多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的方法

摘要

本发明提供了多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1‑29所示的引物，本发明还提供了六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检测方法和试剂盒。通过上述技术方案，本发明为六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的快速、准确筛查提供了完备的技术手段，能实现食物中毒事件发生后和疫情暴发后的六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌快速筛检与鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌用引物组和试剂盒及其检测方法。

背景技术

志贺氏菌是一类具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌，由其临床感染所导致的志贺氏菌性痢疾(shigellosis)是发展中国家重要的传染病之一，也是发达国家腹泻病的主要病原。

大肠埃希菌(Escherichia coli)是肠道中重要的正常菌群。但在宿主免疫力下降或者细菌侵入肠道外组织器官后，即可成为条件性致病菌，引起肠道外感染。其次，有些大肠埃希氏菌菌株携带致病基因，能引起腹泻，称为致泻大肠埃希氏菌。现已知致泻大肠埃希氏菌有：肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)，产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)，肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenicE.coli，EPEC)，肠道出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)，肠道集聚性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli，EAEC)，以及肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌(diffusively adherent E.coli，DAEC)。

我国对致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌检测目前采用的主要方法分别是以国家标准GB/T4789.6-2003和GB/T4789.5-2012作为依据，检测过程为获取样品，增菌，分离培养，革兰氏染色镜检/生化及菌落观察/生化反应实验，肠毒素检查/血清学鉴定。整个检测过程操作复杂，时间长，需要4-7天左右，既费时又费力，检测目标单一，且受限于数据库信息有限等因素，获得的检测数据不可靠。

分子生物学检测方法为致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌检测提供了良好的检测工具，目前国内外均建立了采用PCR技术对致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌进行快速检测的技术。但多使用单重PCR技术进行检测，多对引物的退火温度和浓度不尽相同，需要多轮PCR反应逐一检测，这种方法操作繁琐，耗费时间和人力，需要分别做好每个反应体系的质量控制。

现有的使用多重PCR方法对大肠埃希氏菌和志贺氏菌进行检测的方案均不能很好的区分致泻和非致泻大肠埃希氏菌，也不能准确的判定其致病型。文献“一种多重PCR方法快速鉴定7种常见肠道病原菌”报道了同时检测7种常见肠道致病菌的技术方案。但该方法的estIa和estIb基因扩增片段仅相差15bp，使用小于2.5％的琼脂糖电泳根本无法区分；沙门菌invA基因扩增产物和stx1A基因扩增片段无法区别，需要根据选择性平皿上菌落的特点再加以初步区分；无扩增内标，无法有效的鉴别假阴性结果；同时该方法毒力基因致泻型别覆盖度不够，且敏感度一般。

因此，有必要提供一种新的能够同时对六种致泻大肠埃希氏菌致病型以及志贺氏菌进行快速、特异、敏感检测的技术方案。

发明内容

本发明的目的是解决当前对六种致泻大肠埃希氏菌致病型，即EPEC、EHEC、ETEC、EAEC、DAEC、EIEC，以及志贺氏菌同时进行检测技术中存在的问题，提供一种新的能够同时对六种致泻大肠埃希氏菌致病型以及志贺氏菌进行快速、特异、敏感检测的技术方案。

为达到以上目的，本发明提供了一种多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌用引物组，其中，所述引物组包括SEQ ID NO.1-29所示的引物；所述六种致泻大肠埃希氏菌包括肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli,EIEC)，产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)，肠道出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)，肠道集聚性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli，EAEC)和肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌(diffusively adherent E.coli，DAEC)。

本发明还提供了六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；

(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果。

本发明还提供了一种多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。

另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的试剂盒中的用途；其中，所述六种致泻大肠埃希氏菌包括肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌和肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌。

本发明建立的六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌鉴定多重PCR检测方法，能够将检测时间从传统方法的3-5天缩短到3小时，达到如下的检测效果：

(一)多重检测覆盖全面

本发明所建立的检测方法能够在一次PCR反应中检查是否含有致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的同时，确定六种致泻大肠埃希氏菌的致病型。3个小时内快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。

(二)特异性高

本发明所建立检测方法的特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时特异性实验表明本发明的引物能够很好的区分与致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌种属相近、生存环境相同的细菌，包括阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、霍乱弧菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌及嗜水气单胞菌等。

(三)灵敏度高

本发明所建立的检测方法能够实现14个基因的同时检测，反应体系中每个目标基因的检测灵敏度均可达到10³CFU/ml，与单重实时荧光PCR检测敏感度相当；同时不同基因的检测灵敏度在同一水平线上，避免了对六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌混合感染的漏检。本发明灵敏度提高的主要原因是本发明针对所有目标基因的特异性引物对序列设计了特定的LHP序列，LHP序列中的同源通用引物能够在第二阶段PCR中提高多重PCR反应的扩增效率，降低多重PCR反应的非特异性扩增和引物二聚体的产生，而LHP中的6个碱基连接序列能够保证同源通用引物扩增不同毒力基因时具有相同的扩增效率，避免多重PCR扩增过程中不同目标基因产量的失衡，从而在总体上提高多重PCR检测的灵敏度。

(四)成本较低

本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要14次人工和14倍时间，现在使用此方法只需要1次人工和1个反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50％以上的试剂成本。

(五)预防假阴性结果

体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示假阴性检测结果。

本发明为六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌快速筛查提供了完备的解决方案，能实现食物中毒事件发生和传染病疫情暴发后的六种致泻大肠埃希氏菌致病型和志贺氏菌的快速鉴定，为合理恰当处置疫情提供可靠的依据。

本发明克服了现有技术操作繁琐、耗时耗力、难以开展均一质量控制等缺点和不足，解决了六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌同时快速鉴定的难题。

基于EIEC/志贺氏菌属的ipaH基因、大肠埃希氏菌属/志贺氏菌属的通用基因uidA和其毒力相关基因，设计一套六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌鉴定的引物序列，建立基于该引物序列的多重PCR检测方法，同时在体系中加入扩增内标，一个反应体系中完成内部质量控制。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本发明提供了一种多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌用引物组，其中，所述引物组包括SEQ ID NO.1-29所示的引物；所述六种致泻大肠埃希氏菌包括肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌和肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌。

其中，检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌用同源通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；

本发明还提供了检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌长引物检测用LHP序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；

其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.31-32所示的引物。SEQ ID NO.31-32所示的引物是以pET28a质粒为模板设计的一对引物，作为阳性内对照引物对。

本发明所提供的引物组是以14个基因作为目标扩增序列所设计的，其中，uidA基因为判定大肠埃希氏菌属、志贺氏菌属的分子靶点；elt，estla和estlb为ETEC鉴定靶点；bfpB和escV为EPEC的鉴定靶点；escV，stx1和stx2为EHEC的鉴定靶点；ipaH为EIEC的鉴定靶点；astA，aggR和pic为EAEC的鉴定靶点；daaC和afa为DAEC的鉴定靶点(如表1所示)。

表1六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌鉴定多重PCR引物汇总表

在本发明的一种实施方式中，提供了六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果。根据核酸电泳的结果进行样本判定。样本判定依据如表2所示。

表2样本判定依据

其中，优选地，SEQ ID NO.1-28所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQID NO.29所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。

其中，优选地，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：

a：94-96℃，4-6min；

b：94-96℃，15-60s，

c：50-60℃，15-60s，

d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；

e：94-96℃，15-60s，

f：55-65℃，15-60s，

g：71-73℃，30-120s，进行30-35个e-g的循环；

h：71-73℃，5-10min。

其中，所述待测样本可以包括但不限于食品、药品、排泄物、呕吐物和体液中的至少一种。优选地，本发明的多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的检测方法不用于诊断。或者说六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的定性与定量结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是能够作为中间信息，供临床医生参考。

其中，优选地，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

在本发明的一种实施方式中，采用QIaxcel全自动毛细管电泳分析仪作为结果分析的平台。基于QIaxcel的全自动操作和设定的智能化结果分析程序，从而实现结果的自动判定分析。

本发明的一个方面还提供了一种多重PCR检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶；所述六种致泻大肠埃希氏菌包括肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌和肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌。

优选的，所述试剂盒还包括PCR反应所需的PCR反应试剂，所述反应试剂可以为PCR反应缓冲液和dNTP。

另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的试剂盒中的用途；其中，所述六种致泻大肠埃希氏菌包括肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌和肠道弥散粘附性大肠埃希氏菌。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中，肠道侵袭性大肠埃希氏菌和志贺氏菌均来自中国医药细菌保藏管理中心。

实施例1六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌鉴定多重PCR检测试剂盒的组建

该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、去离子水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer(Tris HCl 40mM(pH8.3)，KCl 100mM，tween-200.08％，0.0006ng/μL pET28a，1.5mM dNTP、8mM MgCl₂)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC引物在内的每种长引物浓度均为2μM，同源通用引物SEQ>6CFU/mL)，阳性内对照为pET28a质粒。

试剂盒检测的反应体系为25μL，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；25×DNA聚合酶1μL；10×引物混合液2.5μL；模板2μL，去离子水7μL。

实施例2试剂盒的操作和结果判断

1、核酸的提取

取增菌液或划线培养的菌落溶于水中，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取模板DNA。用NanoDrop测定提取总DNA的浓度。

2、反应体系的配制

取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；25xDNA聚合酶1μL；10×引物混合液2.5μL，模板2μL，去离子水7μL。

3、PCR反应

将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：

a：95℃4min；

b：95℃30s，

c：55℃30s，

d：72℃90s，b-d循环10个反应；

e：95℃30s，

f：60℃30s，

g：72℃90s，e-g循环30个反应；

h：72℃，5min。

4、全自动毛细管电泳分析PCR产物

将PCR反应管放入全自动毛细管电泳仪Qiaxcel Advanced(凯捷公司)，使用高分辨率卡夹，选择合适的alignment marker和size marker，自动分析目标条带的大小。

5、结果判断

A.包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照有阳性内对照的扩增，其他检测有目标条带和(或)阳性内对照的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。

B.所有样本均有uidA(1673bp)的扩增条带，即均为大肠埃希氏菌或志贺氏菌。其他样本还有毒力基因的扩增，为致泻性大肠埃希氏菌。在此基础上，具体判定如下：

样本有uidA(1673bp)、escV(548bp)条带扩增的同时，还具有bfpB(172bp)的扩增条带，且两种志贺毒素stx1(242bp)、stx2(305bp)均阴性，判定为典型EPEC。

样本有uidA(1673bp)、escV(548bp)条带扩增的同时，两种志贺毒素stx1(242bp)、stx2(305bp)均阳性，且bfpB(172bp)无扩增，判定为EHEC。

样本有uidA(1673bp)条带扩增的同时，不耐热肠毒素elt(339bp)、耐热肠毒素estIb(221bp)均阳性，判定为ETEC。

样本有uidA(1673bp)条带扩增的同时，ipaH(433bp)阳性，判定为EIEC/志贺氏菌。

样本有uidA(1673bp)条带扩增的同时，astA(153bp)、aggR(492bp)、pic(965bp)均阳性，判定为EAEC。

样本有uidA(1673bp)、escV(548bp)条带扩增的同时，stx1(242bp)、stx2(305bp)、bfpB(172bp)均阴性，判定为不典型EPEC。

样本有uidA(1673bp)条带扩增的同时，不耐热肠毒素elt(339bp)、astA(153bp)阳性，在与其他型别毒力基因同时存在的情况下，astA不作为判定依据，判定为ETEC。

样本有uidA(1673bp)条带扩增的同时，astA(153bp)均阳性，判定为EAEC。

阳性对照所含的所有目的条带全部可被扩增出来，表明本试剂盒有检测混合感染的能力。

实施例3试剂盒的特异性试验

选择阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、单核增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54102)、结肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为47016)、嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)作为待检细菌。应用本发明试剂盒检测这些待检细菌，扩增内标均为阳性，证明检测系统成立；待检细菌均未出现非特异性的杂带。且对目标菌检测时，除特异性条带外，无杂带产生。表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。

实施例4试剂盒的最低检出限试验

评估用检测样本：选择特定检测的菌株：EPEC、EHEC、ETEC、EAEC、DAEC、EIEC/志贺氏菌。将6个模板的浓度分别调整至10⁸CFU/mL，等比例混合成综合模板。将综合模板梯度稀释成10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL，10³CFU/mL，10²CFU/mL的检测样品。

使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的混合模板。根据实例2进行操作和结果判断，试剂盒检测14个目标基因(不含IAC)的最低检出限试验结果如表3所示：

表3试剂盒检测14个目标基因的最低检出限试验结果

编号扩增条带名称10⁶CFU/mL10⁵CFU/mL10⁴CFU/mL10³CFU/mL10²CFU/mL1ipaH++++-2uidA++++-3elt++++-4estIa++++-5estIb++++-6bfpB++++-7escV++++-8stx1++++-9stx2++++-10astA++++-11aggR++++-12pic++++-13afa++++-14daaC++++-

从表3看出，试剂盒检测六种致泻大肠埃希氏菌和志贺氏菌的最低检出限均可以达到10³CFU/mL。

实施例5试剂盒检测与文献方法的比较

评价本发明试剂盒与文献报道(Claudia Toma,Yan Lu,1 Naomi Higa,NoboruNakasone,Isabel Chinen,Ariela Baschkier,Marta Rivas,and MasaakiIwanaga.Multiplex PCR Assay for Identification of Human DiarrheagenicEscherichia coli.American Society for Microbiology,Dec.2004,p.5849–5853.)效果比较，主要从最低检出限、特异性和覆盖度三个方面进行比较。

评价用阳性样本：EPEC、EHEC、ETEC、EAEC、DAEC、EIEC，以及志贺氏菌各1株，共7株。

评价用阴性样本：阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、单核增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54102)、结肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为47016)、嗜水气单胞菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为44016)。将以上菌株提取核酸后，等比例混合成一个的阴性评估DNA模板。

特异性评估：按照本发明实施例1和2进行特异性评估操作；按照文献报道方法检测uidA，ipaH，elt，estIa，estIb，bfpB，escV，stx1，stx2，astA，aggR，pic，afa，daaC基因和阳性内对照。

覆盖度评估：采用本发明试剂盒和文献方法分别检测上述7株评价用阳性样本，每个菌株DNA模板5-10ng/uL。

最低检出限评估：将所有7株评价用阳性样本分别稀释成10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL，10³CFU/mL，10²CFU/mL，提取核酸制备阳性样品DNA模板，采用本发明试剂盒和文献方法分别检测7株评价用阳性样本的梯度稀释DNA模板。

比较结果：本发明试剂盒和文献报道方法检测阴性样本结果均为阴性，表明均具有较好的特异性。

本发明试剂盒和文献报道方法检测7株评价用阳性样本中的目标基因，均获得阳性结果，其中文献报道方法只能检测ipaH，eae，elt，est，aggR，stx基因；而本发明试剂盒能检测出阳性样本中所有种类的目标基因，包括uidA，ipaH，elt，estIa，estIb，bfpB，escV，stx1，stx2，astA，aggR，pic，afa，daaC基因和阳性内对照。

本发明试剂盒和文献报道方法检测7株阳性样本中目标基因的最低检出限对比如下表4：

表4

由上表可知，本发明试剂盒检测uidA，ipaH，elt，estIa，estIb，bfpB，escV，stx1，stx2，astA，aggR，pic，afa，daaC目标基因的最低检出限均能达到10³CFU/mL的水平，而文献报道方法只有ipaH能够达到10³CFU/mL的水平，eae，elt，est，stx只能达到10⁴CFU/mL的水平，aggR只能达到10⁵CFU/mL的水平。本发明试剂盒检测的最低检出限显著优于文献报道方法。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。