基于UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法

摘要

本发明提供了基于UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，通过超声处理，并用纯甲醇溶液进行提取，针对生物碱成分的化学性质，采用酸水溶解甲醇提取物，并进一步碱化，使生物碱盐转变为游离的生物碱，利用二氯甲烷溶液进行萃取，用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测；采用OSI/SMMS软件完成未知代谢物定性。本发明首次采用UPLC/LTQ‑Orbitrap Velos MS技术对石斛中生物碱成分进行定性检测，共鉴定出22种生物碱成分，且均首次在石斛中被分离检测出，明确了石斛生物碱成分的类型，为研究其药理作用奠定了理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS技术对石斛中生物碱成分的检测方法。

背景技术

石斛为常用名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效。生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，在抗肿瘤、治疗心血管及胃肠道疾病等方面具有明显的疗效。为明确药效成分，对石斛中生物碱进行深入的化学成分分析具有重要意义。

目前，石斛中研究较多的是总生物碱含量，例如徐宁等人报道了采用分光光度法对石斛中总生物碱含量进行了测定，但是该方法主要是对石斛中生物碱进行定量检测，并且是对总生物碱的量进行的检测，无法区分不同生物碱的种类。

UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术是一种较为有效地、可靠地分析化合物成分的技术，例如，谢彤等人报道了基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS的黄芩中黄酮碳苷的结构表征及黄酮碳苷类成分的同分异构体的区分，为其他中药的成分分析提供参考。另外，牛增元等人报道了采用UPLC-LTQ/Orbitrap MS技术测定化妆品中抗生素、激素、邻苯二甲酸酯、农药以及孔雀石绿和结晶紫等5大类共89种化合物，说明该方法简便、快速、可靠性高。但是该技术依托于待检测样品需经过精细的预处理过程，去除待测物中杂质的干扰才能得到目标物的分析结果。由于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术非常灵敏，前期预处理过程中如果没有完全去除非目标物，则容易造成分析产生误差或错误的结论，因此，样品的前期预处理是十分重要。

现有技术中，虽然有学者报道对丹参、黄芩等样品进行预处理后采用U PLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对目标物进行检测，但是，从丹参中提取鉴定丹参酮ⅡA及丹酚酸B，前期过程需要克服糖类脂类的物质的干扰；从黄芩中分离检测黄酮碳苷，提取的目的物为糖类，干扰物为蛋白脂类等物质，可见目的物的提取方法不能通用。现有技术中，还没有针对UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对石斛中生物碱的种类进行预处理方法的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS技术对石斛中生物碱成分的检测方法，使所述方法具有快速、准确、批量检测的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：

1)将石斛待测样品杀青后烘烤；

2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；

3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；

4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；

5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；

6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；

7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；

8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；

9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；

10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。

优选的，所述步骤1)中杀青的温度为100～110℃；杀青的时间为15～25min。

优选的，所述步骤1)中烘烤的温度为50～65℃；所述烘烤至恒重。

优选的，所述步骤2)中石斛的质量与有机溶剂的体积比为(50～80)mg：(1～2)mL。

优选的，所述步骤3)中超声的温度为25～30℃；超声的时间20～40min；所述超声的功率为100～150W。

优选的，所述步骤3)和步骤8)中所述固液分离采用离心的方法；

所述离心的转速为8000～12000rpm；

所述离心的时间为10～15min。

优选的，所述步骤4)和步骤7)中浓缩独立为氮气吹干浓缩；

所述浓缩的时间为40～100min。

优选的，所述步骤5)中提取物干粉的质量与硫酸溶液的体积比为(7～11)mg：(1～2)mL；

所述硫酸溶液的体积浓度为8％～12％。

优选的，所述步骤5)中静置的时间为30～50min。

优选的，所述步骤6)中碱性混合液与二氯甲烷的体积比为2～3：1～2；

所述步骤6)中所述离心的转速为3500～5000rpm；

所述步骤6)中所述离心时间为15～20min。

优选的，所述步骤9)中色谱分离条件包括如下参数：

色谱柱为Hypersil GOLD液相色谱柱；所述Hypersil GOLD液相色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.9μm；

柱温为40℃；

洗脱系统流动相A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1％甲酸乙腈溶液；

洗脱的流速为0.35mL/min；

进样体积为5μL；

流动相梯度洗脱程序：

(0,1min)，流动相A与流动相B的体积比19：1的混合液；

[1min,24min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[24min,28min)，流动相A与流动相B的体积比为1：19；

[28min,28.1min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[28.1,30min]，流动相A与流动相B的体积比为19：1。

优选的，所述步骤9)中质谱检测条件包括以下参数：

离子源为电喷雾离子源，正离子模式检测；

鞘气，30自由单位；辅助气，6自由单位；

喷雾电压，3.8kV；

离子传输毛细管温度为350℃，源加热温度为350℃；

母离子扫描范围：50-1000m/z，数据依赖的扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描；

碎裂方式：碰撞诱导解离，正态化能量30％，q值0.25，活化时间为30ms，动态排除时间为5s；

一级质谱在m/z400时分辨率为30000，二级质谱在m/z400时分辨率为30000。

本发明提供了基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，通过超声提取，同时，根据多糖易溶于水而不溶于甲醇、乙醚、丙酮等有机溶剂的特点，用上述有机溶剂进行提取，避免了石斛中糖类物质的浸出，更有利于痕量物质生物碱成分的提取。本发明针对生物碱成分的化学性质，采用酸水溶解甲醇提取物，并进一步碱化，使生物碱盐转变为游离的生物碱，利用二氯甲烷溶液进行萃取，去除其他水溶性杂质淀粉、蛋白质、粘液质、鞣质、色素、无机盐等，更有利于生物碱成分的分离和检测。本发明采用具有大规模代谢组快速、准确、批量定性分析的OSI/SMMS软件，完成未知代谢物定性。本发明首次采用UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS技术对石斛中生物碱成分进行检测并定性，共鉴定出22种生物碱成分，且均首次在石斛中被分离检测出，进一步明确了石斛生物碱成分的类型，为研究其药理作用奠定了理论基础。

附图说明

图1为实施例1中铁皮石斛类原球茎的提取物正离子模式下总离子流图；

图2为实施例2中m/z 225.19556提取离子流色谱图；

图3为实施例2中m/z 225.19556一级质谱图；

图4为实施例2中m/z 225.19556二级质谱图。

具体实施方式

本发明提供了基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法，包括以下步骤：

1)将石斛待测样品杀青后烘烤；

2)将所述步骤1)烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮；

3)将所述步骤2)得到的石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液；

4)将所述步骤3)得到的上清液进行浓缩，得到提取物干粉；

5)将所述步骤4)得到的提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置；

6)将所述步骤5)静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相；

7)将所述步骤6)得到的二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉；

8)将所述生物碱干粉用甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品；

9)用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰；

10)用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。

本发明将石斛待测样品杀青后烘烤。

本发明中，所述石斛的品种优选为铁皮石斛，霍山米斛或铜皮石斛。所述石斛优选食用石斛原球茎。

本发明中，所述杀青的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的杀青方法即可。所述杀青的温度优选为100～110℃，更优选为105℃；所述杀青的时间优选为15～25min，更优选为20min。所述杀青的目的是破坏鲜石斛材料中的酶活，从而保留功效物质。

本发明中，所述烘烤的温度优选为50～65℃，更优选为60℃；所述烘烤的时间没有特殊限制，烘烤的程度优选烘烤至恒重。

得到烘烤后的石斛后，本发明将所述烘烤后的石斛与有机溶剂混合后磨碎，得到石斛浆液；所述的有机溶剂包括甲醇、乙醚或丙酮。

本发明中，所述石斛的质量与有机溶剂的体积比优选为(50～80)mg：(1～2)mL，更优选为(50～65)mg：(1～1.5)mL。所述甲醇、乙醚或丙酮的质量浓度优选为100％。

本发明中，所述磨碎的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磨碎方法即可。所述磨碎的程度优选磨碎至100～300目。本发明实施例中，磨碎采用球磨仪磨碎。所述球磨仪的频率为60～70HZ，所述球磨仪的磨碎时间为3～5min，更优选为4min。

得到石斛浆液后，本发明将所述石斛浆液进行超声破碎，固液分离后，得到上清液。

本发明中，所述超声的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的超声的技术方案即可。所述超声的温度优选为25～30℃。超声的时间优选为20～40min，更优选为30min。所述超声的功率优选为100～150W，更优选为120W。

本发明中，所述固液分离的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的固液分离的技术方案即可。本发明中，所述固液分离优选采用离心的方法。所述离心的转速优选为8000～12000rpm，更优选为9000～11000rpm，最优选为10000rpm。在本发明中，所述离心的时间优选为10～15min，更优选为12min。

本发明中，所述固液分离后得到的石斛残渣优选再次与有机溶剂混合后磨碎，得到的石斛浆液再进行超声破碎，收集上清液。将本次得到的上清液与上次得到的上清液合并进入下步骤处理。本发明中，所述再次与有机溶剂混合的石斛残渣与有机溶剂的混合比例与上述方案相同。所述超声破碎的参数与上述步骤超声破碎的参数均相同，在此不做赘述。

得到上清液后，本发明将所述上清液进行浓缩，得到提取物干粉。

本发明中，所述浓缩优选为氮气吹干浓缩。所述氮气吹干浓缩的时间为40～100min，更优选为60min。本发明中，所述氮气吹干浓缩优选采用氮气吹干仪进行。所述氮气吹干仪的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的氮气吹干仪即可。本发明实施例中，所述氮气吹干仪购自杭州奥盛仪器有限公司。

得到提取物干粉后，本发明将所述提取物干粉与硫酸溶液混合，得到混合液，调节所述混合液的pH值至9.5～10.5，将得到的碱性混合液静置。

本发明中，所述提取干粉与硫酸溶液混合的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的混合的技术方案即可。所述混合按照提取物干粉的质量与硫酸溶液的体积比优选为(7～11)mg：(1～2)mL，更优选为(8～9)mg：(1～1.5)mL。所述硫酸溶液的体积浓度优选为8％～12％，更优选为10％。

本发明中，所述调整混合液的pH值优选至10。所述调整pH的溶液优选为氨水。所述氨水的质量分数优选为20～30％，更优选为25％。

本发明中，所述静置的时间优选为30～50min，更优选为40min。所述静置的目的是使生物碱盐更加充分地转变为游离生物碱。

所述静置后，本发明将所述静置后的碱性混合液与二氯甲烷混合，离心，得到二氯甲烷相。

本发明中，所述碱性混合液与二氯甲烷的体积比优选为(2～3)mL：(1～2)mL，更优选为2～2.5：1～1.5。

本发明中，所述离心得转速优选为3500～5000rpm，更优选为4000rpm。本发明中所述离心的时间优选为15～20min，更优选为18min。

离心后，小心收集二氯甲烷相至新的离心管中。本发明中，所述收集的方法优选采用移液器吸取二氯甲烷相转移至新的离心管中。

本发明中，得到二氯甲烷相后，优选重复上述步骤，将剩余萃取液与纯二氯甲烷混合，固液分离后，收集下层二氯甲烷相于新的离心管中，合并两次下层溶液。所述混合优选涡旋方法。所述涡旋的时间优选为30～40s。

得到二氯甲烷相后，本发明将所述二氯甲烷相浓缩，得到生物碱干粉。

本发明中，所述浓缩优选为氮气吹干浓缩。所述氮气吹干浓缩的时间为40～100min，更优选为60min。本发明中，所述氮气吹干浓缩优选采用氮气吹干仪进行。所述氮气吹干仪的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的氮气吹干仪即可。本发明实施例中，所述氮气吹干仪购自杭州奥盛仪器有限公司。

得到生物碱干粉后，本发明将所述生物碱干粉用无水甲醇复溶，固液分离后得到游离生物碱待测样品。

所述生物碱干粉的质量与无水甲醇体积比优选为(0.6～1.2)mg：(500～800)μL，更优选为(0.8～1.0)mg：(500～600)μL。

得到复溶的溶液后优选将复溶液进行过滤。所述过滤优选采用膜过滤。所述过滤膜的孔径优选为0.22μm。

得到过滤的游离生物碱待测样品，本发明用超高效液相色谱分离所述游离生物碱待测样品，将分离后的生物碱成分用质谱检测，得到生物碱成分物质峰。

本发明中，所述色谱分离条件优选包括如下参数：

色谱柱为Hypersil GOLD液相色谱柱；所述Hypersil GOLD液相色谱柱的规格为2.1mm×100mm×1.9μm；

柱温为40℃；

洗脱系统流动相A为体积浓度0.1％甲酸水溶液，流动相B为体积浓度0.1％甲酸乙腈溶液；

洗脱的流速为0.35mL/min；

进样体积为5μL；

流动相梯度洗脱程序：(0,1min)，流动相A与流动相B的体积比19：1的混合液；

[1min,24min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[24min,28min)，流动相A与流动相B的体积比为1：19；

[28min,28.1min)，流动相A与流动相B的体积比为恒定值，所述恒定值的范围为1：19～19：1；

[28.1,30min]，流动相A与流动相B的体积比为19：1。

本发明中，所述质谱检测条件优选包括以下参数：

离子源为电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测；

鞘气，30自由单位；辅助气，6自由单位；

喷雾电压，3.8kV；

离子传输毛细管温度为350℃，源加热温度为350℃；

母离子扫描范围：50-1000m/z，数据依赖的扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描；

碎裂方式：碰撞诱导解离，正态化能量30％，q值0.25，活化时间为30ms，动态排除时间为5s；

一级质谱在m/z400时分辨率为30000，二级质谱在m/z400时分辨率为30000。

得到生物碱成分物质峰，本发明用OSI/SMMS软件对所述生物碱成分物质峰进行定性分析。

本发明中，所述定性分析优选方案步骤为：(1)从质谱总离子流图中提取出物质峰，得到精确的分子量；(2)根据化合物峰的一级、二级质谱离子碎片信息搜索数据库，得到数据库中与筛选的物质相匹配的质谱碎片信息；(3)将加合离子类别、分子量误差、保留时间、相关文献和步骤(2)中得到的质谱碎裂信息结合分析，得到化合物的结构。

本发明中，所述物质峰是质谱能够检测到的峰。

本发明中，所述的数据库包括HMDB、Metlin、Lipid maps、MMCD等网络数据库和自建数据库。

本发明中，所述加合离子类别包括M+H，M+Na，M+NH4等。

本发明中，所述分子量误差为绝对值小于10mmu。

下面结合实施例对本发明提供的基于UPLC/LTQ-Orbitrap Velos MS检测石斛生物碱成分的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、仪器与试药

1.1仪器：UHPLC液相系统Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)和质谱LTQ Orbitrap Velos Pro(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)。

1.2试药：铁皮石斛类原球茎材料由安徽农业大学生命科学学院提供，甲醇、乙腈为色谱级，其他试剂为分析纯。

石斛材料的预处理

取石斛类原球茎于105℃烘箱中杀青20min后，于60℃烘箱中烘干至恒重。

石斛生物碱类成分的提取

(1)取烘干的石斛样品50～80mg于2mL离心管中，加入1mL纯甲醇溶液后用球磨仪磨碎。

(2)25～30℃超声提取30min，11000rpm离心10～15min，取上清700～800μL上清于新的离心管中。

(3)重复上述步骤，向沉淀中加入1mL纯甲醇溶液，涡旋30～45s，25～30℃超声提取30min(超声功率120w)，取800～900μL上清于新的离心管中，合并两次上清溶液。

(4)上清溶液用氮气吹干后，加入1～2mL10％硫酸溶液(v/v)，涡旋1～2min后用25％的氨水(m/m)调节pH至10，室温下静置30～50min。

(5)加入1mL纯二氯甲烷溶液，涡旋30～40s后，4000rpm离心15～20min，取下层二氯甲烷相溶液700～800μL于新的离心管中。

(6)重复上述步骤，向剩余萃取液中加入1mL纯二氯甲烷溶液，涡旋30～40s后，4000rpm离心15～20min，取下层二氯甲烷相溶液800～900μL于新的离心管中，合并两次下层溶液。

(7)二氯甲烷相溶液用氮气吹干后，加入500～600μL纯甲醇溶液复溶后，11000rpm离心10～15min，过0.22μm滤膜后即可进行分析。

4.样品的分离和检测

色谱条件：色谱柱为Hypersil GOLD液相色谱柱(C18，2.1mm×100mm×1.9μm)；柱温为40℃；洗脱系统为正离子模式下流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；流速为0.35mL/min；进样体积5μL；

梯度洗脱程序如表1所示

表1 流动相梯度洗脱参数

时间(min)流动相A(％)流动相B(％)09551955240952809528.195530955

质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子模式检测；鞘气，30自由单位；辅助气，6自由单位；喷雾电压，3.8kV；离子传输毛细管温度为350℃，源加热温度为350℃，使用前经标准校正液校正。母离子扫描范围：50-1000m/z，数据依赖的扫描模式，每次全扫描后采集最强的5个碎片图谱进行二级质谱扫描。碎裂方式：碰撞诱导解离，正态化能量30％，q值0.25，活化时间为30ms，动态排除时间为5s。MS1在m/z400时分辨率为30000，MS2在m/z400时分辨率为30000。

5.石斛新类型生物碱成分的定性分析

采用多层次定性体系的代谢小分子化合物快速鉴定分析系统(OSI/SMMS)对生物碱成分物质峰进行定性。共分离鉴定出22种生物碱成分，包括莨菪烷生物碱2种，单萜生物碱1种，单萜吲哚生物碱2种，吡咯烷生物碱3种，异喹啉生物碱4种，二萜生物碱1种，喹诺里西啶型生物碱3种，哌啶生物碱1种，甾体生物碱2种，其他生物碱3种。具体结果如表2所示。以喹诺里西啶型生物碱Luciduline为例，从总离子流图中(图1)提取出m/z225.19556(图2)。在正离子模式下，一级质谱准分子离子峰为m/z225.19556[M+NH₄]⁺(图3)，二级质谱中存在m/z>13H₂₁NO。

表2 铁皮石斛类原球茎中新类型生物碱成分

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。