槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用

摘要

本发明公开一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域。本发明首次将槐属二氢黄酮G应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内全部杀灭寄生虫，达到防治多子小瓜虫病的效果，防治多子小瓜虫病效果显著。槐属二氢黄酮G的植物丰富，价格低廉，易获得，无残留、无污染、无公害、对人无毒，其提取制备工艺简单，具有广阔应用前景。槐属二氢黄酮G对草鱼的半致死浓度(46.6mg/L)是防治多子小瓜虫病最低有效浓度(2mg/L)的23.3倍，对鱼安全，有广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于杀灭鱼类寄生虫药物技术领域，涉及槐属二氢黄酮G的新用途，尤其涉及一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

背景技术

寄生纤毛虫病是目前危害水产养殖业最为严重的寄生虫疾病之一。多子小瓜虫是一种世界性分布的鱼类体表寄生纤毛虫，主要寄生于鱼的皮肤，鳃和鳍，引起小瓜虫病，又称“白点病”，给水产养殖业造成巨大经济损失。一些化学药物，如孔雀石绿和汞制剂，杀虫效果虽然好，但是，它们毒性大，残留高，具有“三致”作用，已经被禁止使用。因此，急需寻找安全、高效和环境友好的新型药物来防治小瓜虫病。我国中草药植物资源丰富，具有易分解，无残留及对环境和人安全的优点。研究表明部分中草药植物具有杀灭多子小瓜虫的活性物质。因此，从中草药中分离鉴定出用于防治鱼类寄生虫疾病的活性物质，是开发安全环保渔药的有效途径。

槐属二氢黄酮G(Sophoraflavanone G)是从中药苦参(Sophora flavescens)中分离纯化出的一种黄酮类化合物。分子式为C₂₅H₂₈O₆，分子量为424，白色粉末，易溶于甲醇和乙醇。据文献报道，槐属二氢黄酮G具有抗炎、抗菌和抗肿瘤的作用。其结构式如下：

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

槐属二氢黄酮G在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。

所述的鱼类体外寄生纤毛虫指多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)。

所述的槐属二氢黄酮G的有效浓度为2～11mg/L鱼类养殖用水。

所述的药物的剂型优选为药液或粉剂。

所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明相对于现有技术，具有如下优点及效果：

(1)本发明首次将槐属二氢黄酮G应用于制备杀灭鱼类体外寄生虫药物，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内实现杀灭寄生虫，达到防治多子小瓜虫病的效果；防治多子小瓜虫病效果显著，有广泛应用前景。

(2)槐属二氢黄酮G对草鱼的半致死浓度(46.6mg/L)是防治多子小瓜虫病最低有效浓度(2mg/L)的23.3倍，对鱼绝对安全；

(3)槐属二氢黄酮G的植物来源丰富，价格低廉，易获得，无残留、无污染、无公害、对人无毒，其提取制备工艺简单，具有广阔应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中用到的寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，来源于广州市花都区五星村鱼苗场。寄生虫模型为多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)，来源于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。

实施例1：槐属二氢黄酮G药物对多子小瓜虫感染性幼虫的杀灭作用

(1)药液的配制：称取槐属二氢黄酮G 3.84mg于1.5mL的EP管中，用20μL无水乙醇溶解，然后用蒸馏水配成2560mg/L的药物原液，用梯度稀释方法配成所需的测试浓度，储存于4℃冰箱备用。以最高浓度的药液中的无水乙醇含量(0.13％)作为标准，配制含0.13％无水乙醇的对照组处理液。

(2)取100μL大约含有600个感染性幼虫的虫液于96孔板中，另外加入100μL不同浓度的药液，使最终浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L，各药物浓度设置3个平行。在4×物镜下统计4h内各浓度的幼虫全部死亡时间(min)和第4h幼虫存活数，计算死亡率和半数有效浓度(EC₅₀)。实验温度保持在23±0.5℃。计算公式如下：

死亡率(％)＝(1-实验组感染性幼虫个数/对照组感染性幼虫个数)×100％

结果显示：槐属二氢黄酮G在0.5mg/L浓度下，49.3min能够使感染性幼虫100％致死，并随着药物浓度的增加，致死时间变短。

实施例2：槐属二氢黄酮G药物对多子小瓜虫成虫的杀灭作用

(1)药液配制同实施例1。

(2)取大约含有60个成虫的200μL的虫液于24孔板中，另外加入200μL不同浓度的药液，使最终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L，每个浓度设置3个平行。在4×物镜下统计5h内各浓度的成虫全部死亡时间(min)和第5h成虫存活数,计算死亡率和半数有效浓度(EC₅₀)。实验温度保持在23±0.5℃。6h后在4×物镜下统计各浓度存活成虫形成包囊个数，再经过16h或者17h后，统计各浓度释放的感染性幼虫个数，计算各浓度平均每个包囊释放出的感染性幼虫数。计算公式如下：

死亡率(％)＝(1-实验前成虫个数/实验后成虫个数)×100％；

平均每个包囊释放出感染性幼虫数＝各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。

结果显示：4mg/L浓度下的槐属二氢黄酮G可以全部杀灭成虫，致死时间为74.0min，并随着药物浓度的增加，致死时间变短。2mg/L浓度下的槐属二氢黄酮G对成虫的死亡率为82.8％，并且17h后可以完全抑制包囊释放感染性幼虫。

实施例3：槐属二氢黄酮G对多子小瓜虫包囊的杀灭作用

(1)药液配制同实施例1。

(2)将大约含有60个成虫的200μL的虫液加入24孔板中，静置于23±0.5℃的恒温培养箱中6h，在4×物镜下统计各孔形成包囊个数。随后加入200μL不同浓度的药液，使最终浓度为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0mg/L，每个浓度设置3个平行。然后24孔板静置于23±0.5℃的恒温培养箱中22h，在4×物镜下统计各浓度释放的感染性幼虫个数，计算各浓度平均每个包囊释放出的感染性幼虫数。计算公式如下：

平均每个包囊释放出感染性幼虫数＝各孔感染性幼虫数/各孔的包囊数。

结果显示：槐属二氢黄酮G的浓度在2mg/L及以上，能够完全抑制包囊释放出感染性幼虫。随着药物浓度的降低，平均每个包囊释放的感染性幼虫个数增加。

实施例4：低浓度槐属二氢黄酮G对多子小瓜虫幼虫感染力的影响

(1)药液的配制根据实施例1的方法，配制成0.5、0.25、0.125、0.06和0mg/L的药液各50mL。

(2)取大约含有80000个感染性幼虫的10mL虫液加入50mL烧杯中，再加入10mL药液，混匀，使最终浓度为0.25、0.125、0.06、0.03和0mg/L的槐属二氢黄酮G药液，每一处理浓度设置3个平行，然后在23±0.5℃静置1h。

事先准备15个装有4L曝气自来水的水族箱，每个水族箱装有10尾健康草鱼，将被药液处理过的感染性幼虫倒入各水族箱中，让平均每尾鱼8000只感染性幼虫感染草鱼，每一处理浓度设置3个平行。感染2h后，每个水族箱曝气自来水体积加至10L，由充氧泵供氧，实验温度保持在23±0.5℃。每天观察草鱼的存活情况，如有死鱼及时捞出，以免影响水质。实验第七天，用150mg/L的麻醉剂(MS-222)(Sigma)麻醉草鱼，记录每尾草鱼体表的白点数，并统计感染率和感染强度。计算公式如下：

感染率＝(体表有白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表有白点的鱼数。

结果显示：槐属二氢黄酮G在0.25和0.125mg/L浓度下，预处理感染性幼虫1h，能够显著降低幼虫的感染能力，感染强度和感染率显著低于对照组。

实施例5：槐属二氢黄酮G药物在体杀虫、防病、治病效果

(1)称取1g的槐属二氢黄酮G，根据实施例1的方法，配制成50000、25000、12500和0mg/L的药液各20mL。

(2)选择轻度感染的草鱼(体表白点数为22.1±15.0)随机分配到12个含有20L曝气自来水的40L水族箱中，每个水族箱5尾已感染多子小瓜虫的草鱼。随后向每个水族箱中加入10尾健康草鱼混养。温度保持在23±0.5℃。随后向水族箱中加入上述配制的原药液，混匀，使最终浓度为2、1、0.5和0mg/L，每个浓度设置3个平行重复。实验期间，每天加入与第一天体积相同的原药液，并观察鱼的存活情况(如有死鱼，及时捞出，以免影响水质)以及随机3尾患病草鱼体表白点数。若无白点，所对应浓度的实验组停止用药，记录治疗时间，并用150mg/L的麻醉剂(MS-222)(Sigma)麻醉草鱼，记录每尾草鱼体表的白点数，并统计感染率、感染强度和存活率。实验第10天，全部实验组停止加药，并统计感染率、感染强度和存活率，同时更换50％无药液的新鲜曝气自来水。在第25天，记录存活草鱼体表的白点数，统计各实验组的感染率、感染强度和存活率。计算公式如下：

感染率(％)＝(体表有白点的鱼数/总鱼数)×100％；

感染强度＝体表白点总数/体表有白点的鱼数；

存活率(％)＝(实验后存活鱼数/总鱼数)×100％。

结果显示：槐属二氢黄酮G在2mg/L浓度下，能够完全预防与治疗多子小瓜虫病，实验组已感染草鱼与未感染草鱼的感染率和感染强度均为0，存活率均为100％。实验第25天，槐属二氢黄酮G在2mg/L浓度下，感染率和感染强度均为0，存活率为100％。

实施例6：槐属二氢黄酮G对鱼的急性毒性实验

(1)称取500mg的槐属二氢黄酮G，根据实施例1的方法，配制成实验所需要的浓度。

(2)预实验：槐属二氢黄酮G使草鱼24h全部致死的浓度为70mg/L，96h不发生死亡的浓度30mg/L。

选取180尾健康草鱼随机分配到事先装有10L曝气自来水的18个水族箱中，温度控制在23±0.5℃，并由充氧泵供氧。在预实验的基础上，再设置60、50、40和0mg/L，每个浓度设置3个平行，进行急性毒性实验。实验期间，随时观察各浓度组实验鱼的中毒情况，如发现草鱼中毒死亡，立即捞出，以免破坏水质，影响实验结果。记录在24、48、72、和96h各个浓度组草鱼的死亡数量。根据草鱼死亡数及死亡时间，计算24h、48h、96h半致死浓度(LC₅₀)和对草鱼的安全浓度。

结果显示：槐属二氢黄酮G对草鱼96h的半致死浓度为46.6mg/L；对草鱼的安全浓度为11.3mg/L。其安全浓度是预防与治疗有效浓度的5.6倍左右，对鱼安全。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。