白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法

摘要

本发明公开了白及中六种成分在Caco‑2细胞模型中吸收转运量的测定方法，包括以下步骤：制备白及提取物溶液、作为对照品的标准溶液和内标溶液；建立人源结肠腺癌细胞系Caco‑2细胞模型；通过Caco‑2细胞模型制备出细胞悬液；通过UPLC‑MS/MS测定6种成分的含量；按考马斯亮蓝染液蛋白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。本发明采用UPLC‑MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P‑gh抑制剂条件下对Caco‑2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，尤其是涉及白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法。

背景技术

在口服药物吸收特性的体外研究中，人结肠腺癌细胞系(Caco-2细胞系)已成为经典的细胞模型。Caco-2 单层细胞模型在体外培养一段时间后，能分化出与肠上皮细胞相似功能的微绒毛结构，含有小肠上皮细胞刷状缘相关酶系。可自发形成分化的上皮和紧密连接组织，其细胞形态，特异性的标记酶和渗透特性都与小肠上皮细胞类似，并且重现性好，与药物体内吸收具有良好的相关性，因此Caco-2细胞模型已广泛用于体外快速评价口服药物的肠吸收特性^[2,3]。

白及为兰科植物白及[ Bletilla>]的干燥块茎，又名甘根、白根、白芨、地螺丝等，主产于西南地区。白及最早收载于《神农本草经》，其正品收载于2010年版《中国药典》，具收敛、止血、清热利湿、消肿生肌之功效，用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂、溃疡出血等症。国内外大量研究表明，白及属植物化学成分具有多种类型，包括联苄类、二氢菲类、菲类、联菲类、醌类衍生物等。其提取物中成分包括α-异丁基苹果酸(a-Isobutylmalic acid)、4-(葡糖糖氧基)-肉桂酸葡萄糖氧基苄酯(Blestroside)、1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(Militarine)、4-(葡萄糖氧)苄基-2-异丁基苹果酸酯(Gymnoside)、二氢菲1(Dihydrophenanthrene1)和1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯-2-[4-O-肉桂酰基-6-O-乙酰基]葡萄糖苷(Gymnoside Ⅸ)，便于区分，本实验将各成分分别依次命名为B1、B2、B3、B4、B5和B6。

目前，关于白及提取物吸收特性尚未有报道。本实验采用UPLC-MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P-gh抑制剂条件下对Caco-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P-gh抑制剂条件下对Caco-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

本发明的白及中六种成分在Caco-2细胞模型中吸收转运量的测定方法包括以下步骤：

步骤1：制备白及提取物溶液；

步骤2：用α-Isobutylmalic acid(B1)、Blestroside(B2)、Militarine(B3)、Gymnoside(B4)、Dihydrophenanthrene 1(B5)以及Gymnoside Ⅸ(B6)制备作为对照品的标准溶液；

步骤3：以葛根素配制内标溶液；

步骤4：建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型；

步骤5：将步骤1得到的白及提取物溶液加入Caco-2细胞模型在培养箱中培养，取出培养板吸走细胞表层的提取物以终止反应，用PBS溶液清洗两遍，加入细胞裂解液反复冻融以裂解细胞，超声处理后分别得到含有白及提取物溶液的细胞悬液；

步骤6：取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液加入内标溶液，用乙腈沉淀蛋白，涡混，离心处理，通过UPLC-MS/MS测定上清液中6种成分的含量；

步骤7：取步骤5得到的含有白及提取物溶液的细胞悬液细胞悬液按考马斯亮蓝染液蛋白测定试剂盒方法测定总蛋白含量，并计算细胞摄取量X=待测物总蛋白。

步骤1中白及提取物溶液的制备方法如下：精密称取白及提取物200mg加入PBS缓冲盐溶液定容至10ml，得20mg/ml的储备液，4℃下储存，临用前用PBS缓冲溶液稀释至所需浓度。

步骤2中作为对照品的标准溶液和步骤3中的内标溶液的制备方法如下：精密称取白及提取物中各待测成分B1、B2、B3、B4、B5和B6以及葛根素(IS)各10mg，分别用甲醇定容至10ml，作为储备液，于4℃下储存。

步骤4建立人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型中Caco-2细胞培养方法如下：Caco-2 细胞株经复苏后，用10%-DMEM培养液接种于T-25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂和相对湿度90%的培养箱中培养，待细胞贴壁后更换培养液以洗去死细胞，之后隔一天更换一次培养液，连续培养4~5天后于倒置显微镜下观察待细胞融合率约80%左右，吸去细胞表面的培养液，用37℃预热的0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，以1:3的比例进行传代培养。其中，10%-DMEM培养液中包括10%胎牛血清、1%双抗含青霉素100U·mL^-1和链霉素100μg·mL^-1、89%1640培养基。

步骤6中UPLC-MS/MS测定时的液相条件如下：色谱柱：Waters BEH C_{18>(2.1 mm×50 mm, 1.7 µm) 柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C18>-1；柱温：45℃；流动相：0.1>}

步骤6中UPLC-MS/MS测定时的质谱条件如下：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电压：3 kV；离子源温度：120 ℃；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气：N₂，流速650>-1；反吹气：N₂，流速：50>-1；碰撞气：Ar，流速：0.16>-1；质谱数据采集及处理软件为MassLynx>

本发明利用Caco-2细胞单层细胞模型研究白及提取物的吸收摄取特性，方法是采用UPLC-MS/MS考察白及提取物在不同提取物浓度、时间、温度、pH和P-糖蛋白抑制剂条件下对Caco-2细胞的吸收影响。本发明的方法结果表明白及提取物在Caco-2细胞中的吸收具有浓度和时间依赖性，其中B1和B5在摄取60min后趋于饱和；B6在25℃条件下吸收最好，其他成分均在37℃条件下吸收最好；酸性环境下有利于白及提取物的吸收；加入P-糖蛋白抑制剂维拉帕米和环孢菌素A后发现，B5的摄取量显著性增加。可知白及提取物在Caco-2细胞中的吸收机制可能为被动转运，酸性环境有利于各成分的吸收，且P-糖蛋白可能参与了B5的摄取过程。

本发明采用UPLC-MS/MS建立白及提取物中6个成分的分析方法，测定白及提取物在时间、浓度、温度、pH和P-gh抑制剂条件下对Caco-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的体内吸收特性。为白及提取物的口服制剂研发提供科学依据。

附图说明

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

1实验仪材

1.1 仪器 超高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国 Waters 公司)；CO₂培养箱(Thermo>

1.2 试剂与试药 α-Isobutylmalic acid(B1)、Blestroside(B2)、Militarine(B3)、Gymnoside(B4)、Dihydrophenanthrene 1(B5)以及Gymnoside Ⅸ(B6)皆为实验室前期分离(批号 20150305)；PSS缓冲溶液(Solarbio)；胎牛血清(Gibco)；DMEM 培养基(高糖，Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；双抗(Hyclone)；考马斯亮蓝染液(南京建成生物工程研究所)；DMSO、甲醇、乙腈均为色谱纯；实验用水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞株 Caco-2 细胞株(上海中科院)，细胞传代数在50代以内。

2 方法与结果

2.1 提取物溶液的配制

精密称取白及提取物200mg加入PBS缓冲盐溶液(pH7.4，0.1M)定容至10ml，得20mg/ml的储备液，4℃下储存，临用前用PBS缓冲溶液稀释至所需浓度。

2.2 标准溶液的配制

精密称取白及提取物中各待测成分B1、B2、B3、B4、B5和B6以及葛根素(IS)各10mg，分别用甲醇定容至10ml，作为储备液，于4℃下储存。

2.3 细胞的培养

Caco-2 细胞株经复苏后，用10%-DMEM培养液(10%胎牛血清、1%双抗含青霉素100U·mL^-1和链霉素100μg·mL^-1、89%1640培养基)接种于T-25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂和相对湿度90%的培养箱中培养，待细胞贴壁后(大约8h)更换培养液以洗去死细胞，之后隔一天更换一次培养液，连续培养4~5天后于倒置显微镜下观察待细胞融合率约80%左右，吸去细胞表面的培养液，用37℃预热的0.25%胰蛋白酶消化液进行消化，以1:3的比例进行传代培养。

2.4 白及提取物安全浓度范围考察

选取传代数在50代以内且处于对数生长期的Caco-2细胞，以密度为1.5~2×10⁵个/mL种植于96孔培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。次日吸去培养液，实验组分别加入100μL不同浓度的白及提取物溶液(用PBS缓冲盐溶液分别稀释至0.1、0.5、2.5、5、15>-1)，空白组加入100μL PBS缓冲盐溶液，每个浓度设置6个复孔，分别作用Caco-2细胞4 h后每孔加入100 μL MTT溶液(用PBS缓冲盐溶液配制成0.25>-1)，继续培养4 h，吸去上清液，每孔加入100 μL DMSO溶解结晶，于490nm波长处检测每孔吸光度OD值。计算细胞存活率(药物组OD值/对照组OD值*100)，与空白组比较并分析白及提取物的安全浓度范围。结果如图1所示：当白及提取物>2.5>-1，对Caco-2细胞的毒性作用逐渐增大，因此，选择2.0>-1的白及提取物进行后续试验考察。

2.5 Caco-2细胞的吸收特性方法

选取传代数在50代以内且处于对数生长期的Caco-2细胞，以密度为7×10⁵个/mL种植于6孔培养板中，每孔500>2培养箱中培养21天，前3天隔一天更换一次培养液，之后每天更换一次。于第22天，吸去细胞表层的培养液，用37℃预热的PBS缓冲盐溶液在培养箱中预培养30>-1)，用400μL乙腈沉淀蛋白，涡混，15000>

2.6 UPLC-MS/MS分析条件

2.6.1 液相条件：色谱柱：Waters BEH C_{18>(2.1 mm×50 mm, 1.7 µm) 柱；保护柱：Waters Van Guard BEH C18>-1；柱温：45℃；流动相：0.1>}

2.6.2 质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；毛细管电压：3 kV；离子源温度：120 ℃；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气：N₂，流速650>-1；反吹气：N₂，流速：50>-1；碰撞气：Ar，流速：0.16>-1；质谱数据采集及处理软件为MassLynx>

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性 将空白细胞混悬液A、混合对照品溶液B和细胞样品C在建立的色谱条件下进样分析，对比图A、B和C分析专属性。结果如图2所示：各成分的分离度良好，B1、B2、B3、B4、B5、B6以及葛根素(IS)保留时间分别为：1.55，1.49，1.81，1.70，2.98，3.11和1.30。且细胞悬液基质背景对成分的测定无干扰。

2.7.2 线性和检测线 取250μL空白细胞混悬液，分别加入50μL已配制成一系列不同浓度的混合标准溶液，以及50μL内标溶液，涡混均匀后，用400μL乙腈沉淀蛋白，其余操作按“2.5”项下处理并进样分析。以待测物的峰面积与内标峰面积之比(A/Ai)为纵坐标Y，各物质浓度(C)为横坐标x拟合线性方程，结果如表1所示：成分B1、B2、B3、B4、B5和B6的线性关系良好；检测线可满足白及提取物后续实验中对细胞样品的检测要求。

2.7.3 准确度与精密度 按“2.7.2”项下分别配制低、中、高3个浓度的细胞悬液质控(QC)样品，每个浓度平行操作5次，连续测定3天，代入随行标准曲线中分别计算各物质的浓度，结果表明该分析方法的准确度为89.73%~102.68%，日间RSD%为0.86%~9.39%，日内RSD%为1.02%~4.51%。

2.7.4 回收率 按“2.7.2”项下分别配制低、中、高3个浓度的细胞悬液质控(QC)样品，以及用初始流动相配制成对应浓度的混合标准溶液，分别重复进样3次，代入随行标准曲线中分别计算各物质的浓度，以细胞样品和标准溶液的比值计算各成分的提取回收率，结果显示成分的提取回收率均大于81%。

2.7.5 稳定性 用空白细胞混悬液按“2.7.2”下配制成中浓度的细胞悬液质控(QC)样品，室温放置，分别在1、3、5 d进样分析，代入随行标准曲线中分别计算各物质的浓度，其日间RSD%分别为0.47%、0.59%、0.73%、0.66%、0.82%和0.43%。

2.9 Caco-2 细胞吸收特性考察内容：

2.9.1 时间依赖性试验

将白及提取物(2.0>-1)于Caco-2细胞中分别培养15、30、60、90、120、180min，其余同“2.5”项下操作，测定细胞悬液中各成分含量，计算细胞摄取量并采用GraphPad>

2.9.2 浓度依赖性试验

用PBS溶液将白及提取物稀释至不同浓度(0.1、0.5、1、2.0、2.5>-1)于Caco-2细胞中培养60min，其余同“2.5”项下操作，考察不同浓度的提取物对Caco-2细胞吸收摄取的影响。结果如图4所示：提取物浓度在0.1~2.5>-1范围内，各成分在Caco-2细胞的摄取量随浓度的增加呈线性增加，其回归相关系数R²均大于0.900，说明以上6种成分在Caco-2细胞中的吸收摄取特性均表现出浓度依赖性，结合安全浓度范围，选择2.0>-1作为后续试验中提取物浓度。

2.7.3 pH依赖性试验

将白及提取物(2.0>-1)溶于不同pH环境的PBS缓冲溶液(pH>

2.7.4 温度依赖性试验

将白及提取物(2.0>-1，pH6.0)于Caco-2细胞中分别在不同温度(4、25、37℃)下培养60min，其余同“2.5”项下操作，考察不同温度对细胞吸收摄取的影响。结果如图6所示：>

2.7.5 P-gh抑制剂对 Caco-2 细胞吸收摄取的影响

基于以上考察，用pH6.0的PBS缓冲溶液分别配制对照组白及提取物(2.0>-1)，实验组含维拉帕米(50>-1)的同浓度白及提取物溶液、含环孢菌素A(10>-1)的同浓度白及提取物溶液，于37℃、5%CO₂培养箱中共同培养60>P<0.05），其余成分的细胞摄取量较对照组无显著性差异（P>0.05），说明白及提取物中B5在Caco-2细胞中的吸收受P-gp的影响。

3 小结与讨论

本实验采用Caco-2单层细胞模型，通过UPLC-MS/MS测定白及提取物中6个成分在不同时间、浓度、pH、温度和P-gp抑制剂条件下对Caco-2细胞的吸收摄取影响，初步评价白及提取物的吸收摄取特性。本实验发现：白及提取物在0.1~2.5>-1范围内吸收摄取受时间、浓度、pH的影响，Caco-2>P<0.05)，说明B5可能是P-gp的底物，B5为二氢菲类化合物，疏水性较强，其肠道吸收易受P-糖蛋白的影响。因此需通过体内实验(肠灌流、肠外翻)进一步研究白及提取物的口服吸收机制，以期为白及提取物口服制剂的开发研究提供依据。

当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。