快速检测鱼类淋巴囊肿病毒和海洋双RNA病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

摘要

淋巴囊肿病毒(Lympbocystis disease virus,LCDV)广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科共计140种以上鱼类,是对鱼类危害较为严重的病毒病之一,其感染率可高达80％,死亡率可达30％。本研究根据GenBank登录的淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因序列(AB212999),选择其高度保守区域,利用Primer Explorer V3软件进行引物设计,建立了用于检测淋巴囊肿病毒的环介导恒温扩增方法,对LCDV-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度并用建立的方法对109尾牙鲆进行了检测。特异性试验证实,该方法只能检测LCDV核酸,与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都无交叉反应,具有高度的特异性。将LAMP与常规PCR及实时定量PCR的检测限进行比较分析,结果表明LAMP与实时定量PCR的检测限一致约为15 fg,比常规PCR灵敏度高10倍。用建立的LCDV-LAMP与常规PCR检测109尾牙鲆样品,结果显示,两者对健康和发病严重的样品检测结果一致,但对无临床症状的样品存在8尾差异；经2次实时定量PCR复检差异样品,均与LAMP一致,表明LAMP较常规PCR的检测灵敏度更高,而且从样品的制备到获得结果仅需2 h,具有检测周期短的优势。以上结果表明,采用LAMP法检测淋巴囊肿病毒具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短等特点,比较适合养殖场、出入境口岸进行淋巴囊肿病毒的现场、即时检测。
　　 海洋双RNA病毒(Marine birnavirus,MABV)广泛分布于世界各地的海水中,可感染30科11种软体、4种甲壳动物和10多种鱼类,特别是对鰤幼鱼危害严重的病毒病之一,其感染率可高达85％,死亡率可达62％。本研究根据GenBank提供的海洋双RNA病毒聚合蛋白(polyprotein)的VP2基因序列(D61384),利用PrimerExplorer V3软件进行引物设计,建立了海洋双RNA病毒的反转录环介导恒温扩增方法。对MABV RT-LAMP反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性和灵敏度,并采用优化了的方法对养殖场送检的鲈鱼、真鲷、大菱鲆和牙鲆各30尾进行MABV的检测。结果显示,该方法对MABV核酸有高度的特异性,与染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春血症病毒、病毒性出血败血症病毒及病毒性神经坏死病毒都无交叉反应。灵敏性试验发现,该方法最低检测限为16.6 fg总RNA,与实时定量RT-PCR的检测限一致,但比常规PCR灵敏度高10倍。对养殖场送检的120份样品进行RT-LAMP和实时定量PCR海洋双RNA病毒检测,结果显示两种方法的检测结果完全一致,表明RT-LAMP具有更高的灵敏度。以上结果表明,本研究所建立的MABV RT-LAMP能对海洋双RNA病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、检测成本低廉等优点,可用于基层实验室和出入境检疫对海洋双RNA病毒属的疫情监测。