猪轮状病毒的分离鉴定及其环介导等温扩增检测方法的建立

摘要

轮状病毒（Rotavirus）作为一种重要的肠道微生物，能造成多种小动物和新生婴幼儿腹泻。PoRV与PEDV、TGEV并称为引起腹泻的三大病毒。目前，在世界上许多国家和地区均发现轮状病毒可引起相关腹泻疾病，对农业带来了巨大的经济损失。
　　本实验室自2013年到2014年，在全国不同省市和地区采集腹泻样品362份，进行流行病学调查，检测结果显示，362份样品中，PEDV的阳性样品数为223份，阳性率为61.6％，TGEV的阳性样品数为2份，阳性率为0.55％; PoRV的阳性样品数为8份，阳性率为2.2％;PKV的阳性样品数为66份，阳性率为18.23％。将来自江苏省某发病猪场的轮状病毒阳性样品处理并与20ug/mL胰酶等体积混合后接种至MA-104细胞上，盲传8代，细胞出现变圆、拉网、脱落等病变。PCR及测序结果显示为猪轮状病毒，命名为JS株。三次蚀斑克隆纯化后测定TCID50为10-6.875/mL，中和试验用病毒的最佳稀释倍数为150倍，并建立抗体检测方法。JS分离株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高，VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法，JS分离株属于P[7]G[9]型。
　　采用环介导等温扩增技术，建立了一种快速检测轮状病毒的实验方法。结果显示，当反应体系中甜菜碱浓度为0.8M，镁离子浓度为2mM，最佳反应温度为63℃时反应60min，扩增可达最佳效果。且该方法特异性良好，灵敏度为RT-PCR的100倍。可用于现场检测，具有良好的应用前景。

目录

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摘要

中英文缩略表

第一章 引言

1．1 病原学

1．2 流行病学

1．3 临床症状

1．4 病理变化

1．5 基因组学研究进展

1．6 轮状病毒检测方法的研究进展

1．6．1 免疫学方法

1．6．2 分子生物学技术

1．7 轮状病毒的疫苗研究进展

1．7．1 灭活苗

1．7．2 弱毒活疫苗

1．7．3 多价重配疫苗

1．7．4 基因工程疫苗

1．7．5 植物基因工程技术

第二章 猪腹泻病毒的流行病毒调查

2．1 实验材料

2．2 物品准备

2．3 实验仪器及试剂

2．4 实验方法

2．4．1 样品采集

2．4．2 无害化处理

2．4．3 样品保存

2．4．4 样品编号、采样单填写

2．4．5 样品处理

2．4．6 腹泻四联引物设计

2．4．7 RT-PCR检测

2．4．8 PCR的扩增

2．4．9 琼脂糖凝胶电泳

2．5 结果与讨论

2．5．1 PCR检测结果

2．5．2 讨论

第三章 猪轮状病毒的分离与鉴定

3．1 实验材料

3．2 实验仪器及试剂

3．3 病料的接种

3．4 引物设计

3．5 病毒RNA提取、反转录、PCR

3．6 感受态的制备

3．7 PMD-18T-vP4、PMD-18T-VP7阳性质粒的构建与鉴定

3．8 猪轮状病毒蚀斑克隆纯化

3．9 猪轮状病毒TCID50的测定

3．9．1 细胞制备

3．9．2 滴定

3．9．3 接种

3．9．4 计算感染量

3．10 猪轮状病毒抗体检测方法的建立

3．10．1 猪轮状病毒中和试验用病毒的制备

3．10．2 猪轮状病毒抗体检测(中和试验)

3．11 结果

3．11．1 猪轮状病毒分离与鉴定

3．11．2 PMD-18T-VP4、PMD-18T-VP7重组质粒的PCR鉴定结果

3．11．3 JS分离株VP4基因型别分析

3．11．4 JS分离株VP7基因型别分析

3．11．5 猪轮状病毒的蚀斑克隆纯化

3．11．6 TCID50测定

3．11．7 猪轮状病毒抗体检测方法的建立

3．12 讨论

第四章 猪轮状病毒LAMP检测方法的建立

4．1 材料

4．1．1 试验用毒株

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂

4．2 试验方法

4．2．1 猪轮状病毒JS分离株RNA的提取

4．2．2 病毒cDNA的制备

4．2．3 LAMP引物的设计

4．2．4 LAMP反应体系的建立

4．3 结果

4．3．1 最佳甜菜碱浓度的摸索

4．3．2 最佳Mg2+浓度的摸索

4．3．3 最佳反应温度的摸索

4．3．4 LAMP扩增产物的序列测定

4．3．5 LAMP引物特异性检测

4．3．6 LAMP引物灵敏性检测

4．3．7 临床样本检测

4．4 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介