3％的H₂O₂-甲醇，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，3次分别用0.01mol/LPBS冲洗3min。

(5)抗原修复：在高压锅内加入适量的水，置于电磁炉上加热煮沸，将石蜡组织切片浸入装满柠檬酸缓冲液的瓷缸，在将瓷缸放入高压锅内，加压并加热至喷气，维持3min后关闭电磁炉，待高压锅内压力正常后取出瓷缸，并等待缸内液体自然冷却直至室温，然后石蜡组织切片用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min。

(6)封闭切片：将切片上多余的水分擦净，封闭血清滴加至切片上，随后在室温下孵育2h。

(7)一抗孵育：将切片上的血清洗净，每张切片加1滴一抗，在室温条件下孵育1h，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min。

(8)试剂1：除去PBS，每张切片加50μl聚合物增强剂试剂(Polymer Helper，作用是改变细胞通透性，使其更好的结合一抗)，室温下孵育20min，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min。

(9)试剂2：用吸水纸擦去载玻片上的多余水分，每张切片滴加由HRP标记的二抗(poly-HRP anti-mouse IgG)，室温下孵育30min，使用0.01mol/LPBS冲洗3次，每次1min。

(10)显色：按照DAB浓缩液试剂C：DAB稀释试剂B＝1：50的比例配成DAB工作液，将切片浸泡于DAB工作液中，保持30s，然后在显微镜下观察组织的显色程度，待阳性反应出现后，于流水下晃洗玻片以及时终止显色反应。

(11)复染：用苏木素复染切片20s，于流水下晃洗，在1％盐酸-乙醇中分化10s，再次置于流水中冲洗。

(12)脱水：将切片依次放置于70％乙醇3min、80％乙醇3min、95％乙醇5min、无水乙醇5min、二甲苯8min×2次进行脱水。注：切片从无水酒精中拿出后至少在通风橱中吹干15min，再置入二甲苯中浸泡。

(13)封片：使用中性树脂封固切片，封片过程中不能产生气泡。

二、免疫组化结果评定标准

在高倍镜下对每张切片具有代表性的肿瘤区域随机取5个不同的视野，用细胞计数软件进行计数，SCML2蛋白阳性表达主要位于细胞核内，以出现淡黄色至棕褐色颗粒且染色强度高于背景特异性着色者为阳性细胞。首先计数阳性细胞数，无阳性细胞数为0分，1％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，≥76％为4分；其次看染色强度，无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按照两者的相加分数分为4个等级：“-”(0～2)，“+”(3～5)，“++”(6～8)，“+++”(9～12)，得分≥3为阳性表达。以上结果由至少两位病理科医生在双盲情况下观察所得。

三、免疫组化结果

1、免疫组化检测SCML2、Syn、CgA在GEP-NETs、癌旁及腺癌组织中的表达

如图2所示，免疫组化结果显示：SCML2在胃、肠、胰腺神经内分泌肿瘤石蜡切片中高表达，且主要定位于细胞核，染色呈棕黄色或棕褐色(图2a1，a2，a3)。而在对应的胃、肠癌旁组织(图2b1，b2)及胃、肠腺癌组织(图2c1，c2)中则不表达。尽管SCML2在胰腺的胰岛细胞中呈现一定水平的表达(图2b3，c3)，但依据组化结果评定标准得分均<3，故SCML2在胰腺的胰岛细胞及腺癌组织中呈阴性表达。图2中，a1、a2、a3分别为胃、肠、胰腺神经内分泌肿瘤组织；b1，b2，b3分别为胃、肠、胰腺相对应的癌旁组织；c1，c2，c3分别为胃、肠、胰腺腺瘤组织；其中b3，c3图中所圈点为胰腺的胰岛组织。

此外，Syn和CgA主要在GEP-NETs的胞浆中表达(图略)，并对SCML2、Syn、CgA三者的表达阳性率及表达强度进行比较。结果显示在GEP-NETs中SCML2表达阳性率及表达强度最高[90.6％(58/64)，大多数为(++)、(+++)]，Syn[84.4％(54/64)，大多数为(+)]，CgA[71.9％(46/64)，大多数为(+)]。三项指标经秩和检验有统计学差异(P<0.05，见表1)。

表1 SCML2、Syn、CgA在GEP-NETs(n＝64)、癌旁组织(n＝64)以及其他腺癌组织(n＝30)中的表达分析

注：SCML2与Syn比较：Z＝4.179，P＝0.000；SCML2与CgA比较：Z＝5.449，P＝0.000；Syn与CgA比较：Z＝2.073，P＝0.0382；Z值和P值经秩和检验。

2、联合检测SCML2、Syn及CgA对GEP-NETs的互补诊断价值

为探讨SCML2与其他神经内分泌肿瘤标志物Syn、CgA之间的相关性，采用Spearman等级相关法对GEP-NETs患者组织中SCML2、Syn及CgA检测结果间作等级相关分析。如表所示，SCML2、Syn及CgA之间相关系数较小，P均>0.05，表明三者无相关性，提示联合检测上述三种指标对GEP-NETs存在互补诊断价值(见表2)。

表2 SCML2与其他神经内分泌肿瘤标志物Syn、CgA之间的相关性

注：R值和P值采用Spearman等级相关分析方法。

联合检测SCML2和Syn、CgA中的任意指标提高了GEP-NETs诊断的敏感性和准确度。单独检测某一个指标敏感性和准确度都不是很高，但是联合检测SCML2和Syn或者SCML2和CgA均可将诊断敏感性和准确度提高至100％(见表3)。

表3联合检测SCML2、Syn及CgA诊断胰腺癌的互补诊断价值(％)

注：*P<0.05，SCML2、Syn、CgA与(SCML2+Syn)、(SCML2+CgA)的比较采用了卡方检验或确切概率法。

实施例3：ELISA法检测血清中的SCML2

一、直接ELISA法检测血清中CSML2的步骤

(Ⅰ)包被：取待测血清加入96孔酶标板，50μl/孔，4℃过夜；

(Ⅱ)封闭：弃去包被血清，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入封闭液(PBS-1％BSA)200μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅲ)弃去封闭液，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤1次，加入小鼠抗人SCML2单克隆抗体(1：30稀释)100μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅳ)弃去抗体，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入稀释好的羊抗小鼠IgG-HRP(1：1000稀释)100μl/孔，37℃孵育1h；

(Ⅴ)弃去抗体，以洗涤液(PBS-0.05％Tween20)300μl/孔，洗涤3次，加入底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB)100μl/孔，37℃避光孵育1h；

(Ⅵ)加入终止液：50μl/孔；

(Ⅶ)读板：于酶标仪450nm波长处测OD值，结果如图3所示。

二、ELISA法检测血清SCML2及SCML2对GEP-NETs的诊断价值

1、ELISA法检测上述血清样本中SCML2水平

结果如表4所示，检出结果均呈偏态分布，故以中位数表示各组检出值，SCML2在GEP-NETs组水平明显高于其它各组，经秩和检验，GEP-NETs组SCML2水平与其他各组比较，差异均有统计学意义(P均＜0.05)；胰腺癌组与SCML2水平与其余各组比较，差异均有统计学意义(P均＜0.05)。

表4各组SCML2的测定结果

。

2、直接ELISA法检测血清SCML2结果的ROC曲线

以GEP-NETs组SCML2所测结果为阳性组数据，非神经内分泌肿瘤组、良性胰腺疾病组及正常人组SCML2所测结果为阴性组数据，利用SPSS15.0软件绘制ROC曲线。SCML2曲线下面积0.891，95％可信区间0.828～0.955(P＝0.000)，表明SCML2对GEP-NETs有较高的诊断价值。当以OD值0.305为诊断界值时，其对GEP-NETs的诊断敏感性为80.0％，假阳性为14.5％(图4)。

3、检测血清SCML2对GEP-NETs诊断价值

当以OD值0.305为诊断界值时，SCML2对GEP-NETs组诊断敏感性为80.0％，对胰腺癌组的诊断敏感性为32.0％，其余各组均为阴性。GEP-NETs组SCML2明显高于其余各组，差异有统计学意义(P均<0.05)。当OD值取0.305时，假阳性均出现在胰腺癌组(见表5)。

表5 SCML2对GEP-NETs的诊断价值

注：a与b比较：P＝0.010；a及b分别与其他各组比较：P均<0.05。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。