苹果属植物二氢查尔酮化合物鉴定及体外活性与功能分析

摘要

二氢查尔酮类化合物是苹果属植物中含量最高且种类非常丰富的一大类次生代谢产物。二氢查尔酮类化合物不仅在果树的生长发育和抵御逆境过程中发挥着重要的生物学功能，而且具有抗氧化、抗肿瘤和降血糖等优良的生物学活性。前人的研究主要以根皮苷和根皮素两个二氢查尔酮化合物为主，对苹果属植物中其他二氢查尔酮类化合物的研究还比较匮乏。本研究从苹果属植物中分离并鉴定了多个二氢查尔酮类化合物，并分析了这些化合物在抗氧化、抗肿瘤和降血糖方面的生物学活性，及其化感生物学功能，以期为合理开发利用苹果属植物种质资源奠定基础。研究主要结果如下： 1.从苹果属植物中提取、分离和鉴定了6个二氢查尔酮类化合物，并制备了2个二氢查尔酮的苷元。通过多种色谱联用（高效液相色谱、液相半制备色谱，葡聚糖凝胶、反向柱、大孔树脂和半制备色谱）的方法从2个苹果属植物果实中获得了10个二氢查尔酮类化合物。并利用液质联用和核磁共振鉴定了6种化合物，分别是根皮苷（P2G）、三叶苷（P4G）、3-羟基根皮苷（HP2G）、3-羟基三叶苷（HP4G）、根皮素木糖葡萄糖苷（P2X）、3-羟基根皮素木糖葡萄糖苷（HP2X），进一步制备了根皮素（P）和3-羟基根皮素（HP）两个苷元，测定了这8个化合物在17种苹果属植物的叶片和幼果中的含量，发现了3个具有规模化提取分离二氢查尔酮类化合物潜力的种质资源。 2.阐明了二氢查尔酮类化合物清除自由基的机理。使用ABTS和DPPH法分别测定了化合物P、P2G、P4G、HP、HP2G和HP4G的抗氧化容量并分析了其抗氧化机理，发现，二氢查尔酮可以通过氢原子转移（HAT）、电子转移-质子转移（SET-PT）以及质子顺序丢失电子转移（SPLET）多种机理清除自由基。二氢查尔酮B环的邻二酚羟基和A环的2’,6’酚羟基是HAT机理的主要位点；2’位的酚羟基是SET-PT机理的重要位点；通过表征这些化合物的解离，发现二氢查尔酮还可以通过4’位酚羟基的解离发生SPLET反应。此外，本研究发现了一种新的抗氧化机理：二氢查尔酮分子中解离的部分可以将电子传递给被氧化的部分，从而提升整个分子的抗氧化能力，这是HP2G抗氧化能力最强的原因。 3.分析了二氢查尔酮抑制肿瘤细胞增殖的活性。用噻唑蓝法分别筛选了P2G、P4G、P2X、P、HP2G、HP4G和HP对MG-63、Hela、Hep G2、MDA-MB-231和SK-OV-3这5个肿瘤细胞系的增殖抑制活性，其中化合物P、HP2G、HP4G和HP对所有肿瘤细胞系都有抑制活性。二氢查尔酮中的2’,4’,6’-三羟基苯乙酮和3,4-邻二酚羟基是关键药效团，且后者的活性强于前者，二氢查尔酮A环的糖基化会提升3,4-邻二酚羟基药效团的活性但会降低2’,4’,6’-三羟基苯乙酮药效团的活性。 4.评估了二氢查尔酮对糖代谢关键酶的抑制作用。使用P2G、P4G、P2X、P、HP2G、HP4G和HP分别抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，结果表明，大多数苹果属二氢查尔酮对这两个酶都具有较强的抑制能力。其中，两个苷元的抑制能力最强，糖苷化会降低其活性，B环3位的酚羟基可以抵消部分糖基化导致的活性损失，4’位酚羟基比2’位酚羟基对于二氢查尔酮抑制α-葡萄糖苷酶的作用更重要，对α-淀粉酶的抑制效果则相反。 5.二氢查尔酮通过引起受体植物根尖细胞死亡而发挥化感作用。外源二氢查尔酮不会影响平邑甜茶幼苗根系生长，但可以引起拟南芥根系生长的缺陷，造成根系短小。构效关系分析表明，2’,6’-二羟基苯乙酮结构是产生这种化感作用的关键，且具有这种化学结构的二氢查尔酮导致了拟南芥根系细胞死亡相关基因的上调，引起了拟南芥根尖伸长区的细胞死亡。

目录

声明

第一章 引言

1.1苹果属植物二氢查尔酮化合物的种类

1.2苹果属二氢查尔酮的生物学活性

1.2.1抗氧化活性

1.2.2降血糖活性

1.2.3抗肿瘤活性

1.3苹果属二氢查尔酮的生物学功能

1.3.1二氢查尔酮对苹果属植物自身的功能

1.3.2苹果属二氢查尔酮的化感作用

1.4本研究的内容、目的和意义

第二章 苹果属二氢查尔酮的纯化和鉴定

2.1.1试验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3实验仪器

2.2 试验方法

2.2.1液质联用分析果实中二氢查尔酮类化合物

2.2.2二氢查尔酮类化合物的分离和纯化

2.2.3核磁共振鉴定化合物结构

2.2.4苹果属二氢查尔酮化合物苷元的制备

2.2.5苹果属种质资源二氢查尔酮含量分析

2.3结果与讨论

2.3.1二氢查尔酮的分离鉴定

2.3.2苹果属种质资源二氢查尔酮类化合物分布及利用

第三章 苹果属二氢查尔酮抗氧化活性

3.1.1试验材料与试剂

3.1.2实验仪器

3.2试验方法

3.2.1抗氧化容量的测定

3.2.2解离氢鉴定

3.2.3解离常数测定和解离分布图绘制

3.2.4数据分析

3.3结果与讨论

3.3.1苹果属二氢查尔酮的抗氧化能力

3.3.2苹果属二氢查尔酮清除自由基的机理

3.3.3苹果属二氢查尔酮的解离

3.3.4苹果属二氢查尔酮抗氧化新机理

第四章 苹果属二氢查尔酮抗肿瘤和降血糖活性

4.1.1试验材料与试剂

4.1.2实验仪器

4.2试验方法

4.2.1抑制肿瘤细胞增殖活性测定

4.2.2降血糖活性测定

4.2.3数据分析

4.3结果与讨论

4.3.1苹果属二氢查尔酮抑制肿瘤细胞增殖活性

4.3.2苹果属二氢查尔酮降血糖活性

第五章 苹果属二氢查尔酮的化感作用

5.1.1试验材料与试剂

5.1.2实验仪器

5.2试验方法

5.2.1固体培养基和霍格兰营养液的配制

5.2.2拟南芥生长条件及处理

5.2.3平邑甜茶生长条件及处理

5.2.4根系观察和形态分析

5.2.5台盼蓝染色试验

5.2.6激光共聚焦显微镜观察

5.2.7根系活力测定

5.2.8转录组分析

5.3.1二氢查尔酮对平邑甜茶根系生长的影响

5.3.2二氢查尔酮对于拟南芥根系生长的抑制作用

5.3.3二氢查尔酮对拟南芥根尖的影响

5.3.4二氢查尔酮对拟南芥根基因表达的改变

5.3.5生长素相关基因对二氢查尔酮的响应

5.3.6细胞死亡功能基因对二氢查尔酮的响应

5.3.7转录因子对于二氢查尔酮的响应

第六章 结论及创新点

6.1结论

6.2创新点

附录

参考文献

致谢

个人简历