可视化检测Hobi‑like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种可视化检测Hobi‑like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法。本发明合成特异性LAMP引物上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，所述试剂盒包括如下组分：10×Thermo Pol反应缓冲液、dNTP、MgSO

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

Hobi-like瘟病毒为2004年从巴西胎牛血清中分离的一种新的瘟病毒，与牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2型（BVDV-2）、猪瘟病毒（CSFV）和羊边界病毒(BDV)同属于黄病毒科。之后又相继在其他国家，如欧洲的意大利、瑞士，大洋洲的澳大利亚，美洲的墨西哥和亚洲的日本、印度和孟加拉等国发现了该病毒分布和存在。该病毒感染牛后表引起的症状与BVDV-1和BVDV-2感染牛表现出的症状相似，临床主要表现为呼吸道、消化道和生殖道疾病，因此某些病毒学研究者将其试命名为“BVDV-3”型。

我国学者2012年从污染的MDBK细胞中首次分离到该病毒，本实验室于2015年首次从患有呼吸道疾病的病羊体内分离到Hobi-like瘟病毒，毒株全基因登录号GenBankKU563155，表明该病毒不仅可以自然感染牛，而且可以感染羊等小反刍动物。目前兽医临床上对该病毒认识还不足够，临床上也没有建立良好的检测方法；只有少量实验室建立了常规的RT-PCR检测方法，套式RT-PCR方法和荧光定量PCR；这些方法往往存在需要精密仪器和特殊实验条件的限制，制约了现地应用。因此，建立一种实际应用性强的检测技术在基层推广应用，具有很强的临床意义。

环介导等温扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是当前应用最为广泛的一种核酸快速扩增的新型技术之一，该方法具有方便快速、操作简单、敏感性高、适用性强、结果准确等特点。此方法原理主要利用自动循环的链置换反应，核酸扩增一般可在60 min内完成，扩增效率一般高达到10⁹~10¹⁰个数量级。不仅如此，该方法对实验所用的仪器要求非常低，一台普通的水浴锅就可以完成全部实验反应。

中国专利申请CN103924006A公开了一种用于检测 HoBi 样瘟病毒（HoBi-likepestivirus）核苷酸片段的引物序列，属于动物病原微生物检测技术领域。 引物对包括 ：由序列为 TGGTTCGACGCATTAAGGAAT 的上游引物 HoBi-F 和序列为TCTCTGCAGCACCCTATCAG 的下游引物 HoBi-R 组成的引物对。该套引物序列根据GenBank上 HoBi 样瘟病毒 5′-UTR 基因序列设计，具有较高的灵敏度和特异性。但是，该专利引物所针对的序列并不能完全匹配某些经典毒株所对应的序列，即引物序列不能检测到所有Hobi-like瘟病毒的典型毒株，会造成漏检，而且需要昂贵的荧光定量PCR仪，临床实用性差。

中国专利CN101696453B公开了一种检测牛病毒性腹泻病毒的方法逆转录环介导等温扩增反应试剂盒的制备及其使用方法，它涉及反应试剂盒的制备及其使用方法。而且该试剂盒需要专业设备及专业人员参与检测且不适于现阶段中国畜牧业发展状况的问题。方法：首先设计引物，然后配制逆转录环介导等温扩增反应液，即完成。使用方法 ：取含牛病毒性腹泻病毒样品的 RNA 提取物， 加入反应液， 混合后进行逆转录环介导等温扩增反应，再离心检测；或加入10000×SYBR GREEN I，然后置于紫外灯下检测；或进行电泳检测；或采用 Real-time PCR 仪进行保温反应检测。但是，该专利试剂盒只能检测BVDV-1型毒株，并不能检测HoBi-like瘟病毒，而且采用紫外检测或者电泳检测，仍然不能直接肉眼观察，操作成本高。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可视化检测Hobi-like瘟病毒的的反转录环介导等温扩增引物，所述等温扩增引物包括上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游外引物F3和下游外引物B3，序列分别如下：

FIP：TACCCGGGGCTTCGGTAATCCGACGAGCATAATGGGGGAC；

BIP：GGTTCGACGCATCAACGAGTGGCCCGCTTGGGTTAAGACAT；

F3：GCGAAGGCCGAAATAGGTTA；

B3：GGCCACATAATCGACCATCT。

一种含有上述等温扩增引物的可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：10×Thermo Pol反应缓冲液、dNTP、MgSO₄、Bst>

优选地，所述试剂盒包括如下组分：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

FIP/BIP1.2μM

F3/B30.3μM

MgSO₄^>

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶8U

Ribonuclease Ihibitor10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

显色试剂 3mM

DEPC水 补足至24μL。

优选地，所述的显色试剂为羟基萘酚蓝。

一种利用上述的试剂盒进行的可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

（1）取病料样品，初步处理后，利用病毒RNA提取试剂盒提取样品基因组；

（2）在24μL环介导等温扩增试剂盒中的检测溶液中加入步骤（1）样品基因组1μL，于61℃恒温反应1h；同时，以在24μL环介导等温扩增试剂盒中的检测溶液中加入Hobi-like瘟病毒RNA模板1μL作为阳性对照；

（3）反应结束后直接肉眼观察，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。

优选地，所述的Hobi-like瘟病毒RNA模板为使用病毒RNA提取试剂盒提取的细胞培养Hobi-like瘟病毒液基因组RNA。

优选地，步骤（2）所述反应于PCR仪或者恒温水浴锅中进行。

本发明的积极有益效果：

1. 本发明使用两对引物，四个识别区域，相对现有的检测方法，特异性更高。

2. 本发明可视化检测Hobi-like瘟病毒的的反转录环介导等温试剂盒具有特异性强：利用Hobi-like瘟病毒环介导等温扩检测试剂盒对提取的牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）、牛疱疹病毒1型（BHV-1）、牛轮状病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）的病毒基因组，同时进行LAMP扩增，并设置阳性对照，扩增结果表明以其它病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明LAMP方法特异性高；

本发明可视化检测Hobi-like瘟病毒的的反转录环介导等温试剂盒具有敏感性高：利用Hobi-like瘟病毒环介导等温扩检测试剂盒和常规RT-PCR对倍比稀释的样品进行检测，结果表明：LAMP方法可检测到1>50/mL，而常规PCR扩增的方法只能检测到100>50/mL。由此可见，本发明LAMP方法具有更高的敏感性；

本发明可视化检测Hobi-like瘟病毒的的反转录环介导等温试剂盒具有快速性：相对普通PCR反应数小时的反应时间和检测时间，本发明检测方法仅需1个小时即可完成整个反应和结果判定；

本发明可视化检测Hobi-like瘟病毒的的反转录环介导等温试剂盒具有可操作性：相对于常规PCR，Hobi-like瘟病毒环介导等温扩检测试剂盒不需要昂贵的PCR仪，只需要一个简单的恒温水浴锅即可完成反应；且结果的检测可以直接肉眼判定，无需凝胶电泳等特殊仪器，因此本发明试剂盒具有较强的现地可操作性。

3. 本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。

附图说明

图1为本发明反转录环介导等温检测方法敏感性结果示意图，其中1：10⁴>50/mL；2：10³>50/mL；3：10²>50/mL；4：10¹>50/mL；5：10⁰>50/mL；6：10^-1>50/mL；7：阴性对照；

图2为常规RT-PCR检测方法敏感性凝胶电泳图，其中，1：阴性对照；2：10^{-1>TCID₅₀/mL；3：100>TCID₅₀/mL；4：101>TCID₅₀/mL；5：102>TCID₅₀/mL；6：103>TCID₅₀/mL；7：104>TCID₅₀/mL；M：DL2000>}

图3为本发明反转录环介导等温检测方法特异性检测凝胶电泳图，其中1：BVDV-1；2：BHV-1；3：BRV；4：BPIV-3；5：阳性对照。

具体实施方式

下面结合一些具体实施方式，对本发明进一步说明。

1、试剂盒相关材料

牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）和牛疱疹病毒1型（BHV-1）源于中国兽医药品监察所；牛轮状病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）和Hobi-like瘟病毒为实验室分离保存毒株。病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），Betaine（SIGMA公司），BstDNA聚合酶及10×Thermo pol反应缓冲液（Biolabs Inc公司），dNTP（clontech公司），AMV Reverse Transcriptase （promega公司）、Ribonuclease Ihibitor（NEB公司）、Mg²⁺及DL2000（TAKARA公司）。

2、LAMP引物的设计与合成

参考目前已发表的Hobi-like瘟病毒序列（登录号GenBank KU563155），针对瘟病毒属的保守区域5’-UTR区域，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorer设计了相关引物，引物包括：上游内引物FIP(SEQ ID NO:1)和下游内引物BIP(SEQ ID NO:2)，上游外引物F3(SEQ ID NO:3)和下游外引物B3(SEQ ID NO:4)，这4条引物序列如下所示：

FIP：TACCCGGGGCTTCGGTAATCCGACGAGCATAATGGGGGAC；

BIP：GGTTCGACGCATCAACGAGTGGCCCGCTTGGGTTAAGACAT；

F3：GCGAAGGCCGAAATAGGTTA；

B3：GGCCACATAATCGACCATCT；

设计完成的引物由苏州泓迅生物合成。

3、病毒基因组提取

利用北京全式金生物技术有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取细胞培养Hobi-like瘟病毒液、疑似有Hobi-like瘟病毒感染的患病动物组织样品、特异性对照病毒样品的病毒基因组。

4、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP反应体系的建立

所述试剂盒包括如下组分：

10×Thermo Pol反应缓冲液2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO₄0.8mM

dNTP1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase10U

羟基萘酚蓝3mM

DEPC水补足至24μL。

所述的反应体系如下包括如下组分：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

FIP/BIP1.2μM

F3/B30.3μM

MgSO₄0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶8U

Ribonuclease Ihibitor10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羟基萘酚蓝 3mM

样品模板RNA1μL

DEPC水 补足至25μL；

将上述组分混匀后放置于PCR仪内或者水浴锅中恒温61℃作用1小时；反应结束后可以进行凝胶检测或者肉眼观察对结果进行判定，两者判定结果一致；肉眼观察时，阳性结果显示为天蓝色，阴性结果显示为紫色。

5、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP检测试剂盒条件的优化

5.1 引物浓度优化

在25 μL的反应体系中以一对引物为变量，其他反应底物成分相同，依次对FIP与BIP（0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM、1.8μM、2.0μM）、F3与B3（0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM）两对引物进行浓度梯度优化，每个浓度重复3次，反应结束之后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

5.2 扩增时间优化

配置反应体系，每个时间条件的样品设置3个重复，分别在恒温水浴锅中反应30 min、45 min、60 min、75 min后取出，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

5.3 扩增温度的优化

配置反应体系，每个温度条件样品设置3个重复，分别在不同温度60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反应1小时后取出，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

5.4 Mg²⁺浓度优化

对Mg²⁺的浓度设置梯度为0.6>

5.5 Bst DNA聚合酶浓度优化

对Bst DNA聚合酶的浓度进行优化，其梯度设置为160 U/mL、320 U/mL、480 U/mL 、640U/mL、800 U/mL，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

5.6 Reverse Transcriptase优化

对AMV Reverse Transcriptase的浓度进行优化，其梯度设置为160 U/mL、320 U/mL、480 U/mL 、640 U/mL、800 U/mL，每个浓度梯度设置3个重复。待所有浓度梯度反应结束后，进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

6、Hobi-like瘟病毒RT-LAMP方法的优化结果

6.1 优化体系和条件

通过上述条件的优化，Hobi-like瘟病毒环介导等温扩检测试剂盒的最后优化的体系为：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

FIP/BIP1.2μM

F3/B30.3μM

MgSO₄0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶8U

Ribonuclease Ihibitor10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羟基萘酚蓝 3mM

样品模板RNA1μL

DEPC水 补足至25μL

反应条件为61℃作用1h。

6.2所述试剂盒包括如下组分：

10×Thermo Pol反应缓冲液2.5μL

FIP/BIP 1.2μM

F3/B3 0.3μM

MgSO_4>0.8mM

dNTP1.4nM

Bst DNA聚合酶 8U

Ribonuclease Ihibitor 10U

AMV ReverseTranscriptase10U

羟基萘酚蓝3mM

DEPC水补足至24μL。

7、RT-LAMP的特异性试验

以临床上常见的牛病毒性疾病：牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）、牛疱疹病毒1型（BHV-1）、牛轮状病毒（BRV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）的病毒基因组作为检测对象，提取病毒的基因组，并以此为模板进行LAMP扩增，来验证其反应的特异性，并设置阳性对照，结果参见图3。

阳性对照所述的反应体系包括如下组分：

10×Thermo Pol反应缓冲液 2.5μL

FIP/BIP1.2μM

F3/B30.3μM

MgSO₄0.8mM

dNTP 1.4nM

Bst DNA聚合酶8U

Ribonuclease Ihibitor10U

AMV ReverseTranscriptase 10U

羟基萘酚蓝 3mM

Hobi-like瘟病毒RNA模板 1μL

DEPC水 补足至25μL。

所述的Hobi-like瘟病毒RNA模板为使用病毒RNA提取试剂盒提取的细胞培养Hobi-like瘟病毒液基因组RNA。

扩增结果显示只有阳性对照出现弥散状条带，其他四种病毒均未出现，说明以其它病毒作为模板时没有阳性扩增，本发明LAMP方法特异性高。

8、RT-LAMP的敏感性试验

取已知TCID₅₀的Hobi-like瘟病毒毒液，然后用普通的DMEM培养液进行稀释，使其分别相当于含有1>50/mL、10>50/mL、100>50/mL、1000>50/mL、10000>50/mL、100000>50/mL，然后将病毒液提取RNA，并分成两部分，一部分用优化后的LAMP方法检测，加入羟基溴酚蓝后直接肉眼观察，测定该方法的敏感性；另一部分用常规RT-PCR方法检测，将两者检测结果进行比较，参见图1和图2，以验证其反应的敏感性。

结果表明：LAMP方法可检测到1>50/mL，而常规PCR扩增的方法只能检测到100TCID₅₀/mL。由此可见，本发明LAMP方法具有更高的敏感性。

9、RT-LAMP实际应用的符合性

临床采集57头患呼吸道病牛的鼻腔拭子，提取样品基因组，利用建立的的RT-LAMP检测方法和常规的RT-PCR以及荧光定量RT-PCR方法进行检测，通过对三种方法实际应用中检测结果比较，验证RT-LAMP的符合性。

结果表明：利用Hobi-like瘟病毒环介导等温扩检测试剂盒和常规RT-PCR以及荧光定量RT-PCR对获得的57份样品进行检测，发现RT-LAMP的检出率（18/57）显著高于传统的RT-PCR方法（10/57），与荧光定量RT-PCR方法出率较为相近（17/57），且传统的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检出的阳性样品都可以被RT-LAMP方法检出。

SEQUENCE LISTING

<110> 南阳师范学院

<120> 可视化检测Hobi-like瘟病毒的反转录环介导等温扩增引物、试剂盒和检测

方法

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<170> PatentIn version 3.5

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