一株产β‑呋喃果糖苷酶节杆菌及其应用

摘要

本发明涉及一株产β‑呋喃果糖苷酶节杆菌及其应用。一株节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY‑004，2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.12855。本发明从土壤中分离出节杆菌，在经过紫外诱变、亚硝基胍诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产β‑呋喃果糖苷酶的高产菌株命名为BLCY‑004，其酶活达到1100U/ml，相对于传统β‑呋喃果糖苷酶活力提高50％以上，应用于低聚乳果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚乳果糖的能力，显著降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一株产β-呋喃果糖苷酶节杆菌产及其应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

低聚乳果糖是一种功能性低聚糖，具有促进肠道双歧杆菌增殖，调节肠道微生态，改善肠道免疫力等特殊生理功能，甜度为蔗糖的30％，甜味特性类似于蔗糖，甜味质量是各种低聚糖中最佳的，因此可以应用于食品工业中而不必担心其对产品风味产生影响。商业化生产的低聚乳果糖，由于含有蔗糖、乳糖等其他成分，因而甜度要略高一些。与其它低聚糖相比，低聚乳果糖对酸、热具有较高的稳定性，其稳定性与蔗糖相似，在中性条件下稳定，在酸性条件下相对更稳定，pH 7.0下80℃加热2h和pH 3.0下80℃加热2h，都几乎不发生分解，在pH 4.5的条件下，其加热温度甚至可达到120℃。低聚乳果糖还具有高的保湿性，能使食品保持湿润，可防止面包、点心等淀粉类食品老化，延长食品货架期。

2005年调查表明，低聚乳果糖已成为日本第三大功能性低聚糖消费品。近年来许多研究者发现低聚乳果糖具有许多特定的生理功能，有望成为继低聚乳果糖、低聚半乳糖后又一种被全球认可的功能性食品添加剂。

酶法合成是工业化生产低聚乳果糖的主要途径，酶法合成低聚乳果糖的产率低一直是制约酶法合成发展的重要难题，因此，寻找一种高酶活性的β-呋喃果糖苷酶成为解决低聚乳果糖生产瓶颈的关键。

中国专利文献CN101624582A(申请号200910115791.1)公开了一种节杆菌产β-呋喃果糖苷酶的发酵培养基和发酵方法，属生物技术工程领域，发酵培养基组成成份为：蔗糖3～7g/L，牛肉膏25～40g/L，酵母膏2～3g/L，(NH₄)₂HPO₄>2PO₄>4·7H₂O0.1～0.5g/L，余为水；先将菌种活化、培养，然后加入上述发酵培养基，初始pH值为6.0～8.0，发酵温度为25～45℃，接种量为1～4％；本发明大大优于现有技术的培养基配方，菌株生物量高、产酶量高、酶活性高。

上述技术方案从培养环境入手，得到的培养基和发酵方法可以提高酶产量，但制约酶产量和酶活的主要因素是在菌株方面，因此寻找酶产量高、酶活高的菌株，成为目前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株产β-呋喃果糖苷酶节杆菌及其应用。

本发明另一个目的是提供该节杆菌株在生产低聚乳果糖中的应用，由于该菌株所产β-呋喃果糖苷酶具有高合成低聚乳果糖的能力，可显著降低生产成本。

本发明的技术方案如下：

一株节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.12855。

本发明所述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的原始菌株分离于山东德州百龙创园生产车间附近的土壤，并经过诱变后获得。该菌株呈乳白色，半透明状，尺寸约2～4μm×1.8～3.5μm。革兰氏染色呈阳性，短杆状，单个或成对排列，培养周期中伴随着杆状、球状形态的变化。该菌株可高产β-呋喃果糖苷酶，生成低聚乳果糖的转化率可达到30％以上，转化应用于生产中可大大提高以蔗糖和乳糖为底物生成低聚乳果糖的能力，降低生产成本，有助于低聚乳果糖产品的推广。

上述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培养方法，步骤如下：

(1)取节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于固体培养基中，在28-35℃的条件下，培养24-48h，制得活化菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28～35℃的条件下，增殖培养24-48h，即得种子液；

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在28～35℃扩大培养36～60h，即得菌体发酵液。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH6.0～7.2。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH 6.0～7.2。

所述步骤(1)中的固体培养基为本领域常规固体培养基，如LB培养基等。

上述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(a)取上述制备的菌体发酵液经固液分离，洗涤菌体，合并分离液及洗涤液，制得粗酶液；

(b)将步骤(a)制得的粗酶液中加入固体氯化钠，制得0.1～0.5mol/L的混合溶液，冷藏静止2h，固液分离，取上清液，再加入固体氯化钠，使溶液达到90％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲中，制得β-呋喃果糖苷酶。

根据本发明优选的，所述步骤(a)的洗涤菌体为采用pH 7.0、浓度40mmol/L的磷酸缓冲液重悬，然后经固液分离，取液体，制得洗涤液。

根据本发明优选的，所述步骤(a)、(b)中的固液分离均为在4℃、4000r/min条件下，离心40min。

上述制备的β-呋喃果糖苷酶在制备低聚乳果糖中的应用。

有益效果

本发明从土壤中分离出节杆菌，在经过紫外诱变、亚硝基胍诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产β-呋喃果糖苷酶的高产菌株命名为BLCY-004，其酶活达到1100U/ml，相对于传统β-呋喃果糖苷酶活力提高50％以上，应用于低聚乳果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚乳果糖的能力，显著降低生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

一株节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.12855。

上述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的筛选过程如下：

(1)富集培养

选取山东德州百龙创园生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入培养基进行富集培养，培养基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH为6.5；培养温度为28-35℃，培养36h。

(2)纯种分离

采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，30℃培养36h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01-10。

将01-10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养32℃培养36h，对01-10摇瓶发酵液β-呋喃果糖苷酶酶活进行测定，04号摇瓶酶活最高，达到505U/ml。

平板培养基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，琼脂2％，pH为pH6.0-7.2。

摇瓶培养基成分：蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH 6.0-7.2。

(3)诱变筛选

对04号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为150s，最终得到高产β-呋喃果糖苷酶的高产菌株命名为BLCY-004，其酶活达到1100U/ml。

酶活定义如下：在pH 6.0，40℃以蔗糖作为底物进行反应时，每分钟使还原能力增加相当于2μmol的D-葡萄糖的量的酶量定于为1个活力单位(U)。

实施例2

实施例1所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培养方法，步骤如下：

(1)取节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于LB培养基中，在30℃的条件下，活化培养30h，制得活化菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在32℃的条件下，增殖培养36h，制得种子液；

所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH6.5。

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养35h，即得菌体发酵液；

所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH 6.5。

经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为6.5×10¹⁰cfu/ml。

实施例3

实施例1所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培养方法，步骤如下：

(1)取节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于LB培养基中，在31℃的条件下，活化培养36h，制得活化菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在32℃的条件下，增殖培养36h，制得种子液；

所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH 7.0。

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养40h，即得菌体发酵液；

所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH 6.8。

经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为6.0×10¹⁰cfu/ml。

实施例4

实施例1所述的节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培养方法，步骤如下：

(1)取节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接种于LB培养基中，在35℃的条件下，活化培养48h，制得活化菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养48h，制得种子液；

所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二铵0.6％，七水硫酸镁0.01％，pH 7.2。

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比10％的比例接种于发酵培养基中，在35℃，扩大培养48h，即得菌体发酵液；

所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸镁0.1％，磷酸氢二铵0.4％，pH 7.2。

经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为7.0×10¹⁰cfu/ml。

实施例5

节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004在制备β-呋喃果糖苷酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(a)分别取实施例2～4制备的菌体发酵液经4℃、4000r/min条件下离心40min，收集分离液，沉淀为菌体，用pH 7.0、浓度40mmol/L的磷酸缓冲液重悬，经4℃、10000r/min条件下离心40min，收集洗涤液，合并分离液及洗涤液，制得粗酶液；

(b)将步骤(a)制得的粗酶液加入固体氯化钠，制得0.1-0.5mol/L的混合溶液，冷藏静止2h，固液分离，取上清液，再加入固体氯化钠，使溶液达到90％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲中，制得β-呋喃果糖苷酶。

经检测，实施例2中每毫升发酵液能够产生6000μgβ-呋喃果糖苷酶，实施例3中每毫升发酵液能够产生5800ugβ-呋喃果糖苷酶，实施例4中每毫升发酵液能够产生6300μgβ-呋喃果糖苷酶。

将上述β-呋喃果糖苷酶配制成浓度为15000μg/ml的β-果糖基转移酶溶液，经检测，酶活达到1100U/ml；

在相同浓度条件下检测04号节杆菌原始菌株所产β-呋喃果糖苷酶，酶活为505U/ml。

由上述结果可以看出本申请所述节杆菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004菌株所产β-呋喃果糖苷酶酶活远高于原始出发菌株。