一种富硒酿酒酵母菌株及其在制备富硒紫薯酵母产品中的应用

摘要

本发明公开了一种富硒酿酒酵母菌株及其在制备富硒紫薯酵母产品中的应用。本发明提供一种酿酒酵母IMB 016，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2016422。本发明还保护酿酒酵母IMB 016在制备产品中的应用。本发明还保护一种制备富硒酵母产品的方法和一种培养酿酒酵母IMB 016的方法。本发明提供的酿酒酵母IMB 016发酵生产富硒紫薯酵母产品的得率高、操作简便、发酵周期短。本发明对促进紫薯产业发展，具有客观的经济及社会效益。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种富硒酿酒酵母菌株及其在制备富硒紫薯酵母产品中的应用。

背景技术

“硒”是人体不可缺少的微量元素之一，被医学家誉为“月光元素”、“抗癌之王”、“长寿之星”，参与清除人体新陈代谢所产生的自由基，保护细胞和心、肝、肾、肺等器官，防止DNA损伤，延缓人体机能衰退，从而延缓衰老。

在我国，硒的缺乏是一个普遍存在的问题。对缺硒地区而言，通过食物中添加或注射无机的亚硒酸钠的方式补硒，存在吸收利用率低、安全性差、对肉质不利等缺陷，补硒食品主要是补充富含有机硒的食品，有机硒在生物利用率方面要远远优于无机硒，而且不存在无机硒的累积性毒性。

番薯是一种高产稳产的作物。紫薯是番薯新的品种，属于天然植物，又叫黑薯，富含硒元素和花青素，其色素含量比普通红薯高8倍，并已检测出由9种花色素苷(花青素)组成，营养价值明显高于普通红薯。经试验分析，紫薯具有降血压、抗衰老、抗突变、改善肝功能、防便秘、防动脉硬化、防癌、抗癌、清除自由基、抑制胆固醇、补血、益气、润肺、养颜的生理功效。现代医学研究认为，紫薯营养丰富，所含维生素B1、B2，糖和钙都高于米面，并含有9种必须氨基酸；含热量低，并含有丰富的膳食纤维及果胶，能阻止糖分转化为脂肪，对促进消化和排泄固体废物有着举足轻重的作用，是当前无公害、绿色、有机食品中首推的健康食品。

发明内容

本发明的目的是提供一种富硒酿酒酵母菌株及其在制备富硒紫薯酵母产品中的应用。

本发明提供的酿酒酵母IMB 016(Saccharomyces cerevisiae IMB 016)，已于2016年08月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC N0：M 2016422。酿酒酵母IMB 016(Saccharomycescerevisiae IMB 016)CCTCC NO：M 2016422简称为酿酒酵母IMB 016。

本发明还保护酿酒酵母IMB 016在制备产品中的应用；所述产品满足如下参数(a1)和/或(a2)：

(a1)总硒浓度为179.2mg/kg以上；

(a2)硒蛋氨酸浓度为108.7mg/kg以上。

所述总硒浓度可达910mg/kg；所述硒蛋氨酸浓度可达640mg/kg。

本发明还保护一种制备富硒酵母产品的方法，包括如下步骤：培养酿酒酵母IMB016。

所述方法中，所述培养酿酒酵母IMB 016具体为采用液体发酵培养基培养酿酒酵母IMB 016。

所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，将产物风干。

本发明还保护一种制备富硒酵母产品的方法，包括如下步骤：

(b1)将酿酒酵母IMB 016接种至种子强化培养基进行培养；

(b2)完成(b1)后，将培养物转接至液体发酵培养基进行培养。

所述步骤(b2)的培养过程为：发酵周期36h，发酵温度30℃，初始搅拌速度200rpm，初始通气量15L/min，初始压力0.8Mpa，通过控制搅拌速度与通气量控制溶氧量50-70％，自然pH值。

所述方法还包括如下步骤(b3)：完成(b2)后，去除上清液，收集产物。

步骤(b3)具体可为：完成(b2)后，采用平板式密闭离心机(200目滤网布)3000rpm、离心30min，去除上清液，收集产物。

所述方法还包括如下步骤：完成(b2)或(b3)后，将产物风干。

以上任一所述风干具体可为65℃风干至水分含量为8％(质量百分含量)。

以上任一所述富硒酵母产品满足如下参数(a1)和/或(a2)：

(a1)总硒浓度为179.2mg/kg以上；

(a2)硒蛋氨酸浓度为108.7mg/kg以上。

所述总硒浓度可达910mg/kg；所述硒蛋氨酸浓度可达640mg/kg。

本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的产品。

所述产品满足如下参数(a1)和/或(a2)：

(a1)总硒浓度为179.2mg/kg以上；

(a2)硒蛋氨酸浓度为108.7mg/kg以上。

本发明还保护所述产品的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备补硒营养食品；

(c2)制备补硒保健品。

本发明还保护酿酒酵母IMB 016的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备补硒营养食品；

(c2)制备补硒保健品。

本发明还保护一种培养酿酒酵母IMB 016的方法，包括如下步骤：将酿酒酵母IMB016接种至液体发酵培养基进行培养。

本发明还保护一种培养酿酒酵母IMB 016的方法，包括如下步骤：

(d1)将酿酒酵母IMB 016接种至种子强化培养基进行培养；

(d2)完成(d1)后，将培养物转接至液体发酵培养基进行培养。

所述步骤(d2)的培养过程为：发酵周期36h，发酵温度30℃，初始搅拌速度200rpm，初始通气量15L/min，初始压力0.8Mpa，通过控制搅拌速度与通气量控制溶氧量50-70％，自然pH值。

本发明还保护一种用于培养酿酒酵母IMB 016的试剂盒。

本发明还保护一种用于制备富硒紫薯酵母产品的试剂盒。

以上任一所述试剂盒包括液体发酵培养基。

所述试剂盒还包括种子强化培养基。

所述试剂盒还包括酿酒酵母IMB 016。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备补硒营养食品；

(c2)制备补硒保健品。

所述(b1)或(d1)中，将酿酒酵母IMB 016接种至种子强化培养基后，酿酒酵母IMB016在体系中的初始浓度为10⁸个/mL。

所述(b1)或(d1)中，完成培养后，酿酒酵母IMB 016在体系中的浓度为10¹²个/克培养物。

所述(b1)或(d1)中，培养的条件具体可为30℃培养20h。

所述(b2)或(d2)中，培养物与液体发酵培养基的配比具体可为：100g培养物：15L液体发酵培养基。

以上任一所述种子强化培养基的原料配比为：1L营养液：0.5-1.5kg小麦籽粒；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：酵母粉0.5-1.5g/100ml，蛋白胨0.5-1.5g/100ml，葡萄糖0.5-1.5g/100ml，紫薯粉8-12g/100ml，亚硒酸钠8-12mg/100ml；所述溶剂为水。

所述溶质及其在所述营养液中的浓度具体可为：酵母粉1g/100ml，蛋白胨1g/100ml，葡萄糖1g/100ml，紫薯粉10g/100ml，亚硒酸钠10mg/100ml。

以上任一所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：紫薯粉10-20g/100ml、亚硒酸钠10-50mg/100ml；

所述溶剂为水。所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：紫薯粉20g/100ml，亚硒酸钠50mg/100ml。

所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：紫薯粉10g/100ml，亚硒酸钠10mg/100ml。

所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：紫薯粉15g/100ml，亚硒酸钠25mg/100ml。

以上任一所述紫薯粉可以通过商购得到。所述商购途径具体可为厦门圣王生物科技有限公司。

以上任一所述紫薯粉还可以通过如下方式制备得到：取紫薯，洗净，65摄氏度烘干至恒重，粉碎，得到粒度为60目以下的粉末。

近年来，我国对硒的研究不论对硒的生物学功能，还是硒的生物学转化技术方面都取得了很大的发展。生物科技介入富硒酵母与紫薯营养相结合的研究，其立意就在于利用生物技术创新性的开发新的补硒营养食品或保健品，通过高效选育能够利用紫薯为唯一生长原料且具备高硒盐耐受性的安全酵母菌株，利用酵母相对成熟的深层发酵工艺及技术，实现酵母菌株在紫薯营养素环境中无机硒的转化及有机硒的生物合成，对促进紫薯产业发展，具有客观的经济及社会效益。

本发明提供的菌株发酵生产富硒紫薯酵母产品的得率高、操作简便、发酵周期短。富硒紫薯酵母产品不仅含多种有机硒成分，而且结合了紫薯的营养特性，实现酵母对紫薯营养素的多元细化，提高硒与紫薯的生物利用率，同时还避免了普通硒酵母所具有的浓厚酵母味道。满足人们的日常补硒保健的目的同时，还可以补充能够有效被机体吸收和利用的紫薯营养素，对促进紫薯产业发展，具有客观的经济及社会效益。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

酿酒酵母1016：中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号为1016。

紫薯粉：取紫薯，洗净，65摄氏度烘干至恒重，粉碎，得到粒度为60目以下的粉末。

活化斜面培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0；121℃高压蒸汽灭菌22min。

紫薯固体培养基：紫薯粉100g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌22min。

紫薯液体培养基：紫薯粉100g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌22min。

种子强化培养基：酵母粉，蛋白胨，葡萄糖，紫薯粉，亚硒酸钠和蒸馏水混合，制成营养液；1000ml营养液与1000g小麦籽粒混合均匀，隔水蒸30min，得到种子强化培养基；121℃高压灭菌25min。各溶质在营养液中的浓度如下：酵母粉1g/100ml，蛋白胨1g/100ml，葡萄糖1g/100ml，紫薯粉10g/100ml，亚硒酸钠10mg/100ml。

液体发酵培养基的制备方法：取紫薯粉，亚硒酸钠，蒸馏水定容至1000ml；121℃高压蒸汽灭菌22min。按照上述方法分别制备得到液体发酵培养基甲、液体发酵培养基乙及液体发酵培养基丙。

液体发酵培养基甲中，各溶质的浓度如下：紫薯粉20g/100ml，亚硒酸钠50mg/100ml。

液体发酵培养基乙中，各溶质的浓度如下：紫薯粉10g/100ml，亚硒酸钠10mg/100ml。

液体发酵培养基丙中，各溶质的浓度如下：紫薯粉15g/100ml，亚硒酸钠25mg/100ml。

检测硒含量的方法：参照参考文献“王莹，铁梅，康平利，等.ICP-MS等三种测定蛹虫草硒含量方法的比较[J].光谱学与光谱分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基联苯胺分光光度法。

检测硒蛋氨酸含量的方法：参照参考文献“杨文婕，张明，陈竞，等.LC-MS-MS同时定量检测硒蛋氨酸和硒胱氨酸[J].中国食品卫生杂志，2008，20(3)：204-207.”中的方法。

实施例1、酿酒酵母IMB 016的选育

一、酿酒酵母单细胞悬液的制备

1、将酿酒酵母1016接种于活化斜面培养基，30℃培养20h。

2、将步骤1的菌株转接至活化斜面培养基，30℃培养16h。

3、用10ml无菌的生理盐水将步骤2活化斜面培养基上的酵母细胞洗脱，并通过无菌滤纸过滤，过滤后将滤液转移至灭菌的带玻璃珠的装有30mL无菌生理盐水的三角瓶中，于摇床上150rpm震荡30min，镜检酵母细胞全部分散为单细胞后，用无菌生理盐水调整细胞浓度至10⁷个/mL，得到单细胞悬液。

二、低能N⁺离子注入诱变

1、将0.15ml步骤一制备的单细胞悬液均匀涂布在直径为90mm的无菌空白平皿中央，置于超净台下由无菌风进行风干。

2、将离子注入仪抽真空至10^-4Pa后，将步骤1风干的平皿放置于离子束注入仪的靶室内，设置N⁺能量20keV、N⁺剂量为50×2.6×10¹⁴cm^-2。采用间歇式脉冲注入，以消除大剂量下热效应产生负作用，即注入5s后间隔55s，再进行下一次注入，注入总时间为4min。

三、优良高效富硒的酿酒酵母菌株的筛选

1、用无菌生理盐水(1ml/皿)将步骤二完成诱变的平皿上的菌洗脱，取0.2mL洗脱液涂布于紫薯固体培养基，30℃恒温培养24h，筛选能以紫薯为唯一原料生长的酿酒酵母菌株。

2、完成步骤1后，将得到的菌落采用点值法点值于含低浓度(500μg/L)的亚硒酸钠的紫薯固体培养基平板进行30℃恒温培养，长出菌落后进一步点值于其他更高浓度的亚硒酸钠的紫薯培养基平板，采用这种梯度驯化与选择的方式获得能够在含200mg/L亚硒酸钠的酿酒酵母菌株，并将这些菌株接种含200mg/L亚硒酸钠的紫薯斜面培养基，30℃恒温培养24h，再经传代两次，获得斜面菌株。

3、用5ml无菌生理盐水将步骤2的斜面菌株洗脱下来，制备菌悬液(细胞个数为10⁸个/mL)。

4、将步骤3得到的菌悬液接种至30mL含200mg/L亚硒酸钠的紫薯液体培养基中，30℃，200r/min振荡培养16h，得到种子培养液。

5、将步骤4得到的种子液按移种量20％接种于30mL含500mg/L亚硒酸钠的紫薯液体培养基中，30℃，200r/min发酵36h。培养结束后，6000rpm离心收获细胞，60℃烘干至水分为8％(质量百分数)，测定细胞的生物量(干重)和总硒含量，最终获得能够在以紫薯为唯一原料、含500mg/L亚硒酸钠的条件下生物量最高且总硒含量、硒蛋氨酸和硒转化率都最高的酿酒酵母菌株，编号IMB 016。

硒转化率(富硒效率)＝(液体培养细胞干重中的硒含量/液体发酵培养基中总的硒含量)×100％。

四、酿酒酵母IMB 016的保藏

酿酒酵母IMB 016(Saccharomyces cerevisiae IMB 016)于2016年08月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016422。酿酒酵母IMB 016(Saccharomyces cerevisiae IMB 016)CCTCCNO：M 2016422简称为酿酒酵母IMB 016。

五、酿酒酵母IMB 016的遗传稳定性

将酿酒酵母IMB 016进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定细胞的硒含量、硒蛋氨酸和硒转化率，结果显示酿酒酵母IMB 016传代过程中硒含量、硒蛋氨酸和硒转化率均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。

实施例2、酿酒酵母IMB 016的发酵应用

一、酿酒酵母IMB 016的强化培养

1、将酿酒酵母IMB 016接种至活化斜面培养基(18×180mm试管)，30℃静置培养20h，进行菌株活化。

2、将步骤1活化的菌株转接至含200mg/L亚硒酸钠的紫薯固体培养基斜面(18×180mm试管)，30℃培养20h。

3、用20mL无菌的生理盐水将步骤2得到的紫薯固体培养基斜面上的酵母细胞洗脱(得到的洗脱液中的酵母细胞浓度为10⁸个/mL)，将洗脱液全部转接至装有100g种子强化培养基的茄子瓶中，于培养箱中30℃培养20h，得到强化酵母种子培养物(强化酵母种子培养物的细胞浓度可达到10¹²个/克培养物)。

二、酿酒酵母IMB 016的液体发酵培养

1、取100g步骤一制备的强化种子培养物接种于含有15L液体发酵培养基的30L发酵罐中进行发酵培养，得到液体发酵产物。

试验组甲采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基甲。

试验组乙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基乙。

试验组丙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基丙。

培养过程为：发酵周期36h，发酵温度30℃，初始搅拌控制200rpm，发酵罐初始通气量15L/min，罐压0.8Mpa，通过控制搅拌与通气量来控制溶氧量在50-70％，自然pH值。发酵结束时，发酵液中的还原糖浓度低于0.5g/100mL。

2、发酵结束后，将步骤2得到的发酵产物进行采用平板式密闭离心机(200目滤网布)3000rpm，离心30min，去除上清液，收集富硒紫薯酵母产物，65℃风干至水分为8％(质量百分含量)；然后对风干的富硒紫薯酵母产物进行粉碎，得到富硒紫薯酵母产品。

试验组甲得到富硒紫薯酵母产品甲。

试验组乙得到富硒紫薯酵母产品乙。

试验组丙得到富硒紫薯酵母产品丙。

检测富硒紫薯酵母产品甲、富硒紫薯酵母产品乙和富硒紫薯酵母产品丙的硒含量及硒转化率。

硒转化率(富硒效率)＝(富硒紫薯酵母产品中的硒含量/液体发酵培养基中总的硒含量)×100％。

富硒紫薯酵母产品中的硒含量＝富硒紫薯酵母产品中的硒浓度×富硒紫薯酵母产品的质量。

酿酒酵母IMB 0016菌株以紫薯粉为唯一原料发酵，每1L发酵液可获得富硒紫薯酵母产品250g，富硒紫薯酵母产品甲中硒浓度为910mg/kg，其中硒蛋氨酸含量为640mg/kg，硒蛋氨酸的含量占硒含量的70.3％；每1L液体发酵培养基中总的硒含量为228.3mg，菌株的硒转化率达99.65％。富硒紫薯酵母产品乙中硒浓度为179.2mg/kg，其中硒蛋氨酸含量为108.7mg/kg，硒蛋氨酸的含量占硒含量的60.7％；每1L液体发酵培养基中总的硒含量为45.66mg，菌株的硒转化率达98.12％。富硒紫薯酵母产品丙中硒浓度为446.5mg/kg，其中硒蛋氨酸含量为278.17mg/kg，硒蛋氨酸的含量占硒含量的62.3％；每1L液体发酵培养基中总的硒含量为114.15mg，菌株的硒转化率达97.79％。

其中，富硒紫薯酵母产品甲的硒含量最高，菌株的硒转化率最高，而且硒蛋氨酸占硒的比例也最高。

三、对照菌株培养物的制备

将出发菌株酿酒酵母1016代替酿酒酵母IMB 0016按照步骤一、二进行操作，采用试验组甲的培养基和培养条件)，收集出发菌株液体发酵产物，得到富硒紫薯酵母产品丁。检测富硒紫薯酵母产品丁的硒含量及硒转化率。

出发菌株酿酒酵母1016由于在含亚硒酸钠浓度为500mg/L的紫薯液体发酵培养基中菌株生长严重受限，每1L发酵液可获得的富硒紫薯酵母干重为180g(基本为原始添加的紫薯粉的重量)，富硒紫薯酵母产品丁中的硒含量为5.0mg/kg，硒蛋氨酸的含量为0.35mg/kg，硒蛋氨酸含量占硒含量的7％；每1L液体发酵培养基中总的硒含量为228.3mg，硒转化率为0.39％。