犬细小病毒分离鉴定及环介导等温扩增快速检测方法的建立

摘要

犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)，是引起犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的主要病原，具有高度的接触传染性，发病率和病死率分别为20％～100％和10％～50％，给全球的养犬业造成很大的经济损失。
　　 本研究主要由两方面的内容组成：
　　 1．探究犬细小病毒上海分离株的流行和变异情况通过对上海某宠物医院疑似犬细小病毒病例的犬粪样中进行病毒分离，经形态学、理化学和分子病毒学等鉴定：病毒能在CRFK细胞上生长，并产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变；病毒粒子在电镜下观察呈立体对称，直径为20～24nm，无囊膜；能凝集猪红细胞，不能凝集人、鸡的红细胞，并能被犬细小病毒阳性血清所抑制。动物实验表明，试验组犬均出现细小病毒感染症状。结果显示该分离株为犬细小病毒。
　　 参考GenBank上细小病毒3个基因型的全基因设计6对扩增引物进行PCR，分段扩增出目标片段，克隆于T载体上，测定序列并拼接，用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示，该分离株犬细小病毒全基因为4758bp，与GenBank中各种基因型犬细小病毒的VP2基因核苷酸序列同源性比较发现，CPV-SH克隆与2a亚型犬细小病毒核苷酸同源性最高为99.7％，与2型、2b亚型、2c亚型的同源性分别为98.8％、99.5％、99.5％。最终确认CPV-SH分离株属于犬细小病毒2a亚型，与国内北京分离株CPV/BJ082亲缘关系最近，同源性为99.9％。
　　 2．研究建立一种LAMP方法来检测犬细小病毒本研究建立一种的LAMP方法来检测犬细小病毒。根据已发表的GenBank上的犬细小病毒序列设计出1套LAMP引物，包括一对内引物、一对外引物和一对环引物。并对LAMP实验反应条件进行优化，包括镁离子浓度、温度和甜菜碱浓度等，实验结果表明，LAMP最佳反应温度是63℃，反应时间为1h，其最低检测限度为5.7个拷贝，是普通PCR的100倍，并与可能存在交叉反应的病毒进行特异性试验，结果显示无交叉反应存在，说明特异性较高。

目录

1 引言

2 试验研究

3 结论

致谢

参考文献

作者简介

论文说明:插图和附表清单及缩略语表

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