一种预测个体动脉瘤发生的血液中外泌体miRNA谱及检测试剂盒

摘要

本发明属于分子生物学和医学领域。本发明提供了一种预测动脉瘤发生的血液中外泌体miRNA谱及检测试剂盒，该miRNA谱包括miR‑214、miR‑126和miR‑15a，采用荧光定量PCR方法对个体血液外泌体中上述三种miRNA表达水平进行检测，已检测的miRNA表达水平进行标准化；每一种miRNA标准化后的表达量分别进行累加，形成了由上述3种miRNA表达水平组合而成的一个表达模式，根据诊断规则和其阈值，预测动脉瘤发生风险。本发明是基于血液外泌体的分子标记物，属微创，成本相对较低，可重复性高。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及预测个体动脉瘤发生的血液中外泌体miRNA谱，本发明还涉及预测个体动脉瘤发生的检测试剂盒或芯片。

背景技术

动脉瘤是由于动脉壁的病变或损伤，形成动脉壁局限性或弥漫性扩张或膨出的表现，以膨胀性、搏动性肿块为主要表现，可以发生在动脉系统的任何部位，而以肢体主干动脉、主动脉和胸动脉较为常见。其主要症状体征因动脉瘤发生位置不同而不同，胸主动脉瘤主要体现在食管和气管压迫症状，如吞咽困难、呼吸困难及扩张性搏动、震颤及杂音。下肢主干动脉瘤主要体现在肌肉萎缩、水肿、溃疡或坏死。

当前，随着环境的恶化，动脉瘤发病率出现了逐年增加的趋势，其中发达国家腹主动脉瘤的发病率甚至达到了5％以上。男性发病率明显高于女性，随着年龄的增加，其发病率也增加，60岁男性发病率达到8％，而年轻男性发病率仅为1.5％，60岁以上女性发病率为4％，年轻女性发病率为0.5％。其发病率不仅较高，而且危害严重，若没有及时接受治疗或者手术，其死亡率达到90％以上，但若及时发现并接受手术，其死亡率可以降为0。在临床上有70％的动脉瘤患者具有典型动脉瘤的临床表征，血管超声可以检测到血管管腔的异常，从而判断动脉瘤的发生，进而采取手术进行干预和治疗。当前血管超声检测是最为有效可行的检测手段，其界定标准是血管管腔内径增加50％或者内径达到1.2cm，则为典型血管瘤患者。但是仍有30％的动脉瘤患者的血管正常，常规血管超声检测无法显示其异常，因此这类患者随时具有血管破裂的风险，有较高的猝死概率。正是因为动脉瘤具有很高的治愈率，因此及时进行手术治疗就显得尤为重要。因此早期筛查和诊断显得尤为重要，尤其是60岁以上的男性。

目前临床检测中，对于动脉瘤的早期检测和诊断，仅以血管超声和核磁共振检测为主要手段，通过这些影像学检测可以诊断出70％的动脉瘤患者，但是仍有大量的非典型动脉瘤患者不能通过这些常规检测手段被发现，目前还没有一种行之有效的非影像学手段，针对动脉瘤预警及早期检测。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA),是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。

miRNA主要通过与靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，在基因转录后的表达调控中起着超乎想象的重要作用，因此它与疾病存在以下的关联性：首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因子以及促进因子都可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次，微小核糖核酸的变化也可能是疾病的结果，这是因为当疾病发生时，会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生及其显著的变化。

因此，理论上微小核糖核酸分子完全可以作为一类新的疾病标记物，它的特异性变化必然与疾病产生发展相关联。

发明内容

本发明要解决的技术问题是确定一种能在血液中检测的，高准确度的早期预测动脉瘤发生的分子标记。

近年来研究发现外泌体包含有miRNA,由于外泌体所提供的良好保护性，使得外泌体miRNA在人体液中有很好的稳定性。本发明经过大量研究，确定了一种预测动脉瘤发生的血液中外泌体miRNA谱，该miRNA谱包括miR-214、miR-126和miR-15a；采用荧光定量PCR方法对个体外泌体中上述三种miRNA表达水平进行检测，获得的miRNA表达水平相对于(a)非编码核糖核酸(ncRNAs)U6的表达水平，或(b)外泌体数量N进行标准化；每一种miRNA标准化后的表达量分别进行累加，形成了由上述3种miRNA表达水平组合而成的累加分数，其中按照(a)标准化方式累加分数在22以上为动脉瘤患者，低于22分为正常；按照(b)标准化方式累加分数在6875以上为动脉瘤患者，低于6875分为正常。

在本发明中用作标记物的微小核糖核酸包括所述前体miRNA及成熟miRNA产物。

在确定miRNA表达水平时，起始材料量、样本收集、RNA制备及品质及反转录(RT-PCR)效率的差异会导致定量误差。内因性控制基因的标准化可用于矫正潜在的RNA输入或者RT-PCR效率的偏差。因此miRNA的表达水平可相对于未编码RNA(ncRNA)、某些miRNA或者核糖RNA(rRNA)的表达水平而标准化。可用于标准化的未编码RNA包括RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、RNU49、RNU48、RNU43、RNU58B、RNU68、RNU44、RNU6B、Z30、U18、RPL21、U54、HY3、U75及U47。可用于标准化目的的miRNA包括has-miR-26b、has-miR-92、has-miR-92N、has-miR-423、has-miR-374及has-miR-16。或者本发明另一方面也可使用18S rRNA进行标准化。

本发明还可使用总输入RNA对miRNA表达水平进行标准化。或者可基于所有已分析基因或其中大的次群(全球标准化方法)的平均值或者中间数信号(Ct)进行标准化。

本发明的实施例中，对感兴趣的miRNA已测量的表达水平以相对于一个ncRNA U6的表达水平或外泌体数量N而标准化。

所述(a)中，以U6的表达水平使每一个miRNA的Ct值标准化，标准化的miRNA表达水平以ΔCt表示，即各个生物标记物的PCR相对量使用2^-ΔCt公式计算，其中ΔCt＝Ct_{生物标记物}-Ct_U6，miR-214的表达水平为2^{-(CtmiR-214-CtU6)}，miR-126的表达水平为2^{-(CtmiR-126-CtU6)}，miR-15a的表达水平为2^{-(CtmiR-15a-CtU6)}。

所述(b)中，与外泌体数量N比较使每一个miRNA的Ct值标准化，标准化后的miR-214的表达水平为2^-CtmiR-214/N，miR-126的表达水平为2^-CtmiR-126/N，miR-15a的表达水平为2^-CtmiR-15a/N。

已知的检测miRNA表达水平的方法，例如小分子RNA列阵系统(Illumia,San Diego,CA,ISA)及/或miRNA分析(Applied Biosystems,Life TechologiesCorp.,Carlsbad,CA,USA)可用于本发明。miRNA分析是使用Applied Biosystems实时PCR仪，此分析方法可检测及定量具有超过6个log对数的动态范围的1至10ng总RNA的小分子RNA。在用于miRNA的分析时，该分析法可区别成熟miRNA序列与其前提miRNA。

可以使用市售仪器进行RT-PCR，例如ABI PRISM7500TM序列检测系统TM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)或者Lightcycler(RocheMolecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。

可利用qRT-PCR的系统有热循环器、激光器、电偶合装置(CCD)、摄影机及计算机组成。此系统可在热循环机内以96位和/或384位格式扩增样本。扩增期间，多所有的96位和/或384位经光纤缆线实时收集激光诱导的荧光讯号，在CCD上检测。该系统包括相应的操作软件及数据分析软件。

本发明的技术方案是这样获得的：

(1)对进行手术或其他治疗之前的血液进行外泌体提取及定量；(2)外泌体RNA提取；(3)外泌体miRNA、ncRNA定量检测，获得标准化的miRNA表达水平；(4)将训练集的结果进行统计分析，获得用于早期预测动脉瘤的诊断规则。

所述的统计方法包括：

将惩罚逻辑回归(Penalized Logistic Regression，PLR)用作标记物组合的数学模型，如“惩罚的”R工具箱中应用的(http://cran.r-project.org/)。将武汉样本定义为训练集，同时将济宁样本定义为试验集。通过在训练集内在蒙特卡罗交叉效度分析(MonteCarlo)设计中进行100次操作来进行算法优化(及惩罚类型和其惩罚参数的选择)。

在各蒙特卡罗交叉效度分析操作时，将训练组的正常对照和动脉瘤患者的三分之二随机选择为亚训练组。将PLR用于亚训练组以产生诊断规则。对亚训练组的对照确定关于估计的后验病例概率(posterior case-probability)的阈值以获得95％或98％的多变量诊断规则的表观特异性。然后将规则用于剩下的三分之一的数据(另一个亚试验集)以估计在给定的阈值下的灵敏度和特异性。将该方法重复100次。

来自交叉效度分析的单个操作的仔细分析显示在100次统计操作中，miR-214、miR-126和miR-15a分别被选择94次、91次和78次。

因此根据交叉效度分析，训练集中动脉瘤和对照组集合的所有多变量结果报道为中等灵敏度。然后使用所有训练数据用最佳算法研究最终诊断规则和其阈值，并且将其应用于试验集，所述试验集用于验证产生的诊断规则。

利用本发明的miRNA表达谱分析了济宁人群中随机呈现的40个正常人和40名患者的miRNA的表达情况，其结果所示灵敏度达到91.77％，假阳性率仅为7.03％，假阴性率为15.39％。

本发明的另一个目的在于提供一种预测动脉瘤发生的试剂盒，该试剂盒含有针对检测miR-214、miR-126和miR-15a表达水平的特异性探针和/或核苷酸引物。

本发明的另一个目的在于提供一种早期预测动脉瘤发生的芯片，该芯片含有针对miR-214、miR-126和miR-15a表达水平检测的特异性探针核苷酸。

本文中使用的术语“样品”是指获得用于体外评估目的的生物样品。在本发明的方法中，样品或者患者样品优选包括任何体液。体液样品是全血、血清、血浆，血清和血浆是最优选的。

本发明提供了一种miRNA表达谱，能够比较高准确度的早期预测动脉瘤发生；与其他已知的预测动脉瘤发生相关因素相比，此表达谱是一个独立的预测因素。由于是基于外周血外泌体的分子标记物，属微创，成本相对较低，可重复性高。

附图说明

图1为不同生物标记物在武汉正常人群和动脉瘤患者的ROC情况

图2为在武汉人群中生物标记物的不同组合形成不同的ROC情况

图3为不同生物标记物在济宁正常人群和动脉瘤患者的ROC情况

图4为在济宁人群中生物标记物的不同组合形成不同的ROC情况

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】临床样本

按照预期在中国两个多中心研究中收集血液样品，临床信息见表1。在参与中心对每一个患者进行血管超声检测或者血管造影检测。在入院进行第一次血液检测时(在进行手术或其他治疗治疗之前)收集血液样品。血管外科医生或超声科医生等专业医生对患者的血管造影或者血管超声结果进行判断，排除血管异常的患者，血管无异常表型，且在后续1年中未发生血管瘤的患者归为正常对照组。通过血管造影或者血管超声检测，发现血管管腔或者血管内径增加50％的患者，或者接受血管瘤手术治疗患者，归为动脉瘤患者(腹主动脉瘤或胸主动脉瘤)。在该研究中，在手术之前或者血管造影检测之前收集血液样品。由2位不同的血管外科医生或者超声科医生对正常对照和血管瘤患者进行鉴定。本研究通过了伦理委员会评审和批准，所有参与者都签署了知情同意书。

表1临床资料汇整

【实施例2】

血液/血清收集

将血液样品一部分抽入血清管中并且让其在室温凝固至少1小时。在离心侯，将上清液(血清)以1ml等分于-20度冷冻，第二日转移至-80度冰箱。在测量前，将血清样品解冻，进行检测。

将另外一部分血液样品直接收集到管中，然后按照相应的外泌体试剂盒的使用说明进行操作分离纯化血液中外泌体。

外泌体提取

使用市售外泌体分离试剂盒对血液中的外泌体进行分离。或者采用梯度离心的方法分离外泌体。

可采用Total Exosome Isolation(from plasma)(Life TechnologiesCorporation,USA)分离血液中外泌体。按照公司提供的试剂盒使用说明书进行操作，分离得到血液中外泌体。

或者可采用ExoQuick-TCTM Exosome Precipitation Solution(SystemBiosciences,CA,USA)分离外泌体。同样按照试剂盒生产商提供的标准流程进行操作，分离血液中外泌体。

外泌体定量

分离得到血液外泌体后，采用EXOCET Exosome Quantitation Assay Kit试剂盒(System Biosciences,CA,USA)或Exosome Quantification Kit试剂盒(BioVision)对分离得到的外泌体数量进行定量分析。或采用BCA发对外泌体的总蛋白进行定量。

随后对分离得到外泌体立即分为2份放入到-80度冰箱，一份用于外泌体内蛋白检测，一份用于外泌体中miRNA表达水平检测。

外泌体miRNA提取

使用TRIzol为主的方法从上述提到的分离出的血液外泌体中抽取总RNA。或者使用miRNA Isolation Kit(Thermo Fisher,USA)、mirVana^TM>

【实施例3】外泌体miRNA检测

采用荧光定量PCR方法对外泌体中miRNA表达水平进行检测。采用NCode VILOmiRNA cDNA Synthesis Kit and EXPRESS SYBR GreenER miRNA qRT-PCR Kits试剂盒(Invitrogen，USA)对各种miRNA或者样本内对照RNA的表达水平进行检测。(各个检测miRNA的相关信息见表2，各个检测miRNA的荧光定量PCR的引物信息见表3)。

分别对miR-214、miR-126和miR-15a每个miRNA的表达水平都以阈值循环(Ct)值表示。之后以U6的表达水平使每一个miRNA的Ct值标准化，此方法常用于miRNA定量分析的内在控制。最后，标准化的miRNA表达水平以ΔCt表示。即各个生物标记物的PCR相对量使用2^-ΔCt公式计算，其中ΔCt＝Ct_{生物标记物}-Ct_U6。miR-214的表达水平为2^{-(CtmiR-214-CtU6)}，miR-126的表达水平为2-^{(CtmiR-126-CtU6)}，miR-15a的表达水平为2^{-(CtmiR-15a-CtU6)}。

表2动脉瘤生物标记的序列

表3动脉瘤生物标记的荧光定量PCR引物

【实施例4】外泌体miRNA检测

使用TaqMAN RT-PCR对从外泌体中分离纯化的miRNA表达水平进行检测。(各个检测miRNA的定量PCR探针信息见表4)。分别对miR-214、miR-126和miR-15a每个miRNA的表达水平都以阈值循环(Ct)值表示。之后以U6的表达水平使每一个miRNA的Ct值标准化，此方法常用于miRNA定量分析的内在控制。最后，标准化的miRNA表达水平以ΔCt表示。即各个生物标记物的PCR相对量使用2^-ΔCt公式计算，其中ΔCt＝Ct_{生物标记物}-Ct_U6。miR-214的表达水平为2^{-(CtmiR-214-CtU6)}，miR-126的表达水平为2-^{(CtmiR-126-CtU6)}，miR-15a的表达水平为2^{-(CtmiR-15a-CtU6)}。

表4动脉瘤生物标记的定量PCR探针

IDThermoFisherCat.NO.hsa-miR-214478768_mirhsa-miR-126477888_mirhsa-miR-15a477928_mirU6001973

【实施例5】外泌体miRNA检测

分别对miR-214、miR-126和miR-15a每个miRNA的表达水平都以阈值循环(Ct)值表示。之后以其值与外泌体数量N比较使每一个miRNA的Ct值标准化，进而可对miRNA表达进行分析。miR-214的表达水平为2^-CtmiR-214/N，miR-126的表达水平为2^-CtmiR-126/N，miR-15a的表达水平为2^-CtmiR-15a/N。

【实施例6】标记物组合/统计分析和结果

将惩罚逻辑回归(Penalized Logistic Regression，PLR)用作标记物组合的数学模型，如“惩罚的”R工具箱中应用的(http://cran.r-project.org/)。将武汉样本定义为训练集，同时将济宁样本定义为试验集。通过在训练集内在蒙特卡罗交叉效度分析(MonteCarlo)设计中进行100次操作来进行算法优化(及惩罚类型和其惩罚参数的选择)。

在各蒙特卡罗交叉效度分析操作时，将训练组的正常对照和动脉瘤患者的三分之二随机选择为亚训练组。将PLR用于亚训练组以产生诊断规则。对亚训练组的对照确定关于估计的后验病例概率(posterior case-probability)的阈值以获得95％或98％的多变量诊断规则的表观特异性。然后将规则用于剩下的三分之一的数据(另一个亚试验集)以估计在给定的阈值下的灵敏度和特异性。将该方法重复100次。

来自交叉效度分析的单个操作的仔细分析显示在100次统计操作中，miR-214、miR-126和miR-15a分别被选择94次、91次和78次。

因此根据交叉效度分析，训练集中动脉瘤和对照组集合的所有多变量结果报道为中等灵敏度。然后使用所有训练数据用最佳算法研究最终诊断规则和其阈值，并且将其应用于试验集，所述试验集用于验证产生的诊断规则。

规则1：按照实施例3的方法计算，将miR-214、miR-126和miR-15a的表达量进行累加，累加分数在22以上为动脉瘤患者，低于22分为正常。

规则2：按照实施例5的方法计算，将miR-214、miR-126和miR-15a的表达量进行累加，累加分数在6875以上为动脉瘤患者，低于6875分为正常。

由3个生物标记物构成的组合获得的诊断规则使得动脉瘤检测的准确度达到79.5％，特异性达到81.4％。

附图1，武汉人群中miR-214、miR-126和miR-15a的ROC值分别是0.57，0.54，0.63。

附图2中，武汉人群中当miR-214、miR-126和miR-15a两两分别组合，其ROC值为0.60，0.65，0.69。当miR-214、miR-126和miR-15a三个组合，其ROC值达到了0.73。

【实施例7】验证人群的分析及预测

将济宁样本作为试验集，验证根据武汉样本作为训练集得到的数学模型，其结果如表5所示，灵敏度达到91.77％，假阳性率仅为7.03％，假阴性率为15.39％。

表5生物标记物检测结果

正常动脉瘤正常6712动脉瘤患者27357

附图3，济宁人群中miR-214、miR-126和miR-15a的ROC值分别是0.54，0.56，0.58。

附图4中，济宁人群中当miR-214、miR-126和miR-15a两两分别组合，其ROC值为0.58，0.61，0.62。当miR-214、miR-126和miR-15a三个组合，其ROC值达到了0.75。

在济宁样本中随机抽取40个正常人和40名患者的miR的表达情况，按照实施例4，进行计算统计，并按照规则1进行判断获得疾病诊断评分，结果见表6；按照实施例5，进行计算统计，并按照规则2进行判断获得疾病诊断评分，结果见表7。

表6按照规则1对济宁样本进行分析获得的疾病诊断评分

表7按照规则2对济宁样本进行分析获得的疾病诊断评分

SEQUENCE LISTING

<110>吕丘仑

<120>一种预测个体动脉瘤发生的血液中外泌体miRNA谱及检测试剂盒

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>110

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-214

<400>1

ggccuggcug gacagaguug ucaugugucu gccugucuac acuugcugug cagaacaucc 60

gcucaccugu acagcaggca cagacaggca gucacaugac aacccagccu 110

<210>2

<211>85

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-126

<400>2

cgcuggcgac gggacauuau uacuuuuggu acgcgcugug acacuucaaa cucguaccgu 60

gaguaauaau gcgccgucca cggca 85

<210>3

<211>83

<212>RNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-15a

<400>3

ccuuggagua aaguagcagc acauaauggu uuguggauuu ugaaaaggug caggccauau 60

ugugcugccu caaaaauaca agg 83

<210>4

<211>107

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>U6

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gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60

ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt107

<210>5

<211>55

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-214 RT引物

<400>5

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac tgcct55

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-214正向

<400>6

aggacagcag gcacagac 18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-214 反向

<400>7

cagtgcgtgt cgtggagt 18

<210>8

<211>55

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-126 RT

<400>8

gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggaggctcg acctcggaaa ctatggcatt attac55

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-126 正向

<400>9

agcatgaatc gtaccgtgag t 21

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-126 反向

<400>10

ctgctcgacc tcggaaacta tg22

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<211>43

<212>DNA

<213>hsa-miR-15a RT

<400>11

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcaca aac 43

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-15a 正向

<400>12

acactccagc tgggtagcag cacataatgg tttgt35

<210>13

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>hsa-miR-15a 反向

<400>13

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>U6 正向

<400>14

gcttcggcag cacatatact aaaat 25

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>U6反向

<400>15

cgcttcacga atttgcgtgt cat 23