人工表达HSP27蛋白在检测β2‑肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用

摘要

本发明属于药物残留检测领域，特别涉及人工表达HSP27蛋白在检测β2‑肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。本发明借助分子对接技术，利用表达纯化的HSP27进行ELISA筛选，最终得到的蛋白可特异结合β2‑肾上腺素受体激动剂类药物。结果证明，人工合成的HSP27蛋白可与β2‑肾上腺素受体激动剂类药物有很好的结合。由于β2‑肾上腺素受体激动剂类药物种类较多，且难以得到相对于这一类药物的抗体，本发明适配得到的HSP27蛋白能够很好地规避了这一难题，并且蛋白可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。本发明的人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好，与药物的特异性结合较高。

说明书

技术领域

本发明属于药物残留检测领域，特别涉及人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。

背景技术

β2-肾上腺素受体激动剂，又称为β2-兴奋剂，是一类苯乙胺类化学合成衍生物，通常以盐酸盐等形式保存，常见的包括盐酸克仑特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸马布特罗等。由于β2-肾上腺素受体激动剂能够促动物肌肉组织增长、减少脂肪沉积、改善肉质、提高饲料转化率等，因此上世纪80年代起，作为饲料添加剂广泛应用于畜禽生产中。其提高瘦肉产量的机理是通过肾上腺受体刺激腺苷酸环化酶的合成，从而升高环磷酸腺苷(c AMP)的浓度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它还可降低血液中Mg²⁺浓度，间接促进肌肉兴奋，抑制蛋白质分解和脂肪合成，进而增加肌肉蛋白合成。人食用含有瘦肉精的猪肉、内脏及其加工产品后会导致中毒，典型症状为：肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、战栗等，严重者可致人死亡。目前β2-肾上腺素受体激动剂的快速检测方法，无论是ELISA法还是金标记试纸条法都是建立在免疫学的基础上，通过抗原与抗体的特异作用而建立。β2-AR(肾上腺素受体)是G蛋白偶联受体(GPCR)超级家族中的一员，作为GPCR的典型已经深入研究其结构功能，调节机制及信号传导等生理作用。G蛋白偶联受体在大肠杆菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物等所有的表达系统中都能够表达蛋白，且具有一定的功能活性，但因受体的种类不同和宿主细胞特点的不同而有所差异。

分子对接(Molecular Docking)是研究药物小分子与蛋白质受体大分子之间相互作用的方法，其本质是配体(Ligand)与受体(Receptor)的相互识别，并涉及到分子的空间变化与能量改变，是药物分子设计中的重要方法之一。

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSP)，又称热应激蛋白(Heat Stress Proteins，HSP)或应激蛋白(Stress Proteins，SP)，是细胞或生物体在一些应激原，如高温、缺氧、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢等条件诱导下，高效表达的一组高度保守的蛋白质，广泛分布于各种生物体内。HSP27是分子量在15～30ku之间s HSP亚家族(低分子量热休克蛋白)中的重要一员，主要参与微丝的稳定和细胞因子信号转导，保护细胞免受各种应激因素的损伤等。目前，还没有HSP27能够检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物的相关报道。

发明内容

本发明借助分子对接技术，利用人工表达的HSP27蛋白与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合，最终得到一种新的β2-肾上腺素受体激动剂类药物检测方法。人工合成HSP27蛋白，纯化后进行ELISA结合实验，结果证明，人工合成的蛋白与β2-肾上腺素受体激动剂类药物有良好的结合能力，进一步验证了分子对接技术的可行性。借助本发明的蛋白，可应用于对β2-肾上腺素受体激动剂类药物定性和定量的检测。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

人工表达HSP27蛋白在检测β2-肾上腺素受体激动剂类药物残留方面的应用。

所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合。

所述的人工表达HSP27蛋白，包括以所述的人工表达HSP27蛋白为核心，任何对该蛋白的人工表达方式，包括但不局限于原核表达系统、真核表达系统、酵母表达系统对蛋白的表达。

将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测，其中包括但不局限于酶联免疫检测方法。

将所述人工表达HSP27蛋白用于β2-肾上腺素受体激动剂类药物的定量和定性检测中。

利用所述的人工表达HSP27蛋白可以与β2-肾上腺素受体激动剂类药物特异性结合，制备β2-肾上腺素受体激动剂类药物的检测试剂盒、试纸条或试纸卡。

本发明的有益效果：

(1)本发明借助分子对接技术，利用表达纯化的HSP27进行ELISA筛选，最终得到的蛋白可特异结合β2-肾上腺素受体激动剂类药物。结果证明，人工合成的HSP27蛋白可与β2-肾上腺素受体激动剂类药物有很好的结合。

(2)由于β2-肾上腺素受体激动剂类药物种类较多，且难以得到相对于这一类药物的抗体，本发明适配得到的HSP27蛋白能够很好地规避了这一难题，并且蛋白可进行人工合成方法快速取得，检测成本也非常低廉。

(3)本发明的人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好，与药物的特异性结合较高。

(4)本发明适配得到的HSP27蛋白，表达过程简便，更易操作；通过对药物进行标记，可快速地对药物残留进行定性和定量检测。

附图说明

图1为HSP27蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定结果。图中，M为广谱180KD的蛋白Marker，1为纯化后的HSP27蛋白。

图2为HSP27蛋白纯化后与小分子ELISA反应结果。图中横坐标为HSP蛋白不同包被浓度，纵坐标为OD值；每个HSP蛋白包被浓度对应的柱状从左到右依次为CL-BIO、RAC-BIO、FH-BIO(BIO代表生物素)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1 小分子对接技术

1、对接准备

对接所需的小分子β2-肾上腺素能受体激动剂分子结构均从ZINC上下载，并对其结构进行优化，以获得其能量最小化状态，以备后续对接。

蛋白为β2肾上腺素能受体蛋白2RH1和热休克蛋白27(HSP27)3ROR，均从PDB数据库中下载，去除相应的配体和非必要部分，加氢及能量最小化。

依据文献报道，2RH1对接口袋设定为包含Asp113、Asn312、Ser203、Phe193、Phe289、Phe290、Val114、Val117、Trp109、Tyr308、Tyr316、Tyr199、Trp286和Thr118残基的区域，Threshold定义为0.50，Bloat定义为10A。

依据3ROR的具体情况，对接口袋设定为包含Glu99、Asp65、Arg209、Phe100、Tyr50、Cys103、Asp203、Tyr202、Ser200、Asn199、Glu198、Trp62、Met66、Met67、Val98和Ser45等残基所在区域，Threshold定义为0.50，Bloat定义为10A。

2、分子对接

以上述蛋白对接区域作为受体，以小分子做为配体，采用FlexX方法进行对接工作，对接条件设置以SYBYL中的默认条件为准。以对接结果的Total_Score值为最终判断依据。相同小分子对两种蛋白的对接结果见表1。

表1 β2-肾上腺素受体激动剂类药物与蛋白对接结果

3、对接结果分析

对接结果分析表明，β2-肾上腺素受体激动剂类药物与HSP27的对接结果大多数高于与β2-肾上腺素受体的对接结果，可以说明β2-肾上腺素受体激动剂类药物与HSP27的结合能力要更好。

实施例2 HSP27蛋白表达实验

根据GenBank中公布的HSP27基因序列设计相应引物扩增其CDS区序列，序列酶切后连接至pLSLa载体，经PCR鉴定、测序后，转化至BL21(DE3)宿主菌加IPTG进行诱导表达，利用琼脂糖树脂柱进行目的蛋白纯化，利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白的特性(结果见图1)。图1结果表明，本发明人工合成蛋白产量高，且纯化效果良好。

实施例3 HSP27蛋白鉴定

选择人工表达HSP27蛋白最适浓度作为包被抗原，50μL/孔包被在酶标板上，将板放置于37℃的恒温培养箱中反应2h，PBST洗涤4遍，室温晾干。加入质量分数1％BSA作为封闭液，200μL/孔，37℃恒温反应1h，PBST洗涤4遍，室温晾干。然后加入梯度浓度的HSP27多抗血清，50μL/孔，设置阴性对照(NC)，37℃恒温30min，洗板4遍。再每孔加入50μL羊抗鼠二抗(1:1000)，37℃恒温30min，洗板4遍。用TMB显色液100μL/孔进行显色反应，10min后用50μL 2mol/L H₂SO₄终止反应。用酶标仪在OD450nm处对每孔进行读数。

表2人工表达HSP27蛋白ELISA鉴定结果

实施例4 HSP27蛋白与小分子结合实验

1、将人工表达的HSP27的BL21(DE3)宿主菌菌液(实施例2)进行超声破碎，然后以100μg/mL(蛋白量计)进行梯度ELISA板包被，50μL/孔；

2、将100ng/mL的小分子偶联生物素，以50μL/孔的量加入到上述ELISA板中，震荡器上混匀，37℃条件下避光孵育30min；用酶标板洗板机洗4次，或手工甩掉酶标板孔中的液体，用稀释后的缓冲液加满各孔，再甩干，如此重复洗涤4次；

3、在酶标板中加入HRP-标记链霉亲和素偶联物，37℃条件下进行反应30min；同上步骤洗涤4次。

4、根据所需用量将TMB液加入到相应的微孔中，每孔加100μl，在酶标板震荡器上震荡30s，室温显色10min；

5、每孔加入50μl 2mol/L的硫酸终止反应，在酶标板震荡器上震荡30s，然后用酶标仪读取各孔在450nm处的吸光值，判定结果(结果见图2)。

图2结果表明，小分子FH(非诺特罗)、CL(克伦特罗)和RAC(莱克多巴胺)等肾上腺素受体激动剂可与HSP27相结合；HSP27可起到体外与肾上腺素受体激动剂相结合的作用，这为借助HSP检测肾上腺素受体激动剂奠定了基础。