一种乳酸菌与黑曲霉混合固态发酵制剂的制备方法与应用

摘要

本发明提供一种乳酸菌与黑曲霉混合固态发酵制剂的制备方法，通过干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)zhang与黑曲霉(Aspergillus niger)KT‑An8混合固态发酵后，既提升了发酵制剂中的乳酸菌数量和乳酸等代谢产物的含量，又提高了黑曲霉所代谢产生的酸性蛋白酶含量。其中，所述干酪乳杆菌zhang的保藏编号CGMCC No.5469，所述黑曲霉KT‑An8的保藏编号为CGMCC No.12866。通过本发明上述制备方法制得的发酵制剂产品可直接作为益生菌制剂应用于动物饲料中，这种混合发酵方法可以大大减少发酵成本，提高生产效率，对生产具有极大帮助。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳酸菌与黑曲霉混合固态发酵制剂的制备方法与应用，属于微生态制剂技术领域。

背景技术

随着对微生物群落相互作用机理的不断认识，人们利用混合发酵技术以同种培养基进行发酵，获得高活菌数的混合发酵产物也越来越受到重视。混合发酵能利用它们的互利关系，使混合菌种取长补短，发挥各自优势，生产出成本低、质量优的独特产品。

在瘤胃动物微生态制剂中，乳酸菌和黑曲霉对动物肠道都具有独特作用，其中，黑曲霉可产生大量的酸性蛋白酶等蛋白酶类物质，加速瘤胃中营养物质的消化速率，同时黑曲霉具有良好的生物吸附特性，可有效吸附饲料中的重金属离子，降低重金属离子对动物的毒害性。在肉牛日粮中添加黑曲霉可使其体重增加7.5％；在奶牛中添加黑曲霉可使其产奶量增加20％。对于乳酸菌，其中作为肠道中的常见菌群，其能通过分泌细菌素、过氧化氢、有机酸(包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等)等物质，可使肠道环境pH值下降，抑制有害病原微生物生长。

但大量研究人员只是针对乳酸菌对霉菌的抑制效果进行研究，很少涉及乳酸菌和霉菌的混合发酵方面的研发。乳酸菌和黑曲霉混合培养过程中，黑曲霉可消耗固体发酵原料中残余的空气，为乳酸菌的生长提供了较好的厌氧环境；黑曲霉可产生大量蛋白酶大量分解蛋白类物质生成大量肽，这解决了乳酸菌蛋白酶系不发达的问题，为乳酸菌的生长提供了丰富的氮源，促进了乳酸菌的繁殖与代谢，降低了发酵原料的pH；与此同时，较低的酸性环境有利于黑曲霉酸性蛋白酶的合成，从而形成一种良性循环。此种发酵后所得到的产品，不但具有乳酸菌发酵后的酸香味和丰富的乳酸菌以及大量的乳酸，而且具有黑曲霉代谢产物中丰富的酶类物质。因此，在产品的风味口感、营养价值及生理功能等方面优于任何单菌发酵的产品，在动物的养殖中具有良好的应用价值。

发明内容

本发明主要目的是提供一种乳酸菌与黑曲霉混合固态发酵制剂的制备方法，通过干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)zhang与黑曲霉(Aspergillus niger)KT-An8混合固态发酵后，既提升了发酵制剂中的乳酸菌数量和乳酸等代谢产物的含量，又提高了黑曲霉所代谢产生的酸性蛋白酶含量。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种乳酸菌与黑曲霉混合固态发酵制剂的制备方法，包括：分别制备干酪乳杆菌zhang冻干菌粉和黑曲霉KT-An8种子液，再进行如下混合固态发酵：固态发酵培养基的质量分数组成为：豆粕15％，饲料级喷浆玉米皮10％，燕麦麸皮30％，葡萄糖5％，水40％，无需灭菌，初始pH为6.5，干酪乳杆菌zhang的接种量为1×10⁶CFU/g固态发酵培养基，黑曲霉KT-An8的接种量为10g种子液/1Kg固态发酵培养基，发酵温度30℃，发酵时间6天。

进一步地，所述的黑曲霉KT-An8种子液的制备方法如下：

(1)在查氏固体斜面培养基制备一级种子：NaNO₃>2HPO₄>4>4>

(2)二级种子制备：培养基质按质量分数组成，豆粕20％，燕麦麸皮40％，水40％，121℃灭菌15min，挑取一级种子用无菌水10mL稀释摇匀制成菌悬液，接种量为10mL/10kg培养基质，30℃培养4天后制得即为黑曲霉KT-An8种子液。

进一步地，所述的干酪乳杆菌zhang冻干菌粉的制备方法如下：

(1)干酪乳杆菌zhang的高密度发酵：大豆蛋白粉60g/L，葡萄糖40g/L，无水乙酸钠10g/L，K₂HPO₄>10CFU/mL以上；

(2)上述高密度发酵液直接添加保护剂干粉混合均匀成菌悬液，经冷冻干燥得到冻干菌粉，冻干菌粉中干酪乳杆菌zhang活菌数达到2×10¹¹CFU/g以上；

进一步地，所述保护剂由脱脂乳、海藻糖、大豆蛋白粉和维生素C组成；

更进一步地，所述保护剂与干酪乳杆菌zhang高密度发酵液的质量比组成如下：脱脂乳3％，海藻糖1.5％，大豆蛋白粉15％，维生素C 0.4％，余量为干酪乳杆菌zhang高密度发酵液。

本发明所述的干酪乳杆菌zhang(专利CN102813004A已公开)是于2001年从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶样品中分离筛选出的一株性能卓越的乳酸菌，其具有良好的胃肠道消化液耐受能力，可在人体肠道中存活、定植并繁殖，使肠道菌群结构年轻化；具有降血脂、提高机体抗氧化能力、保护肝脏和预防Ⅱ型糖尿病的作用。该菌株已于2011年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5469，分类命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

本发明所述的黑曲霉KT-An8是分离自自然发酵的饲料样品中，自30株黑曲霉菌株中通过发酵豆粕和麸皮基质筛选出，具有高产各种代谢酶活的能力。该菌株已于2016年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.12866分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)。

本发明所述的黑曲霉KT-An8菌株在前述基础发酵培养基上培养3d各种酶活力如下：糖化酶3000U/mL培养液，木聚糖酶酶活3000U/mL培养液，酸性蛋白酶2012.52U/mL培养液，果胶酶5000.16U/mL培养液，纤维素酶4361.37U/mL培养液，β-葡萄糖苷酶2012.52U/mL培养液。黑曲霉KT-An8发酵豆粕和麸皮产生的丰富酶系，能够更好的作用于豆粕和麸皮，降解豆粕中的多糖、蛋白质和纤维素等。

通过本发明上述制备方法制得的发酵制剂产品中乳酸产生量较干酪乳杆菌zhang单独发酵提高10％；所得发酵产品中乳酸菌的活菌数为1.02×10¹⁰CFU/g，较干酪乳杆菌zhang单独发酵活菌数提高10倍；所得发酵产品中pH值为4.22，较干酪乳杆菌zhang单独发酵pH值4.67显著降低；所得发酵产品中酸性蛋白酶产生量较黑曲霉KT-An8单独发酵提高15.6％。

通过本发明上述制备方法制得的发酵制剂产品可直接作为益生菌制剂应用于动物饲料中，优选的添加在饲料中的质量比为10-80％。这种混合发酵方法可以大大减少发酵成本，提高生产效率，对生产具有极大帮助。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。

实施例1：

1.1黑曲霉KT-An8种子液的制备：

(1)在查氏固体斜面培养基制备一级种子：NaNO₃>2HPO₄>40.5g，FeSO₄>

(2)二级种子制备：质量分数组成，豆粕20％，燕麦麸皮40％，水40％，121℃灭菌15min，挑取一级种子用无菌水10mL稀释摇匀制成菌悬液，接种量为10mL/10kg培养基质，30℃培养4天后制得即为黑曲霉KT-An8种子液。

1.2干酪乳杆菌zhang冻干菌粉的制备：

(1)干酪乳杆菌zhang的高密度发酵：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，无水乙酸钠10g，K₂HPO₄>10CFU/mL以上；

(2)上述高密度发酵液直接添加保护剂干粉混合均匀成菌悬液，经冷冻干燥得到冻干菌粉，冻干菌粉中干酪乳杆菌zhang活菌数达到2×10¹¹CFU/g以上；

所述保护剂与干酪乳杆菌zhang高密度发酵液的质量比组成如下：脱脂乳3％，海藻糖1.5％，大豆蛋白粉15％，维生素C 0.4％，余量为干酪乳杆菌zhang高密度发酵液。

1.3试验测定方法

乳酸菌活菌计数：一般采用倾注平板计数法，操作步骤为：依据国标方法，摇匀发酵液，吸取1mL发酵液置于9mL的无菌生理盐水中，进行10倍稀释，随后依次稀释至所需梯度。将最后稀释梯度试管稀释振匀后，吸取1mL稀释液倾注至平板中，到入培养基，摇匀，置凝固，于37℃培养箱培养48h。平板分别做两个梯度，每个梯度两个平行。

测定乳酸菌活菌数培养基：MRS+放线菌酮固体培养基。

pH测定：使用精确pH计直接测定发酵液pH值。

乳酸含量测定：采用高效液相色谱检测。

酸性蛋白酶检测：采用酸性蛋白酶检测试剂盒，通过酶标仪进行检测。

1.4干酪乳杆菌zhang和黑曲霉KT-An8混合固态发酵制剂的制备方法：

固态发酵培养基质量分数组成：豆粕15％，饲料级喷浆玉米皮10％，燕麦麸皮30％，葡萄糖5％，水40％，无需灭菌，初始pH为6.5，干酪乳杆菌zhang的接种量为1×10⁶CFU/g固态培养基，黑曲霉KT-An8的接种量为10g种子液/1Kg固态发酵培养基，发酵温度30℃，发酵时间6天。

对照组1：豆粕15％(m/m)，喷浆玉米皮10％(m/m)，燕麦麸皮30％(m/m)，葡萄糖5％(m/m)，水40％(m/m)，无需灭菌，初始发酵pH为6.5，乳酸菌接种量为1×10⁶CFU/g，,发酵温度30℃，发酵时间6天。

对照组2：豆粕15％(m/m)，喷浆玉米皮10％(m/m)，燕麦麸皮30％(m/m)，葡萄糖5％(m/m)，水40％(m/m)，无需灭菌，初始发酵pH为6.5，黑曲霉接种量为10g二级种子/1Kg固态发酵培养基,发酵温度30℃，发酵时间6天。

1.5试验结果

(1)乳酸菌活菌数的变化情况

表1：乳酸菌活菌数的变化情况

干酪乳杆菌zhang与黑曲霉KT-An8混合固态发酵后，所得发酵制剂产品中乳酸菌的活菌数为1.02×10¹⁰CFU/g，较干酪乳杆菌zhang单独发酵活菌数提高5.58倍，乳酸菌活菌数明显提高。

(2)发酵后pH值的变化情况

表2：发酵后pH值的变化情况

干酪乳杆菌zhang与黑曲霉KT-An8混合固态发酵后，所得发酵制剂产品中pH值为4.22，较干酪乳杆菌zhang单独发酵pH 4.67显著降低，说明混合发酵可显著降低饲料的酸度，增加了产酸量。

(3)发酵后乳酸的变化情况

表3：发酵后乳酸的变化情况

干酪乳杆菌zhang与黑曲霉KT-An8混合固态发酵后，所得发酵制剂产品中乳酸产生量较干酪乳杆菌zhang单独发酵增加30％，显著增加乳酸含量。

(4)发酵后酸性蛋白酶的变化情况

表4：发酵后酸性蛋白酶的变化情况

按照所述发酵方法所得发酵制剂产品中酸性蛋白酶产生量较黑曲霉KT-An8单独发酵提高15.6％，说明乳酸菌干酪乳杆菌zhang产生的酸性环境有利于黑曲霉KT-An8酸性蛋白酶的产生。

通过本发明方法制备的发酵制剂产品，不但具有乳酸菌发酵后的酸香味和丰富的乳酸菌以及大量的乳酸，而且具有黑曲霉代谢产物中丰富的酶类物质。因此，在产品的风味口感、营养价值及生理功能等方面优于任何单菌发酵的产品，在动物的养殖中具有良好的应用价值。