一株植物乳杆菌及其在制备矫正社交行为制剂中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC No.13660及其应用。还公开了该菌株在制备矫正果蝇社交行为制剂中的应用；应用本发明可矫正果蝇的社交行为，并有望应用到人类自闭症疾病的诊疗中。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌及其应用于果蝇社交行为的矫正。

背景技术

肠道菌群失调会导致病原微生物过度生长，肠道的生理代谢状态紊乱，可以通过神经递质、代谢产物、细胞因子和中枢神经系统进行信息交流，影响宿主脑功能神经行为出现异常，进而影响情绪和认知行为(Mangiola et al.,2016)。肠道菌群失调研究发现大部分智能障碍以及自闭症的患者都出现肠道菌群紊乱、肠粘膜屏障功能受损的情况(Malkkiet al.,2014)。目前，多种神经系统疾病，尤其是基因突变导致认知和智能障碍如自闭症发病率居高不下，至今仍未寻找到有效的治疗方法。

KDM5家族蛋白是重要的激活或抑制基因表达的染色体蛋白(Blair et al.,2011)，KDM5蛋白在哺乳动物细胞中有四个家族成员，而果蝇具有单一KDM5同源物。KDM5蛋白参与多种生物学过程的调控，包括氧化应激、线粒体功能和神经系统的发育等，该蛋白功能的失调与智能障碍(Intellectual Disability，ID)以及自闭症(Autism)等疾病密切相关(Silver et al.,2014)，KDM5C突变会导致小鼠自闭症行为(Iwase et al.,2016)。这些突变位点与果蝇的KDM5蛋白具有显著的保守性。

果蝇作为一种经典的动物模型，其遗传背景清晰、繁殖快，已经在神经系统的发育等生命科学领域得到广泛的应用。果蝇的消化道与哺乳动物肠道非常相似，果蝇的微生物种群虽然比人类微生物种群简单，然而它们仍然动态影响果蝇生命活动，具体包括寿命、社交行为和脑功能等(Venuet al.,2014；Lee et al.,2013)。另一方面，这些微生物种群在人类的肠道中也共生，因此研究这些共生菌群与果蝇肠道的相互作用，对揭示人类肠道菌群进化保守的机制也具有重要意义。

果蝇的KDM5蛋白与人类的KDM5家族蛋白高度保守，以及KDM5P因子插入的突变体果蝇显示肠道菌群紊乱和社交行为缺陷等表型，因此，本发明在该研究背景和基础上，以果蝇为模型，从野生型果蝇中分离得到益生菌以改善KDM5突变果蝇的社交行为，从而为自闭症的诊疗奠定研究基础。

发明内容

本发明的目的是提供一株益生菌株及其在缓解自闭症社交行为缺陷方面的应用。

本发明所提供的菌株为一种植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum L168菌株，菌种保藏号为CGMCC No.13660。

本发明还公开了所述的植物乳杆菌CGMCC No.13660在制备矫正果蝇社交行为制剂中的应用。具体的方法是：将植物乳杆菌CGMCC No.13660在营养培养液中静置培养18h，离心收集和洗涤菌体；将10⁷CFU菌体悬浮于含2mL>

本发明所采用的研究模型为KDM5突变果蝇的肠道细、短，且存在多数气泡状的受损组织(图1所示)，社交行为也弱于野生型果蝇(如图2所示)。

本发明利用MRS固体培养基发现乳杆菌在KDM5突变果蝇肠道中的数量显著少于在野生型果蝇的肠道中(如图3所示)，本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC No.13660是一种兼性厌氧菌，在标准MRS培养基上厌氧环境下可生长，PCR结果表明为植物乳杆菌(如图3、图4所示)。

本发明中当果蝇摄入植物乳杆菌CGMCC No.13660后肠道内乳杆菌含量增高(如图5、图6所示)，植物乳杆菌No.CGMCC 13660可改善果蝇寿命和肠道缺陷(如图7所示)。

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC No.13660可改善果蝇社交行为(如图8所示)。

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCC No.13660不仅能够改善果蝇寿命、肠道缺陷，还能改善果蝇社交行为。

应用本发明可矫正果蝇的社交行为，并有望应用到人类自闭症疾病的诊疗中。

附图说明

图1.野生型果蝇w¹¹¹⁸和突变型果蝇kdm5^k6801/10424肠道形态结构。

图2.KDM5突变果蝇kdm5^k6801/10424存在社交行为缺陷。

图3.乳杆菌在野生型果蝇w¹¹¹⁸和突变型果蝇kdm5^k6801/10424肠道中的含量。

图4.植物乳杆菌CGMCC No.13660的16S rRNA部分序列的PCR扩增。

图5.果蝇喂完万古霉素后乳杆菌数量上升，万古霉素没有改善突变型果蝇kdm5^k6801/10424社交行为缺陷。

图6.果蝇摄入植物乳杆菌CGMCC No.13660后的乳杆菌数量增加。

图7.植物乳杆菌CGMCC No.13660可改善果蝇寿命和肠道缺陷。

图8.植物乳杆菌CGMCC No.13660可改善果蝇的社交行为。

具体实施方式

实施例一：突变果蝇肠道和社交行为的缺陷

利用果蝇kdm5^k6801和果蝇kdm5¹⁰⁴²⁴杂交后得到KDM5表达下调的突变果蝇kdm5^k6801/10424，突变果蝇kdm5^k6801/10424年龄显著低于野生型果蝇w¹¹¹⁸(Liu>http://flybase.org/；kdm5^k6801kdm5¹⁰⁴²⁴和w¹¹¹⁸果蝇均可从FlyBase(http://flybase.org/)购买。。kdm5^k6801/10424果蝇肠道短且细，肠道中存在多数气泡状的受损组织(图1)。根据文献(Mcneil>K6801/10424的社交距离显著性高于野生型果蝇(图2)。

实施例二：乳杆菌株的分离筛选、鉴定和生物学特性

1、菌株分离

解剖野生型果蝇w¹¹¹⁸和突变果蝇kdm5^k6801/10424雌性肠道，取4只果蝇肠道加入200μL无菌水中，研磨震荡后，取100μL涂布于MRS固体培养基中。MRS培养基的组成为：10g/L蛋白陈，5g/L牛肉粉，4g/L酵母粉，20g/L葡萄糖，1mL/L吐温80，2g/L磷酸氢二钾，5g/L乙酸钠，2g/L柠檬酸三铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，15g/L琼脂粉，pH>k6801/10424肠道内的乳杆菌数量显著少于w¹¹¹⁸肠道内的乳杆菌数量(图3)。从野生型果蝇w¹¹¹⁸的MRS平板上挑取不同形态的单菌落划线至新的MRS平板上，29℃过夜培养后，再次进行菌种平板划线纯化，共挑取20个单菌落。

2、SCL3-10菌株的鉴定及生物学特性

在MRS固体培养基上，菌落呈白色、光滑、不透明、有粘液、边缘规整。革兰氏阳性，过氧化氢酶实验阴性。

采用菌落PCR扩增16S rRNA基因序列并进行菌株的分类学鉴定。从含MRS固体培养基上用无菌牙签挑取单菌落，加入20μL无菌水，100℃加热10min。轻微离心后，取5μL作为模板。引物为设计的乳杆菌16S rRNA基因扩增通用引物E9F和E1541R(Baker et al.,2003)。引物由擎科新业生物技术(南京)有限公司合成。反应体系：Taq缓冲液(10×)2.5μL、MgCl₂(25mM)1μL、dNTP(2.5mM)2.5μL、E9F(10mM)1μL、E1541R(10mM)1μL、去离子水16.5μL、rTaq酶(2U/μL)0.5μL，共25μL总反应体积。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min(图4)。所得序列由生工生物工程(上海)有限公司测序后，得到的部分16S>

L168菌株于2017年2月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.13660。

实施例三：植物乳杆菌CGMCC No.13660矫正果蝇寿命和肠道形态

研究报道植物乳杆菌对万古霉素具有耐药性(Tynkkynen et al.,1998)，用3M滤纸片浸泡于含30μM万古霉素的5％蔗糖PBS缓冲液(0.2mol/L Na₂HPO₄/KH₂PO₄，pH>k6801/10424喂养万古霉素后乳杆菌含量显著增加(图5)，但社交行为没有改善(图5)。取保藏的植物乳杆菌CGMCC>7CFU喂养果蝇，解剖果蝇肠道观察肠道变化，结果表明果蝇摄入乳杆菌CGMCC>

实施例四：植物乳杆菌CGMCC 13660矫正果蝇社交行为

突变果蝇kdm5^k6801/10424的社交行为在摄入万古霉素后没有发生改善(图5)，而摄入乳杆菌后社交行为有所改善，果蝇间距离呈显著降低的趋势(图8)。

参考文献

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SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一株植物乳杆菌及其在制备矫正社交行为制剂中的应用

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<170> PatentIn version 3.3

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