富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的快速筛选方法、实现该方法的联合序列及其构建方法

摘要

本发明提供用于含有瑞士乳杆菌基因组pepX、pepN和pepO基因的联合序列在筛选富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌中的应用。本发明还提供富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的快速筛选方法，包括(1)提取瑞士乳杆菌菌株的基因组DNA；(2)构建各待筛选菌株的联合基因序列；(3)将待筛选菌株的联合基因序列与如SEQ No.1所示的联合基因核酸序列进行比对，构建邻接法系统发育树，通过发育树获得瑞士乳杆菌的分型；(4)将发育树表现为与瑞士乳杆菌H9为同一分支的菌株鉴定为高产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌。本发明的方法能够有效筛选鉴定富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌，具有筛选成本低、操作简单的优点。

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种快速筛选富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的方法，以及实现所述方法的联合序列。

【背景技术】

瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)是公认的益生乳酸菌，广泛应用于发酵乳、奶酪等乳制品工业中。据文献报道，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)具有较强的蛋白水解酶系统，其制作的发酵乳可代谢产生大量生物活性三肽VPP和IPP，具有降血压的功效。发酵乳制品有无降低高血压的作用及降低血压功能的强弱与其所使用发酵剂的种类及发酵乳中抗高血压肽的含量和类别有密切的关系，VPP和IPP是迄今为止发现的最为有效的降血压肽，血管紧张素转化酶Ⅰ(ACE)能将血管紧张素Ⅰ末端的二肽切割下来，使之转变为有较强血管收缩调节活性的血管紧张素Ⅱ，后者能促使血管平活肌收缩，同时ACE还能使缓激肽失活，转变为没有活力的缓释肽，从而导致血压升高，而VPP和IPP可抑制ACE活性。

虽然目前从乳酸菌发酵牛乳获得的ACE抑制肽的降压效果还无法与常用抗高血压药物相比，但乳源性ACE抑制肽可以长期安全食用，不会出现常用抗高血压药物常见的不良反应如疼痛、发烧等，研究所取得的结果也证明，通过筛选能发酵牛乳产生ACE抑制肽的乳酸菌是一种可靠的途径，利用这些乳酸菌开发具有抗高血压作用的保健食品将是今后的一个重要研究领域，因此寻找一种快速筛选富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)方法显得尤为重要。

郭宇星等人研究了瑞士乳杆菌的pepX的分离及纯化(瑞士乳杆菌X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶的分离纯化及酶学性质，食品科学，2013,Vol.34,No.17)。王晓伟等人研究了不同地区自然发酵乳制品中瑞士乳杆菌的多位点序列分型研究(不同地区自然发酵乳制品中瑞士乳杆菌的多位点序列分型研究，2015年6 月)，并将pepX、pepN列为瑞士乳杆菌的看家基因，但并没有考察这些看家基因的进一步应用。

由此可以看出，尽管已经有瑞士乳杆菌看家基因的研究，但目前尚未有明确的结论表明抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌取决于哪些基因，也缺少通过生物工程方法借助基因信息快速、准确筛选富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的方法。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌的快速筛选方法，以及实现该方法的联合基因序列、其构建方法及应用。

本发明的思路是以瑞士乳杆菌的代谢途径为依据，选取已知的大量参与蛋白水解的相关基因中选取特定的pepX、pepN和pepO基因为靶点，通过设计引物、PCR扩增获得含有pepX、pepN和pepO基因片段的联合序列，并通过测序、构建系统发育关系实现富产抑制ACE活性肽特性瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的快速筛选。

为此，本发明提供用于含有瑞士乳杆菌基因组pepX、pepN和pepO基因的联合序列在筛选富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌中的应用。

所述的联合基因序列的构建方法包括以下步骤：

(1)根据瑞士乳杆菌基因组的pepX、pepN和pepO功能基因设计特异性扩增引物；

(2)利用引物通过PCR扩增模板DNA，扩增蛋白水解功能基因片段，

扩增体系：

模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH₂O补足至50μL；

扩增条件：

95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，4℃保存；

(2.3)核苷酸序列测定

各扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格，按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；

(2.4)拼接序列

将测序所得的双向序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对，拼接获得单个基因高质量的序列，经Clustal W比对，取等长基因片段，按pepX-pepN-pepO顺序进行连接，得到所述联合基因序列。

优选地，步骤(1)所述的瑞士乳杆菌是瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticusH9。

优选地，步骤(2)的特异性引物是：

pepX

pepX-1：GCAGTGCACAAGTCCTCTTAC

pepX-2：TTGACGAAAATCTCTCTGACTC

pepN

pepN-1：TGGTTCGGTGACTTGGT

pepN-2：TTGCTTGCCTTCTGCTA

pepO

pepO-1：ATTTAGCTGTACGTGGCGG

pepO-2：TCAGTAGACTTGACGACCTTG

作为快速筛选方法的比对品，本发明提供用于筛选富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌的联合基因序列，所述序列如SEQ No.1所示。该序列是以瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus H9基因组DNA为模板，根据前述的构建方法得到的含有瑞士乳杆菌H9株的pepX、pepN和pepO基因的联合基因序列。

本发明还提供一种富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌的快速筛选方法，包括以下步骤：

(1)取前期鉴定为瑞士乳杆菌的菌株进行活化镜检，对确定为革兰氏阳性的纯培养物提取其基因组DNA；

(2)根据前述的构建方法，构建步骤(1)的各待筛选菌株的联合基因序列；

(3)采用MEGA6.0软件包分析，经Clustal W比对，将步骤(2)带筛选菌株的联合基因序列与如SEQ No.1所示的联合基因核酸序列进行比对，构建邻接法系统发育树，通过发育树获得瑞士乳杆菌的分型；

(4)将发育树表现为与瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus H9为同一分支的菌株鉴定为高产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌，将处于发育树另一分支的菌株鉴定为低产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌。

在本发明的快速筛选方法中，步骤(1)包括：

(1.1)取保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于脱脂乳中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继代培养三代；

(1.2)对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μLpH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化5min，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70体积％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；

(1.3)使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测所提取DNA的浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶对发酵乳杆菌基因组DNA进行电泳检测。电泳图应条带清晰，无拖尾。

在本发明中，步骤(2)包括：

(2.1)根据已经公开的瑞士乳杆菌H9基因组的pepX、pepN和pepO基因设计特异性扩增引物；

(2.2)分别以待筛选菌株的基因组DNA为模板，分别利用引物通过PCR扩增模板DNA，扩增看家基因片段，

扩增体系：

模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶5U/μL 0.5μL，ddH₂O补足至50μL；

扩增条件：

95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，4℃保存；

(2.3)核苷酸序列测定

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格，按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序；

(2.4)拼接序列

将测序所得的双向序列导入软件DNAstar的Seqman模块中，结合序列峰图进行序列比对拼接及单碱基校对。

其中，步骤(2.1)的引物如下：

表1三个蛋白水解功能基因信息和引物信息

与现有技术相比，本发明利用蛋白水解功能基因pepX、pepN和pepO片段的联合序列筛选鉴定富产抑制ACE活性肽瑞士乳杆菌，具有筛选成本低、操作简单的优点，此外该筛选方法还具有灵敏度高和通量高等优点，可通过一次操作对多株待筛选菌株完成快速精确鉴定筛选，获得富产抑制ACE活性肽的瑞士乳杆菌。

【附图说明】

图1为表2的分离株的pepX基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为表2的分离株的pepN基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为表2的分离株的pepO基因片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为实施例3的系统发育树图。

【具体实施方式】

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

在本发明中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为重量百分比、“份”均为重量份。

实施例1菌株的活化、培养和鉴定

以内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库中已通过其他现有技术完成产抑制ACE活性肽特性分析的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)样品作为分析对象，共收集菌株12株。菌株信息如下：

表2 Lactobacillus helveticus菌株分离源和产ACE抑制肽特性

对每份样品进行如下操作：

菌株活化：将保存于安瓿管中的冻干菌粉，置于脱脂乳中活化复壮(37℃，24h)，对菌液涂片镜检，将镜检结果为革兰氏阳性的纯培养物继续传代培养至第三代。

采用液氮冻融-CTAB法提取菌株DNA：对上述三代纯培养物菌液进行洗涤处理，取0.5g洗脱菌体于500μL pH＝8.0的TE缓冲液中并充分混匀，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min(为了使沉淀、水相和有机相分层)，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，随后加入0.1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，最后用70体积％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。

实施例2联合序列的构建

2.1设计引物

以瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus H9(genbank编号CP002427)为模板，选取参与蛋白水解系统的pepX、pepN和pepO关键基因为靶点。采用Primer Premier 5.0软件设计特异性扩增引物，人工合成各引物如前述表1。

2.2

利用表1的引物分别通过PCR扩增模板DNA，分别得到各菌株的三种基因片段，模板DNA来自表2的12株分离株。

扩增体系：模板DNA 50ng,10×PCR缓冲液5μL，dNTPs(2.5mmol/μL)4μL，上下游引物各10μM 1.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增条件：

95℃预变性5min；95℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min,30个循环；72℃末端延伸10min，4℃保存；

2.3核苷酸序列测定

各扩增产物如图1所示，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格，各泳道产物条带清晰明亮，无拖尾，无明显非特异性扩增，说明PCR产物可用于后续实验，按照ABI 3730XL测序平台技术流程进行双向测序，测序峰图文件无双峰或杂峰，可用于后续分析。

2.4数据分析

测序所得原始数据经DNASTAR软件SeqMan模块质控、拼接，获得单一序列。

实施例3构建发育树

以已公开的瑞士乳杆菌Lactobacillus helveticus H9基因组DNA为模板，以实施例2的相同步骤扩增，得到的基因片段按pepX-pepN-pepO的顺序串联起来，获得SEQ No.1的联合基因序列，作为筛选方法所用的标准品。

将实施例2的每株菌的序列按pepX-pepN-pepO的顺序串联起来，分别获得12株待筛选菌株的联合基因序列，其核酸序列如SEQ No.2-13所示。

采用MEGA6.0软件包分析联合序列，经Clustal W比对，对实施例2分离得到的12株菌的联合基因序列与SEQ No.1的联合序列进行两两比对，计算序列间的距离，构建距离矩阵，以距离矩阵反映各序列之间亲缘关系。

然后通过构建邻接法(Neighour-joining,N-J)构建系统发育树，如图4所示。

由图4可以看出，基于pepX-pepN-pepO的联合基因序列构建的系统发育树可以看出12株待筛选瑞士乳杆菌株与瑞士乳杆菌H9共同构建的系统发育树主要为两个分支，其中一个分支中包含IMAU60206、IMAU60211、IMAU60204、IMAU60201、IMAU60212、IMAU60117、IMAU20076、H9和DPC4571，这些菌株的发酵牛乳均具有富产ACE抑制肽的特性，均判断为富产ACE抑制肽菌株；另外一个分支包含IMAU50011、IMAU50019、IMAU10149、IMAU50064，它们产ACE抑制肽的较低，判断为低产ACE抑制肽菌株。这与表2记载的根据其他现有技术测得的结果完全一致。

可见，本发明的方法简单高效，可用于快速筛选富产VPP、IPP的乳酸菌菌株特别是瑞士乳杆菌菌株，为抗高血压功能性发酵乳制品的研发提供供试菌株。